مقالة منهجية

استخدام C. ايليجانس لمراقبة اختلالات البروتيوستاس

1.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64643

⸱

أغسطس 24, 2022

 , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Anatomy II, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-University of Munich

في هذه المقالة

الملخص

شبكة البروتين هي نظام مراقبة جودة البروتين الخلوي الذي يضمن وظائف البروتين ، وتعزيز صحة الخلايا والكائنات الحيية. مع تقدم العمر ، تنخفض دقة البروتيوم ، مما يؤدي إلى زيادة تعرض البروتين للإجهاد وفي النهاية لأمراض مثل الاضطرابات التنكسية العصبية والسرطان. لتسليط الضوء على البحث حول هذه الشبكة المحفوظة تطوريا ، تقدم مجلة التجارب المرئية (JoVE) مجموعة من الأساليب من الباحثين الذين يستخدمون C. ايليجانس لمراقبة اختلالات البروتين. تقدم هذه الافتتاحية لمحة موجزة عن هذه الأساليب التجريبية المختلفة لفهم شبكة البروتين على المستويات الخلوية والأنسجة والكائنات الحية.

المقالات التي تمت مناقشتها:

جولدن ، إن إل ، بلاجينز ، آر إن ، كيم جيسبرت ، ك. س. ، جيسبرت ، إي طرق موحدة لقياس تحريض استجابة الصدمة الحرارية في Caenorhabditis elegans. مجلة التجارب المرئية. (161) ، دوي: 10.3791 / 61030 (2020).

Chauve, L. et al. RT-PCR الكمي عالي الإنتاجية في عينات C. elegans المفردة والسائبة باستخدام تقنية الموائع النانوية. مجلة التجارب المرئية. (159) ، دوي: 10.3791 / 61132 (2020).

Bar-Ziv, R. et al. قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans. مجلة التجارب المرئية. (159) ، دوي: 10.3791 / 61001 (2020).

Okkenhaug ، H. ، Chauve ، L. ، Masoudzadeh ، F. ، Okkenhaug ، L. ، Casanueva ، O. Worm-align و Worm_CP ، وهما خطان أنابيب مفتوحان المصدر لاستقامة وقياس بيانات صورة التألق التي تم الحصول عليها من Caenorhabditis elegans. مجلة التجارب المرئية. (159) ، دوي: 10.3791 / 61136 (2020).

لازارو بينا ، إم آي ، كورنويل ، إيه بي ، سامويلسون ، أ. ف. تحديد الانخفاض الكمي للبروتين الساكن للأنسجة في Caenorhabditis elegans. مجلة التجارب المرئية. (175) ، دوي: 10.3791 / 61100 (2021).

درور ، س. ، ميدان ، تي دي ، كارادي ، آي ، بن تسفي ، أ. استخدام Caenorhabditis elegans للكشف عن تفاعلات المرافق الخاصة بالأنسجة. مجلة التجارب المرئية. (160) ، دوي: 10.3791 / 61140 (2020).

مايلز ، ج. ، فان أوستن هاول ، ب. أدوات RNAi الخاصة بالأنسجة لتحديد مكونات إشارات الإجهاد الجهازي. مجلة التجارب المرئية. (159) ، دوي: 10.3791 / 61357 (2020).

بيجازيني ، إم إل ، كيرشتاين ، ج. في الجسم الحي القياس الكمي لمعدل دوران البروتين في الشيخوخة C. ايليجانس باستخدام dendra القابل للتحويل الضوئي2. مجلة التجارب المرئية. (160) ، دوي: 10.3791 / 61196 (2020).

Pigazzini، M.L.، Gallrein، C.، Iburg، M.، Kaminski Schierle، G.، Kirstein، J. توصيف هياكل الأميلويد في شيخوخة C. ايليجانس باستخدام التصوير الفلوري مدى الحياة. مجلة التجارب المرئية. (157) ، دوي: 10.3791 / 61004 (2020).

Rudich، P.، Snoznik، C.، Puleo، N.، Lamitina، T. قياس سمية ببتيد RAN في C. ايليجانس. مجلة التجارب المرئية. (158) ، دوي: 10.3791 / 61024 (2020).

أرنولد ، إم إل ، كوبر ، جيه ، جرانت ، بي دي ، دريسكول ، إم الأساليب الكمية للتسجيل في الجسم الحي الركام العصبي وبثق العضية في حويصلات إكسوفر كبيرة في C. ايليجانس. مجلة التجارب المرئية. (163) ، دوي: 10.3791 / 61368 (2020).

افتتاحية

توازن البروتين ، أو البروتين ، أساسي للصحة الخلوية والجسم1،2. تتعاون العمليات الخلوية المحفوظة للحفاظ على بروتين مطوي بشكل صحيح من خلال التأثير على تخليق البروتين والطي والتصفية3،4. تم ربط الاضطرابات في داء البروتين بالأمراض التنكسية العصبية المرتبطة بالعمروالسرطانات 5،6. بناء على المستوى العالي من الحفظ ، كانت الكائنات الحية النموذجية مثل الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans (C. ايليجانس) مفيدة في فهم دور البروتين في صحة الإنسان والمرض7،8. C. ايليجانس تمتلك العديد من الخصائص التي تجعله نموذجا تجريبيا مثاليا ، بما في ذلك دورة حياته القصيرة ، وبشرته الشفافة ، وسهولة التلاعب الكيميائي والجيني9. توفر مجموعة الطرق هذه بروتوكولات مفصلة لمراقبة اختلالات البروتين على المستوى الجزيئي والخلوي والكائني الحي في C. ايليجانس.

تستجيب الخلايا للاضطرابات في البروتين عن طريق تنشيط مجموعة متنوعة من استجابات الإجهاد ، بما في ذلك استجابة الصدمة الحرارية (HSR) ، واستجابة البروتين غير المطوية (UPR) ، واستجابة الإجهاد التأكسدي (OxSR) لإعادة ضبط البروتين الخلوي10. لتعزيز قابلية التكاثر في هذا المجال ، تم وصف الممارسات الموحدة للتحريض القوي ل HSR من قبل جولدن وزملاؤه11. RT-qPCR هي طريقة حساسة ومستخدمة على نطاق واسع لتحليل التعبير الجيني عن طريق تحديد mRNA ، ويمكن استخدام هذا الاختبار لقياس مستويات mRNA الخلوية لمختلف الجينات التي تحفز الصدمة الحرارية11. لتوسيع هذا النهج ليشمل التحليل على نطاق واسع وعالي الإنتاجية ، يصف Chauve et al.12 تكيفا جديدا لتحضير (كدنا) ، إلى جانب منصة RT-qPCR النانوية القوية والحساسة للغاية. يمكن إجراء قياسات دقيقة للتعبير الجيني على الديدان المفردة أو العينات السائبة12. يتم سرد أهداف جينات الاستجابة للإجهاد الموصى بها جنبا إلى جنب مع أزواج التمهيدي لقياس التنظيم النسخي لجينات استجابة الإجهاد في البروتوكولات المقابلة12،13.

أحد قيود استخدام RT-qPCR لتقييم تنشيط استجابات الإجهاد هو أنه يمكن أن يكون مكلفا وصعب تقنيا ويتطلب استخدام معدات متخصصة. لذلك ، يتم استخدام سلالات المراسل النسخي الخاصة بالمسار التي تعبر عن بروتين فلوري تحت محفز للإجهاد (على سبيل المثال ، hsp-16.2p :: gfp لمراقبة HSR) بشكل متكرر لتقييم استجابات الإجهاد الخلوي11. باستخدام سير عمل بسيط مفتوح المصدر قائم على فيجي يسمى Worm-align إلى جانب Worm_CP خط أنابيب CellProfiler ، يحدد Okkenhaugوزملاؤه 14 خطوة لتحديد التألق بسرعة من الديدان الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، يصف Bar-Ziv et al.13 طريقة عالية الإنتاجية باستخدام مقياس تدفق خلوي للجسيمات الكبيرة يتيح التقاط شدة التألق والحجم والتوزيع المكاني (2D) لآلاف. يتم توفير معلومات حول المراسلين النسخيين لتقييم تنشيط استجابات الإجهاد الخلوي جنبا إلى جنب مع الإعدادات الموصى بها للفحص المجهري الفلوري والقياس الكمي باستخدام الفرز الحيوي للدودة13. الأهم من ذلك ، يمكن إقران هؤلاء المراسلين بفحوصات فسيولوجية محددة للبقاء على قيد الحياة للإجهاد تراقب صحة باتباع نظام إجهاد محدد11،13. على الرغم من أن مراسلي الفلورسنت يتمتعون بميزة الكشف عن الاختلافات الخاصة بالأنسجة ، إلا أنهم لا يستطيعون إلا اكتشاف الحث فوق عتبة معينة واستقرار بعض الفلوروفورات ، مثل GFP ، يمنع اكتشاف الاختلافات الديناميكية في التعبير الجيني. علاوة على ذلك ، فإن معظم المقايسات الفسيولوجية تستغرق وقتا طويلا وبالتالي لها قابلية توسع محدودة. على الرغم من هذه القيود ، تسمح هذه الطرق بالتوصيف الشامل للتأثيرات الخلوية والفسيولوجية للضغوطات الداخلية والخارجية.

ترتبط الاضطرابات السامة للبروتين المزمنة بانهيار شبكة البروتين (PN) ، وهي آلية مراقبة الجودة المسؤولة عن الحفاظ على البروتين الوظيفي5،6. ويتورط الانخفاض التدريجي في داء البروتين في العديد من الأمراض المرتبطة بالعمر. C. elegans هو نظام نموذجي رائع لفحص قابلية أنسجة معينة لفشل البروتين. يصف Lazaro-Pena et al.15 نهجا لمراقبة جدار الجسم أو العضلات أو وظائف الخلايا العصبية مع تقدم الدودة في العمر. يمكن تكييف هذا النهج للتحليل الجيني عالي الإنتاجية أو فحص الأدوية15. يتمثل التحدي الرئيسي في فهم كيفية عمل التفاعلات بين المكونات المختلفة ل PN في الجسم الحي. لمعالجة هذا العيب ، طور درور وزملاؤه16 نظاما لجمع معلومات محددة حول تفاعلات المرافقين الجزيئيين ، المكونات الرئيسية ل PN ، في أنسجة معينة أثناء التطور والشيخوخة. من خلال اقتران الاضطرابات الخاصة بالأنسجة لتوازن الطي مع الطفرات المتاحة أو السلالات المعدلة وراثيا التي تتيح إسكات الأنسجة الخاصة بالجينات المستهدفة بواسطة RNAi ، يمكن فحص شبكة المرافق في نسيج معين. يمكن أن يؤدي استكمال هذه الإستراتيجية بفحوصات سلوكية بسيطة تقيم وظائف أنسجة أو أنواع خلايا معينة إلى الكشف عن التفاعلات ذات الصلة بيولوجيا ل PN في الجسم الحي15،16. من المهم أن ندرك أن اختلالات التوازن البروتيني في نوع واحد من الأنسجة أو الخلايا قد تؤثر على نظام مراقبة الجودة للأنسجة الإضافية بطريقة خلية غير مستقلة. يصف مايلز وفان أوستن هاول17 نهجا لتحديد آليات ومكونات PN الخلوي غير المستقل باستخدام مناهج RNAi الخاصة بالأنسجة إلى جانب مجموعة من مراسلي الإجهاد وأجهزة استشعار البروتين17. تسمح هذه الإستراتيجية بفحص قدرة PN في الأنسجة المختلفة نتيجة لآليات استجابة الإجهاد غير اللاإرادي للخلية.

C. ايليجانس يستخدم بشكل شائع لنمذجة الأمراض التنكسية العصبية المرتبطة بالعمر التي تسببها طفرات التمدد المتكررة للبولي جلوتامين ، مثل مرض هنتنغتون18. مستشعر البروتين المستخدم بكثافة هو جزء بولي جلوتامين (polyQ) مدمج مع بروتين فلوري يشكل بؤر في الجسم الحي اعتمادا على طول polyQ وعمر19. يتطلب تحسين قابلية التكاثر عبر التجارب البيولوجية ، وبين الأفراد ، وبين المختبرات ، تحديد ما يتم تسجيله كبؤر. يصف Lazaro-Pena et al.15 استراتيجية لقياس تكوين بؤر polyQ :: YFP بدقة داخل الخلايا العصبية أو عضلات جدار الجسم أثناء الشيخوخة. لمراقبة معدلات دوران بروتين هنتنغتين المتحور المعرض للتراكم الذي يحمل تمدد بولي جلوتامين ، يصف Pigazzini و Kirstein20 تقنية غير جراحية تتطلب استخدام الفلوروفور القابل للتحويل الضوئي Dendra2. باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر و C. سلالة ايليجانس التي تعبر عن هنتنغتين المتحور المنصهر في Dendra2 ، من الممكن مراقبة وقياس تدهور هذا البروتين المعرض للتراكم في كائن حي متقدم في السن20. لتحديد التجميل الأميلويد للبروتينات المعرضة للتراكم مثل هنتنغتين المتحولة ، يمكن استخدام الفحص المجهري للتصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM)21. يتيح FLIM التحليل غير الجراحي لعملية التجميع من خلال مراقبة تبريد الفلوروفورات بالقرب من هياكل الأميلويد ، وبالتالي تقليل عمر التألق21. يرتبط عمر التألق سلبا بتجميع بروتين الأميلويد المنصهر وهو مستقل عن مستويات التعبير عن الفلوروفور. تسمح هذه التقنية للباحث بمتابعة آثار الشيخوخة وضعف PN على ميل التجميع لأي بروتين. ومع ذلك ، إذا كانت شدة الفلوروفور منخفضة ، فقد يصبح هذا مشكلة لأن FLIM يتطلب اكتساب عدد كبير نسبيا من الفوتونات. لذلك هناك حاجة إلى طاقة ليزر إثارة أعلى ، مما يؤدي إلى تبييض ضوئي أسرع ومنحنى اضمحلال غير موثوق. علاوة على ذلك ، تتطلب هذه التقنية معدات متطورة ومكلفة كإضافة لأنظمة الفحص المجهري الموجودة مسبقا. يتم تضمين نهج موحد مهم لبروتوكول مختلف يحقق في الترجمة غير المعتمدة على AUG (RAN) المرتبطة بالتكرار المرتبطة بالحمض النووي الريبي التي تحتوي على توسعات متكررة. نظرا لأن ترجمة RAN لا تتطلب كودون بداية لتحديد إطار القراءة ، فإن عدد الببتيدات السامة المحتملة المرتبطة بالأمراض يزداد. يقدم روديتش وزملاؤه22 تفاصيل حول كيفية تحديد سمية ببتيد RAN باستخدام C. ايليجانس الحركة والتكاثر.

تؤدي الاختلالات في البروتين إلى اختلال طي البروتين وتراكم مجاميع البروتين التي تم ربطها بأمراض تنكسية عصبية متعددة مرتبطة بالعمر5،6. C. ايليجانس سلالات تعبر عن بروتينات مختلفة معرضة للتراكم مدمجة في مراسلي الفلورسنت لمراقبة اختلالات التوازن البروتيني عبر أنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة. أدى تحليل هذه النماذج إلى مجموعة من الملاحظات الجديدة. لاحظت مونيكا دريسكول وزملاؤها أن الخلايا العصبية تطلق مجاميع PolyQ وغيرها من الحطام الخلوي ، مثل العضيات التالفة ، في "exophers" ، مما يكشف عن فرع غير معروف سابقا من البروتيناتالعصبية 23. نظرا لأن هذه ظاهرة جديدة ، فمن الأهمية بمكان تقديم تعليمات واضحة لمراقبة إنتاج الطارد لضمان قابلية التكاثر داخل الحقل. أرنولد وآخرون 24 يحدد السمات الفيزيائية ل C. ايليجانس exophers ، واستراتيجيات اكتشافها ، ومعايير تحديد الهوية ، والتوقيت الأمثل للقياس الكمي. علاوة على ذلك ، يسلط هذا البروتوكول الضوء على الاهتمام الحاسم المطلوب للتحكم الصارم في ظروف النمو للتخلص من الضغوط غير المقصودة التي يمكن أن تعدل مستويات الexopher لتحقيق تقييم قابل للتكرار لإنتاج exopher.

توفر هذه المجموعة استراتيجيات منهجية متعددة لمراقبة اختلالات التوازن البروتيني على المستوى الجزيئي والخلوي والكائن الحي في C. ايليجانس. يمكن إدخال الضغوطات ، مثل بروتينات المرض غير المطوية ، تجريبيا في أنواع معينة من الأنسجة ، بينما تتم مراقبة الاستجابة الخلوية والكائنية للسمية البروتينية بمرور الوقت. توفر هذه المجموعة مجموعة أدوات لاستكشاف ومراقبة البروتين ، وتقييم أنظمة مراقبة الجودة التي تحافظ على بروتين مطوي ، والتحقيق في اختلال تنظيم هذه الأنظمة التي تؤدي إلى المرض.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر زملائنا على مساهماتهم القيمة للغاية في مجموعة الأساليب هذه.

المراجع

  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  2. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475 (7356), 324-332 (2011).
  3. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (11), 777-788 (2010).
  4. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659(2014).
  5. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  6. Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), 004440(2011).
  7. Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Model Mechanism. 13 (10), (2020).
  8. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  9. Girard, L. R., et al. WormBook: the online review of Caenorhabditis elegans biology. Nucleic Acids Research. 35, 472-475 (2007).
  10. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cellular stress response pathways and ageing: intricate molecular relationships. The EMBO Journal. 30 (13), 2520-2531 (2011).
  11. Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (161), e61030(2020).
  12. Chauve, L. High-throughput quantitative RT-PCR in single and bulk C. elegans samples using nanofluidic technology. Journal of Visualized Experiments. (159), e61132(2020).
  13. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61001(2020).
  14. Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align and Worm_CP, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61136(2020).
  15. Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (175), e61100(2021).
  16. Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions. Journal of Visualized Experiments. (160), e61140(2020).
  17. Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Tissue-specific RNAi tools to identify components for systemic stress signaling. Journal of Visualized Experiments. (159), e61357(2020).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods Enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  20. Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In vivo quantification of protein turnover in aging C. elegans using photoconvertible dendra2. Journal of Visualized Experiments. (160), e61196(2020).
  21. Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Characterization of amyloid structures in aging C. elegans using fluorescence lifetime imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), e61004(2020).
  22. Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e61024(2020).
  23. Melentijevic, I., et al. C. elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367-371 (2017).
  24. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

Proteostasis NetworkProtein Quality ControlNeurodegenerative DisordersCellular HealthHeat Shock ResponsePhysiological Stress ResponsesTissue-specific ProteostasisRNAi ToolsProtein TurnoverPhotoconvertible Dendra2Experimental Approaches
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.