مقالة منهجية

طرق دراسة هشاشة العظام والتمثيل الغذائي

DOI:

10.3791/64649

⸱

أغسطس 12, 2022

 , 
1Department of Medicine, Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Internal Medicine, Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقالات التي تمت مناقشتها:

شين ، إل ، كارنر ، سي إم تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في خلايا العظام المزروعة وأعمدة العظام المعزولة. مجلة التجارب المرئية. (182) ، e62995 (2022).

جايابالان ، س. ، ناندي ، أ. ، رندينا-رويدي ، إي. استخدام محاذ التدفق الأيضي للخلية في الوقت الحقيقي لمراقبة الطاقة الحيوية لبانيات العظم. مجلة التجارب المرئية. (181) ، e63142 (2022).

سونغ, C., فاليري, A., طويلة, F. تقييم أكسدة الركيزة الطاقة في المختبر مع 14ثاني أكسيد الكربون2 الاصطياد. مجلة التجارب المرئية. (181) ، e63568 (2022).

كيم ، إس بي ، لي ، ز. ، ريدل ، آر سي تقييم أكسدة الأحماض الدهنية في خلايا العظام المستنبتة. مجلة التجارب المرئية. (182) ، e63638 (2022).

قوة, W., وو, C. الاستفادة من التوتر الأكسجين المنخفض للحد من الخلايا المكونة للدم في مزارع الخلايا اللحمية نخاع عظم الفئران. مجلة التجارب المرئية. Epub قبل الطباعة (2022).

افتتاحية

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العظام هي نسيج ديناميكي يخضع لإعادة تشكيل مستمرة ، بما في ذلك ناقضات العظم الممتدة للعظام وبانيات العظم المكونة للعظام. الأهم من ذلك ، أن هذه العمليات تقترن بخلايا أخرى مقيمة في مساحة النخاع مثل الخلايا المكونة للدم والخلايا الشحمية لنخاع العظام. يؤدي الانفصال في دوران العظام إلى هشاشة الهيكل العظمي وزيادة لاحقة في الكسور1. أظهرت الدراسات الحديثة أهمية ركائز التمثيل الغذائي والتمثيل الغذائي النشط لتنظيم كل من تكوين العظام وارتشاف العظام2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ، 16،17. يستخدم استهداف مسارات التمثيل الغذائي لعلاج أنواع مختلفة من السرطان ويمكن أن يكون أداة استفزازية يمكن تطبيقها لمكافحة الحالات المختلفة التي تؤدي إلى زيادة حدوث الكسور18. نتيجة لذلك ، من المهم أن يكون لديك فهم كامل لعملية التمثيل الغذائي الخلوي في جميع خلايا العظام. لسوء الحظ ، فإن دراسة خلايا العظام في بيئتها الأصلية تمثل تحديا بسبب توطينها داخل الأنسجة المعدنية. بالمقارنة مع الأنسجة غير المعدنية ، فإن الخطوات المطلوبة المطلوبة لمعالجة العظام تجعل الدراسات الجزيئية والميكانيكية لحالتها الأيضية صعبة. على هذا النحو ، تهدف هذه المجموعة إلى تسليط الضوء على التقنيات الراسخة المستخدمة لمراقبة مسارات التمثيل الغذائي في الخلايا المعزولة عن مكانتها العظمية.

تصف "Osteoenergetics" عمليات التمثيل الغذائي وإمكانات الطاقة الحيوية لبانيات العظم وتظل مجالا نشطا للاهتمام العلمي والبحث. قبل قدرة الخلايا على صنع واستخدام ATP ، يجب أولا الحصول على ركائز نشطة. تسلط ثلاث مقالات ضمن هذه المجموعة الضوء على الطرق المستخدمة لمراقبة مصير الركيزة المحددة داخل خلايا العظام. أولا ، يصف شين وكارنر19 تقنيات تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في الخلايا المستزرعة في المختبر أو العظام المعزولة خارج الجسم الحي. في النظام في المختبر ، يتم تحضين خلايا ST2 المستزرعة ب L- [3،4-3H] - الجلوتامين لفترة محددة مسبقا ، ويتم قياس امتصاص الجلوتامين باستخدام عداد التلألؤ. وبالمثل ، في نظام خارج الجسم الحي ، يتم تحضين العظام التي يتم حصادها من الفئران حديثي الولادة بأحماض أمينية تحمل علامة إشعاعية ، ويتم تقدير امتصاص الأحماض الأمينية باستخدام عداد التلألؤ. تسمح هذه الطرق بإجراء تقييم سريع وحساس لامتصاص الأحماض الأمينية في خلايا العظام أو في العظام المعزولة. الأهم من ذلك ، أن هذه الطرق قابلة للتعديل بسهولة لتقييم الأحماض الأمينية المختلفة أو الركائز النشطة الأخرى واختبار الأسئلة العلمية المختلفة.

بالإضافة إلى الأحماض الأمينية ، يمثل الجلوكوز والأحماض الدهنية طويلة السلسلة (LCFA) إمدادا كثيفا من الطاقة الخلوية أو ATP. بهذه الصفة ، يدخل LCFA إلى الميتوكوندريا عبر كارنيتين بالميتويل ترانسفيراز (CPTI / II) ، حيث تتأكسد بسهولة عن طريق أكسدة β ، ويمكن أن تدخل لاحقا في حمض ثلاثي الكربوكسيل (TCA) أو دورة الفسفرة المؤكسدة لإنتاج ATP. تؤدي هذه السلسلة من التفاعلات الكيميائية في النهاية إلى إطلاق الكربون على شكل ثاني أكسيد الكربون الغازي (CO 2) ، والذي يصعب تحديده كميا. Song et al. و Kim et al. يصف بخبرة طريقتين مرتبطتين لقياس المستقلبات المتولدة في عملية الأكسدة20،21. تستخدم كلتا التقنيتين ركيزة كربونية تحمل علامة C 14وورق ترشيح كأداة "محاصرة" لتحديد كمية 14ثاني أكسيد الكربون2 الذي تم إصداره. ومع ذلك ، فإن كل طريقة لها نفس القدر من الأهمية لأنها تصف أوعية الاستزراع الفريدة وتقنيات تطبيع البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، يصف Song et al.20 كيفية حساب أكسدة الركيزة ، بينما يتضمن Kim et al.21 طريقة إضافية لقياس المستقلبات القابلة للذوبان في الحمض.

تسمح دراسات التتبع هذه للباحث بتحديد مصير التمثيل الغذائي للركائز المختلفة. كمكمل ، يستخدم Jayapalan et al.22 تحليلات التدفق الأيضي لمراقبة عمليات التمثيل الغذائي ، بما في ذلك تحلل السكر والفسفرة المؤكسدة عبر تنفس الميتوكوندريا. يقيس هذا الجهاز بشكل أساسي الأكسجين ودرجة الحموضة في مزارع الخلايا الحية في الوقت الفعلي. لذلك ، من خلال زراعة الخلايا اللحمية الأولية لنخاع العظم (BMSCs) من خلال تمايز بانيات العظم ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التجارب أثناء مراقبة مسارات التمثيل الغذائي23. يمكن إجراء هذه التقنية بأربع حقن مختلفة ، مما يسمح للباحثين بتكييف التجارب مع أسئلة علمية محددة مع القدرة أيضا على اتباع البروتوكولات الموحدة ، بما في ذلك معدل ATP ، واستخدام الوقود / الركيزة ، وتنفس الميتوكوندريا ، ومقايسات معدل تحلل السكر. أخيرا ، نظرا لأن العديد من هذه التجارب ميكانيكية بطبيعتها ، فمن الضروري الحفاظ على مجموعة خلايا متجانسة دون تلوث بأنواع الخلايا الأخرى. أنظمة زراعة الخلايا في المختبر المستخدمة لمراقبة عمليات التمثيل الغذائي لخلايا العظام لها العديد من القيود المتأصلة. يقدم Guo وWu 24 نظرة عامة ممتازة على القيود التي تم إدخالها أثناء مزارع BMSC القياسية ويساهمون بطريقة مفصلة لإثراء مجموعات الخلايا اللحمية وتقليل التلوث المكونة للدم باستخدام نقص الأكسجة.

باختصار ، توضح هذه المجموعة تقنيات لمراقبة استخدام الركيزة وقدرة الطاقة الحيوية في مجموعة متنوعة من نماذج الهيكل العظمي في المختبر وخارج الجسم الحي. يتم تنفيذ معظم هذه الطرق باستخدام أنظمة زراعة الخلايا ، وبالتالي ، فهي موجودة مع قيود بسبب البيئة الاصطناعية. في حين أنه من الصحيح أن الخلايا الأولية تسمح بنظام فسيولوجي أكثر ، إلا أن هذه الخلايا غالبا ما يتم زراعتها في نسبة عالية من الأكسجين في وسائط تحتوي على تركيزات زائدة من ركائز التمثيل الغذائي ، وأحيانا حتى مع تجمعات الخلايا الملوثة. لذلك ، من الأهمية بمكان أن يتم دعم هذه التجارب الميكانيكية ببيانات إضافية في الجسم الحي . ومع ذلك ، فقد أثبت هذا المجال المثير من البحث أنه مفيد بالفعل. في هذا الصدد ، فإن الاستمرار في توصيف عمليات التمثيل الغذائي "الطبيعية" مقابل العمليات الأيضية المرضية هو مكانة علمية واعدة. علاوة على ذلك ، فإن دراسة هشاشة العظام والتمثيل الغذائي لفهم كيف ولماذا ومتى تستخدم خلايا العظام ركائز مختلفة والآثار المترتبة على صحة العظام بشكل عام تفتح مجالا واسعا للأهداف العلاجية. تحقيقا لهذه الغاية ، وجد أن الجيل الأول من البايفوسفونات المضادة للارتشاف (أي الإتيدرونات والكلودرونات) المستخدمة لعلاج هشاشة العظام تؤثر على طاقات ناقضات ناقضات العظم. تمثل هذه الأدوية الموصوفة على نطاق واسع مثالا ممتازا على كيفية استغلال مسارات التمثيل الغذائي للتأثير على صحة العظام بشكل عام وتحسين نوعية حياة المريض. بالإضافة إلى العلاجات المضادة للامتصاص ، هناك نوعان من العلاجات الابتنائية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، Teriparatide و Romosozumab ، والتي تنشط مسارات PTH و WNT ، على التوالي. يحفز كل من PTH و WNT امتصاص الجلوتامين والتمثيل الغذائي في بانيات العظم6،11،25،26. تسليط الضوء على الآثار العلاجية لذلك ، فإن تثبيط نشاط استقلاب الجلوتامين إما دوائيا أو وراثيا يقلل من تكوين العظام استجابة لعلاجات WNT أو PTH الابتنائية6،11. لذلك ، هناك ما يبرر التحقيق المستمر لدراسة التمثيل الغذائي والطاقة الحيوية في خلايا العظام. توفر التقنيات الموضحة في هذه المجموعة أساسا لمعالجة الأسئلة العلمية المختلفة المتعلقة بهشاشة العظام والتمثيل الغذائي في خلايا العظام.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة (NIH) والمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلدي (NIAMS) AR072123 (إلى ERR) و AR076325 و AR071967 (إلى CMK). ومنحة المعهد الوطني للشيخوخة (NIA) AG069795 (إلى ERR).

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annual Review Pathology. 6, 121-145 (2011).
  2. Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
  3. Esen, E., et al. WNT-LRP5 signaling induces Warburg effect through mTORC2 activation during osteoblast differentiation. Cell Metabolism. 17 (5), 745-755 (2013).
  4. Frey, J. L., et al. Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast. Molecular Cell Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).
  5. Guntur, A. R., et al. Osteoblast-like MC3T3-E1 cells prefer glycolysis for ATP production but adipocyte-like 3T3-L1 cells prefer oxidative phosphorylation. Journal of Bone Mineral Research. 33 (6), 1052-1065 (2018).
  6. Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
  7. Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108(2020).
  8. Shares, B. H., Busch, M., White, N., Shum, L., Eliseev, R. A. Active mitochondria support osteogenic differentiation by stimulating beta-catenin acetylation. Journal of Biological Chemistry. 293 (41), 16019-16027 (2018).
  9. Shares, B. H., et al. Inhibition of the mitochondrial permeability transition improves bone fracture repair. Bone. 137, 115391(2020).
  10. Shen, L., Hu, G., Karner, C. M. Bioenergetic metabolism in osteoblast differentiation. Current Osteoporosis Reports. 20 (1), 53-64 (2022).
  11. Stegen, S., et al. Glutamine metabolism in osteoprogenitors is required for bone mass accrual and PTH-induced bone anabolism in male mice. Journal of Bone and Mineral Research. 36 (3), 604-616 (2021).
  12. Stegen, S., et al. HIF-1alpha promotes glutamine-mediated redox homeostasis and glycogen-dependent bioenergetics to support postimplantation bone cell survival. Cell Metabolism. 23 (2), 265-279 (2016).
  13. Wei, J., et al. Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).
  14. Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
  15. Arnett, T. R., Orriss, I. R. Metabolic properties of the osteoclast. Bone. 115, 25-30 (2018).
  16. Indo, Y., et al. Metabolic regulation of osteoclast differentiation and function. Journal of Bone Mineral Research. 28 (11), 2392-2399 (2013).
  17. Kim, J. M., et al. Osteoclast precursors display dynamic metabolic shifts toward accelerated glucose metabolism at an early stage of RANKL-stimulated osteoclast differentiation. Cellular Physiology and Biochemistry. 20 (6), 935-946 (2007).
  18. Stine, Z. E., Schug, Z. T., Salvino, J. M., Dang, C. V. Targeting cancer metabolism in the era of precision oncology. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 141-162 (2022).
  19. Shen, L., Karner, C. M. Evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts. Journal of Visualized Experiments. (182), e62995(2022).
  20. Kim, S. P., Li, Z., Riddle, R. C. Evaluation of fatty acid oxidation in cultured bone cells. Journal of Visualized Experiments. (182), e63638(2022).
  21. Song, C., Valeri, A., Long, F. Assessing energy substrate oxidation in vitro with 14CO2 trapping. Journal of Visualized Experiments. (181), e63568(2022).
  22. Jayapalan, S., Nandy, A., Rendina-Ruedy, E. Using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics. Journal of Visualized Experiments. (181), e63142(2022).
  23. Misra, B. B., Jayapalan, S., Richards, A. K., Helderman, R. C. M., Rendina-Ruedy, E. Untargeted metabolomics in primary murine bone marrow stromal cells reveals distinct profile throughout osteoblast differentiation. Metabolomics. 17 (10), 86(2021).
  24. Guo, W., Wu, C. Utilizing low oxygen tension to reduce hemopoietic cells in murine bone marrow stromal cell cultures. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  25. Dietrich, J. W., Canalis, E. M., Maina, D. M., Raisz, L. G. Hormonal control of bone collagen synthesis in vitro: effects of parathyroid hormone and calcitonin. Endocrinology. 98 (4), 943-949 (1976).
  26. Yee, J. A. Effect of parathyroid hormone on amino acid transport by cultured neonatal mouse calvarial bone cells. Journal of Bone and Mineral Research. 3 (2), 211-218 (1988).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Amino Acid ConsumptionCultured Bone CellsBone ShaftsMetabolic Flux AnalyzerOsteoblast BioenergeticsEnergy Substrate Oxidation14CO2 TrappingFatty Acid OxidationLow Oxygen TensionHemopoietic CellsBone Marrow Stromal Cells

مقالات ذات صلة