مقالة منهجية

تصوير الفاصل الزمني 3-D لديناميات جدار الخلية باستخدام Calcofluor في الطحالب Physcomitrium patens

DOI:

10.3791/64651

⸱

فبراير 10, 2023

 , 
1Department of Biology, University of Louisville

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتصوير ديناميكيات جدار الخلية 3-D لأنسجة الطحالب الحية ، مما يسمح بتصور انفصال جدران الخلايا في طفرات ggb وأنماط جدار الخلية السميكة في النوع البري أثناء التطور على مدى فترة طويلة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح التصوير بفاصل زمني باستخدام الفحص المجهري الفلوري بمراقبة التغيرات الديناميكية للنمو والتطور على المستويين الخلوي ودون الخلوي. بشكل عام ، بالنسبة للملاحظات على مدى فترة طويلة ، تتطلب التقنية تحويل بروتين الفلورسنت. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم الأنظمة ، يكون التحول الجيني إما مستهلكا للوقت أو غير متاح تقنيا. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا للتصوير ثلاثي الأبعاد بفاصل زمني لديناميكيات جدار الخلية على مدار 3 أيام باستخدام صبغة كالكوفلور (التي تلطخ السليلوز في جدار الخلية النباتية) ، والتي تم تطويرها في الطحالب Physcomitrium patens. إشارة صبغة calcofluor من جدار الخلية مستقرة ويمكن أن تستمر لمدة 1 أسبوع دون تسوس واضح. باستخدام هذه الطريقة ، فقد ثبت أن انفصال الخلايا في طفرات ggb (حيث يتم التخلص من الوحدة الفرعية بيتا للبروتين geranylgeranyltransferase-I) ناتج عن توسع الخلية غير المنظم وعيوب سلامة جدار الخلية. علاوة على ذلك ، تتغير أنماط تلطيخ الكلكوفلور بمرور الوقت. ترتبط المناطق الأقل تلطيخا بشكل مكثف بمواقع توسع / تفرع الخلايا المستقبلية في النوع البري. يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الأنظمة الأخرى التي تحتوي على جدران خلوية والتي يمكن تلطيخها بواسطة الكلكوفلور.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخضع جدران الخلايا النباتية لتغيرات ديناميكية أثناء تمدد الخلايا وتطورها1،2،3. يعد الحفاظ على سلامة جدار الخلية أمرا بالغ الأهمية للالتصاق الخلايا النباتية أثناء النمو والتطور ، وكذلك للاستجابة للإشارات البيئية. على الرغم من أن تصور ديناميكيات جدار الخلية للخلايا الحية على مدى فترة طويلة من الزمن أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية الحفاظ على التصاق الخلايا أثناء التطور والتكيف مع التغيرات البيئية ، إلا أن الطرق الحالية لمراقبة ديناميكيات جدار الخلية مباشرة لا تزال صعبة.

يمكن أن يوفر التصوير بفاصل زمني للتغيرات الخلوية ديناميكيات تنموية مفيدة للكائن الحي باستخدام مجهر مضان عالي الدقة4،5،6،7. في حين أن التصوير ثلاثي الأبعاد بفاصل زمني لديه قدر كبير من الإمكانات لدراسة التغيرات الديناميكية لشكل الخلية أثناء النمو والتطور ، فإن التقنية تتطلب عادة تحويل بروتين الفلورسنت4،5،6،7. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم الأنظمة ، فإن التحولات الجينية إما تستغرق وقتا طويلا أو تمثل تحديا تقنيا. كبديل ، كانت الأصباغ الفلورية التي ترتبط بالمكونات الخلوية متاحة منذ فترة طويلة. يمكن أن تنبعث الأصباغ الفلورية من ضوء الفلورسنت بعد التشعيع بضوء بطول موجي معين. الأمثلة الشائعة هي Edu و DAPI و PI و FM4-64 و calcofluor white8،9،10. ومع ذلك ، فإن أحد العيوب الرئيسية هو أن هذه الأصباغ لا يمكن استخدامها عادة إلا في الأنسجة الثابتة أو للتجارب القصيرة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الضرر الذي تسببه للخلية8،9،10.

مع البروتوكول المقدم هنا ، تكون إشارات calcofluor مستقرة عندما يتم خلط كالكوفلور الأبيض داخل الوسط أثناء تجارب الفاصل الزمني في الطحالب P. patens. باستخدام هذه الطريقة ، لوحظ انفصال الخلايا في طفرات ggb باستخدام التصوير بفاصل زمني ثلاثي الأبعاد على مدى فترة 3 أيام3 (الشكل 1). يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الأنظمة الأخرى التي تحتوي على جدران خلوية والتي يمكن تلطيخها بواسطة الكلكوفلور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على قائمة المواد والمعدات والجدول 1 للحصول على قائمة الحلول التي سيتم استخدامها في هذا البروتوكول.

1. تحضير النباتات لأطباق القاع الزجاجي

  1. قم بزراعة الأنسجة البدائية الطحلبية في وسط أجار BCDAT في طبق بتري 13 سم تحت ضوء أبيض ثابت (~ 50 ميكرومول m-2 s-1) لمدة 7 أيام عند 25 درجة مئوية في غرفة النمو.
  2. قم بتصفية وتعقيم الكالكوفلور الأبيض وخزنه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. الكاشف مستقر لعدة أشهر.
  3. قم بتفريق أنسجة الطحالب البالغة من العمر 7 أيام في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 20 ميكرولتر من الماء المعقم. تأكد من تشتيت الأنسجة البدائية الطحلبية بشكل كاف كقطع صغيرة في الماء. بالنسبة للنوع البري (WT) ، استخدم الملقط لفصل البروتونيماتا ؛ بالنسبة لمتحولة GGB ، استخدم ماصة P-1000.
  4. أضف 10 ميكرولتر من الكالكوفلور الأبيض المعقم إلى الأنبوب الصغير سعة 1.5 مل واترك الأنبوب الصغير في وضع مستقيم في غطاء المحرك لمدة دقيقتين للتلطيخ.
  5. مباشرة بعد التلوين ، امزج النباتات مع 200 ميكرولتر من BCDATG المبرد ، الذي يحتوي على وسط BCDAT المكمل ب 0.5٪ (وزن / حجم) جلوكوز و 0.4٪ (وزن / حجم) صمغ جيلان ، عن طريق السحب خمس مرات باستخدام ماصة P-1000.
    ملاحظة: تأكد من تبريد وسط BCDATG بدرجة كافية (قبل أن يصلب الوسط مباشرة) لتجنب إجهاد النباتات.
  6. انقل الخليط الذي يحتوي على النباتات ووسط BCDATG إلى طبق قاعدة زجاجي بقطر 27 مم. تأكد من أن حجم BCDATG لخلط الخلايا لا يزيد عن 200 ميكرولتر وأن 200 ميكرولتر من BCDATG مع العينات موزعة بالتساوي على سطح الطبق السفلي الزجاجي 7 مم لإنتاج طبقة رقيقة من الفيلم ، بحيث تكون العينات ضمن مسافة العمل الموضوعية أثناء التصوير.
  7. بعد التصلب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بتغطية الطبقة الرقيقة ب 3 مل من BCDATG المبرد واتركها لمدة 10 دقائق لتتصلب مرة أخرى.
    ملاحظة: تأكد من إجراء الخطوات 1.2-1.5 في غطاء معقم لتجنب التلوث.
  8. في الجزء السفلي من الطبق ، ارسم تسعة خطوط في اتجاهات متوازية ومتعامدة (الشكل 2). ضع علامة على الصفوف بأحرف من a إلى h ، وقم بتمييز الأعمدة بأرقام من 1 إلى 8. استخدم العلوي والسفلي والأيمن والأوسط والأيسر لتمييز المواضع داخل كل مربع. على سبيل المثال ، إذا كان النبات في مربع في الصف الثاني والعمود السادس وتم وضعه في الجزء الأيسر العلوي من المربع ، إعطاء هذا النبات اسم "b6_upper_left".
  9. قبل زراعة طبق القاع الزجاجي الذي يحتوي على النباتات تحت الضوء الأحمر لمدة 5 أيام عند 25 درجة مئوية في غرفة النمو ، ثم تحت الضوء الأبيض لمدة 1-2 أيام قبل الخضوع لتصوير الفاصل الزمني كل يوم لمدة تصل إلى 3 أيام. بالنسبة ل WT ، قم بزراعة النباتات في ضوء أحمر ضعيف (0.5 μmol m-2 s-1) مما سبق لمدة 5 أيام للحث على الاستجابة الضوئية للبروتونيماتا ، بحيث يمكن للنباتات أن تلتصق بقاع الأطباق11.
    ملاحظة: يتم توفير الضوء الأحمر الضعيف عن طريق تمرير ضوء أبيض من خلال مرشح بلاستيكي أكريليك أحمر بسمك 3 مم إلى صناديق مقاومة للضوء. بالنسبة لمتحولات ggb ، يكون الاستزراع المسبق في الضوء الأحمر اختياريا ، حيث لا تحتوي طفرات ggb على استجابة انتحاء ضوئي 3.

2. التصوير وإعادة الإعمار 3-D

  1. ضع طبق القاع الزجاجي الذي يحتوي على نباتات على مرحلة مجهر متحد البؤر مقلوب ، بحيث يكون القاع الزجاجي مواجها للهدف. استخدم مجهرا متحد البؤر لتصور الكالكوفلور بعدسة موضوعية 20x. التقط صورا باستخدام ليزر 405 نانومتر ، والثقب عند 1.0 ، وكسب HV عند 100 ، وضبط خلفية الإزاحة عند 0 ، وطاقة الليزر عند 5٪ -7٪ ، وحجم مسح ضوئي يبلغ 1024 × 1024 ، وسرعة مسح ضوئي تبلغ 1/2 إطار / ثانية. اجمع 17-30 قسما بصريا من سلسلة z بحجم خطوة 1.0 ميكرومتر. قم بتسمية الصور باستخدام التعليمات البرمجية في الخطوة 1.6، مثل "b6_upper_left-day0"، واحفظها.
    1. حدد قناة DAPI في الاستحواذ وحدد مربع Z في اكتساب ND. لتعيين الحدود الدنيا والعليا لمكدس Z، انقر فوق الزرين العلوي والسفلي.
  2. لإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد ، افتح ملف .nd2 (الشكل 3 أ ؛ انظر جدول المواد) وانقر فوق المجلد (الشكل 3 ب).

3. تصوير نفس النباتات في نقاط زمنية مختلفة

  1. بعد كل تصوير ، ضع طبق القاعدة الزجاجية مرة أخرى في غرفة النمو.
  2. كرر من الخطوة 2.1 للتصوير وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد.
    ملاحظة: للعثور على نفس النباتات ، استخدم الرمز المذكور في الخطوة 1.6 وقم بإعطاء الاسم "b6_upper_left-day1" أو "b6_upper_left-day2" ، وفقا لعمر النباتات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح هذه الطريقة بمراقبة ديناميكيات جدار الخلية أثناء التطور في النوع البري وطفرات ggb (الشكل 1). أظهرت النتائج أن المناطق ذات السماكة الأقل لجدار الخلية ترتبط بمواقع تمدد / تفرع الخلية ، مما يسمح بالتنبؤ بمواقع التوسع / التفرع في النوع البري (الشكل 1 أ). تمزق سطح جدران الخلايا في طفرات ggb أثناء التطور بسبب توسع الخلايا غير المنضبط3 (الشكل 1 ب). علاوة على ذلك ، فإن إشارة تلطيخ السطح المكسور...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعادة بناء 3-D بفاصل زمني ، أو تصوير 4-D ، هي أداة قوية لمراقبة ديناميات التشكل الخلوي أثناء العمليات التنموية. في هذا البروتوكول ، عن طريق خلط الكلس الأبيض في الوسط ، يمكن ملاحظة ديناميات التشكل الخلوي 3-D في الطحلب P. patens. باستخدام هذه الطريقة ، لاحظنا أن سطح جدران الخلايا في طفرات ggb يتمزق أثناء التطور3. علاوة على ذلك ، يرتبط انخفاض سماكة جدران الخلايا بمواقع تمدد / تفرع الخلايا في النوع البري ، مما يسمح بالتنبؤ بمواقع التوسع / التفرع. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه يمكن استخدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عن عدم وجود مصالح متنافسة أو مالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدكتورة سوسي باتريشيا وبيتي نان من جامعة لويزفيل للمساعدة في المجهر متحد البؤر. تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (1456884 إلى MPR) ومن خلال اتفاقية تعاونية لمؤسسة العلوم الوطنية (1849213 إلى MPR).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

مرشح

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ضوء بلاستيكي أحمر بسمك 3 مم  ؛ ميتسوبيشي  No.102
27 مم قطر الزجاج قاعدة الصحن إيواكي3930-035
أجار  سيجماA6924
Calcofluor أبيض    سيجما18909-100ML-Fكالكوفلور أبيض M2R ، 1 جم / لتر وإيفانز الأزرق ، 0.5 جم / لتر
مجهر متحد البؤر   ؛نيكون A1

NIS عنصر البرمجيات; .nd2 في NIS-elements Viewer, تنزيل من https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

المجهر الفلوري نيكون TE200 مجهزة بكاميرا DS-U3 ؛
صمغ جيلان Nacali Tesque12389-96
غرف نمو النباتSANYO   ؛سانيو MLR-350H
حقنة معقمة 0.22 & مو ؛ مرشح MMilliporeSLGV033RS

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
  3. Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
  4. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  5. Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
  6. Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
  7. Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
  8. Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
  9. Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
  10. Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
  11. Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Calcofluor StainingFluorescence Microscopy3D ImagingCell ExpansionCell Wall IntegrityPlant Cell WallProtonemata Separation

مقالات ذات صلة