مقالة منهجية

دراسة التفاعلات بين إنزيمات هيستون المعدلة وعوامل النسخ في الجسم الحي عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري

DOI:

10.3791/64656

⸱

أكتوبر 14, 2022

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) هو تقنية تصوير للكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول FRET لدراسة ارتباط الإنزيمات المعدلة للهيستون بعوامل النسخ التي تجندها إلى المروجين المستهدفين للتنظيم اللاجيني للتعبير الجيني في الأنسجة النباتية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتأثر التنظيم اللاجيني للتعبير الجيني عادة بإنزيمات تعديل الهستون (HMEs) التي تولد علامات هيستون غير متجانسة أو euchromatic لقمع النسخ أو التنشيط ، على التوالي. يتم تجنيد HMEs إلى الكروماتين المستهدف بواسطة عوامل النسخ (TFs). وبالتالي ، فإن اكتشاف وتوصيف التفاعلات المباشرة بين HMEs و TFs أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفتها وخصوصيتها بشكل أفضل. ستكون هذه الدراسات أكثر أهمية من الناحية البيولوجية إذا أجريت في الجسم الحي داخل الأنسجة الحية. هنا ، يتم وصف بروتوكول لتصور التفاعلات في أوراق النبات بين هيستون ديوبيكوتيناز النبات وعامل نسخ النبات باستخدام نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) ، والذي يسمح باكتشاف المجمعات بين جزيئات البروتين التي تقع في حدود <10 نانومتر من بعضها البعض. يتم تقديم نوعين مختلفين من تقنية FRET: SE-FRET (الانبعاث الحساس) و AB-FRET (تبييض المستقبل) ، حيث يتم نقل الطاقة بشكل غير إشعاعي من المتبرع إلى المستقبل أو تنبعث إشعاعيا من قبل المتبرع عند التبييض الضوئي للمقبل. يمكن تكييف كل من نهج SE-FRET و AB-FRET بسهولة لاكتشاف التفاعلات الأخرى بين البروتينات الأخرى في النبات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب deubiquitinases هيستون النبات دورا مهما في التحكم في التعبير الجيني عن طريق التعديل اللاحق للترجمة للهستونات ، وتحديدا عن طريق محو علامات monoubiquitylationالخاصة بها 1. حتى الآن ، يعد OTLD1 أحد نباتات هيستون ديوبيكوتيناز القليلة الوحيدة التي تتميز على المستوى الجزيئي في Arabidopsis 2,3. يزيل OTLD1 مجموعات monoubiquitin من جزيئات هيستون H2B ، وبالتالي تعزيز إزالة أو إضافة أستلة euchromatic وتعديلات المثيلة لهستونات H3 في الكروماتين الجيني المستهدف 4,5. علاوة على ذلك ، يتفاعل OTLD1 مع إنزيم آخر معدل للكروماتين ، وهو هيستون ليسين ديميثيلاز KDM1C ، للتأثير على قمع النسخ للجينات المستهدفة 6,7.

تفتقر معظم الإنزيمات المعدلة للهيستون إلى قدرات ربط الحمض النووي ، وبالتالي لا يمكنها التعرف على الجينات المستهدفة مباشرة. أحد الاحتمالات هو أنها تتعاون مع بروتينات عامل النسخ المرتبط بالحمض النووي الذي يربط هذه الإنزيمات ويوجهها إلى أهداف الكروماتين الخاصة بها. على وجه التحديد ، في النباتات ، من المعروف أن العديد من الإنزيمات الرئيسية المعدلة للهيستون (أي هيستون ميثيل ترانسفيراز8،9 ، هيستون أسيتيل ترانسفيراز 10 ، هيستون ديميثيلاز11 ، ومعقدات بوليكومب القمعية12،13،14) يتم تجنيدها بواسطة عوامل النسخ. تماشيا مع هذه الفكرة ، تم مؤخرا اقتراح آلية واحدة ممكنة لتوظيف OTLD1 للمروجين المستهدفين والتي تستند إلى تفاعلات محددة بين البروتين والبروتين في OTLD1 مع عامل النسخ LSH1015.

ينتمي LSH10 إلى عائلة من بروتينات نبات ALOG (Arabidopsis LSH1 و Oryza G1) التي تعمل كمنظم تنموي مركزي16،17،18،19،20،21،22. حقيقة أن أعضاء عائلة بروتين ALOG تحتوي على زخارف ربط الحمض النووي 23 وتظهر القدرات على تنظيم النسخ22 ، والتوطين النووي19 ، و homodimerization24 تقدم مزيدا من الدعم لفكرة أن هذه البروتينات ، بما في ذلك LSH10 ، قد تعمل كعوامل نسخ محددة أثناء التنظيم اللاجيني للنسخ. إحدى التقنيات التجريبية الرئيسية المستخدمة لتوصيف تفاعل LSH10-OTLD1 في الجسم الحي هي نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET)15.

FRET هي تقنية تصوير للكشف المباشر عن التفاعلات القريبة المدى بين البروتينات داخل <10 نانومتر من بعضها البعض25 داخل الخلايا الحية. هناك نوعان رئيسيان من الاختلافات في نهج FRET26: الانبعاثات الحساسة (SE-FRET) (الشكل 1A) وتبييض المستقبل (AB-FRET) (الشكل 1B). في SE-FRET ، البروتينات المتفاعلة - أحدها موسوم بفلوروكروم مانح (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر ، GFP) والآخر مع فلوروكروم متقبل (على سبيل المثال ، بروتين فلوري أحمر أحادي ، mRFP27,28) - ينقل طاقة الحالة المثارة بشكل غير إشعاعي من المتبرع إلى المستقبل. نظرا لعدم انبعاث أي فوتونات أثناء هذا النقل ، يتم إنتاج إشارة فلورية لها طيف انبعاث إشعاعي مشابه للطيف المستقبل. في AB-FRET ، يتم الكشف عن تفاعلات البروتين وقياسها كميا بناء على الانبعاث الإشعاعي المرتفع للمتبرع عندما يتم تعطيل المستقبل بشكل دائم عن طريق التبييض الضوئي ، وبالتالي لا يمكنه تلقي الطاقة غير الإشعاعية المنقولة من المتبرع (الشكل 1). الأهم من ذلك ، أن الموقع تحت الخلوي لمضان FRET يدل على توطين البروتينات المتفاعلة في الخلية.

إن القدرة على نشر FRET في الأنسجة الحية وتحديد التوطين تحت الخلوي للبروتينات المتفاعلة في وقت واحد مع اكتشاف هذا التفاعل في حد ذاته ، يجعل FRET التقنية المفضلة للدراسات والتوصيف الأولي لتفاعلات البروتين والبروتين في الجسم الحي. تعد منهجية التصوير الفلوري المماثلة في الجسم الحي ، تكملة التألق ثنائي الجزيئات (BiFC) 29،30،31،32 ، نهجا بديلا جيدا ، على الرغم من أنه ، على عكس FRET ، قد ينتج BiFC إيجابيات خاطئة بسبب التجميع التلقائي لمراسلي BiFC الفلوري الذاتي 33 ، والقياس الكمي لبياناته أقل دقة.

تشارك هذه المقالة التجربة الناجحة في تنفيذ كل من تقنيات SE-FRET و AB-FRET وتقدم بروتوكولا لنشرها للتحقيق في التفاعلات بين OTLD1 و LSH10 في الخلايا النباتية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام نيكوتيانا بينثاميانا أو سلالة Agrobacterium tumefaciens EHA105 أو GV3101 في هذه الدراسة.

1. بناء ناقلات الحنق

  1. حدد علامات الفلورسنت لزوج FRET المتبرع / المتقبل.
    1. استخدم EGFP من pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (انظر جدول المواد) لتوليد ناقل المانح.
    2. استخدم mRFP من pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (انظر جدول المواد) لإنشاء متجه المستقبل.
  2. قم بإنشاء بنيات FRET للمانح / المتقبل باستخدام تقنية استنساخ إعادة التركيب الخاصة بالموقع34 ، مثل نظام استنساخ إعادة التركيبGateway 35.
    1. تضخيم تسلسل الترميز للبروتينات ذات الأهمية36 (أي Arabidopsis OTLD1 و LSH10)15.
      ملاحظة: من الجيد أيضا استخدام عنصر تحكم سلبي يمثل تجانسا لأحد البروتينات المتفاعلة ولكن لا يتوقع أن يظهر تفاعلا. تستخدم دراسة تفاعل OTLD1-LSH10 تجانسا ل LSH10 ، LSH4 ، لا يتعرف على OTLD1. يتم تضخيم OTLD1 و LSH10 و LSH4 cDNAs بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المدرجة في الجدول 1.
    2. استنساخ OTLD1 و LSH10 و LSH4 في متجه الدخول pDONR207 بواسطة تقنية استنساخ إعادة التركيب الخاصة بالموقع 34.
    3. استخدم بوابة LR Clonase II (انظر جدول المواد) لنقل LSH10 و LSH4 من pDONR207 إلى متجه الوجهة الثنائية pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 لإنشاء بنيات المانحين الثنائية p35S::LSH10-GFP (البناء المختبر) و p35S::LSH4-GFP (التحكم السلبي).
    4. استخدم نفس الإنزيم المتاح تجاريا (الخطوة 1.2.3) لنقل OTLD1 من pDONR207 إلى متجه الوجهة الثنائية pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 لإنشاء بناء المستقبل الثنائي p35S:: OTLD1-mRFP (بناء تم اختباره).
    5. PCR-تضخيم36 mRFP من pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 باستخدام البادئات المدرجة في الجدول 1 ، واستنساخها بواسطة تقنية استنساخ إعادة التركيب إلى pDONR207 ، ثم استخدم LR Clonase II لنقل mRFP إلى pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 لتوليد بناء الاندماج الثنائي p35S::mRFP-GFP (التحكم الإيجابي).
  3. إجراء تحويل البنيات المانحة والمتقبلة إلى Agrobacterium.
    1. أضف 1 ميكروغرام من كل بلازميد من الخطوات 1.2.3-1.2.5 إلى 100 ميكرولتر من مزرعة الخلايا المختصة من سلالة Agrobacterium tumefaciens EHA105 أو GV3101 ، المحضرة باستخدام البروتوكولات القياسية 37 أو التي تم الحصول عليها تجاريا ، واحتضانها عند37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. أضف 1 مل من وسط LB (1٪ تريبتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ، و 1٪ كلوريد الصوديوم ؛ انظر جدول المواد) إلى خليط الخلية المختص وحرك عند 200 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. أعد تعليق الخلايا في 0.1 مل من وسط LB عن طريق السحب ونشرها على أجار LB المكمل بالمضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال ، 0.01٪ سبكتينومايسين و 0.005٪ ريفامبيسين ؛ انظر جدول المواد). تنمو عند 28 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
    4. اختر المستعمرات الفردية وقم بتلقيح كل منها على حدة في 1 مل من مرق LB المكمل بالمضادات الحيوية المناسبة.
    5. تنمو الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ونقل 0.2 مل من المزرعة إلى أنبوب جديد. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
    6. استخراج الحمض النووي البلازميد عن طريق بروتوكول قياسي لعزل البلازميدات من خلايا Agrobacterium 38 وإعادة تعليق الحمض النووي المستخرج في30 ميكرولتر من الماء. لتحديد المستعمرات التي تؤوي البلازميدات المرغوبة ، استخدم 2 ميكرولتر من مستحضر الحمض النووي كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل مع البادئات الخاصة بالجينات المدرجة في الجدول 1. امزج 0.7 مل من المزرعة المحددة مع 0.3 مل من الجلسرين وخزنها في -80 درجة مئوية.

2. التسلل الزراعي

  1. تنمو نباتات نيكوتيانا بينثاميانا .
    ملاحظة: طوال التجربة بأكملها ، يجب أن تكون جميع النباتات صحية.
    1. زرع وتنمو بذور N. benthamiana في وعاء يحتوي على تربة رطبة بكثافة عالية.
    2. احتفظ بالبذور المزروعة في غرفة نمو عند 23 درجة مئوية مع 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات من الدورة المظلمة بكثافة ضوء 150-170 ميكرومول / م2ثانية حتى يصل قطر euphyll إلى 0.5 سم.
    3. انقل الشتلات إلى أواني أكبر واسمح لها بالنمو في نفس الغرفة بنفس المعلمات.
      ملاحظة: تكون النباتات جاهزة للتسلل الزراعي عندما يبلغ قطر أكبر أوراقها 5-7 سم ، عادة في غضون 4-5 أسابيع. في النباتات الصغيرة جدا ، ستكون آثار التسلل الزراعي شديدة جدا بالنسبة لتحليل FRET.
  2. تحضير الخلايا البكتيرية للتسلل الزراعي.
    1. تنمو كل مستعمرة من مستعمرات Agrobacterium التي تحتوي على تركيبات FRET طوال الليل في 5 مل من وسط LB المكمل بالمضادات الحيوية المناسبة (الخطوة 1.3.3) و 150 ميكرومتر من الأسيتوسيرينجون عند 28 درجة مئوية (انظر جدول المواد).
    2. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 3000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للتسلل الزراعي (10 mM MgCl2 ، 10 mM MES pH 5.6 ، 150 μM acetosyringone) إلى OD600 = 0.5.
    4. اجمع الخلايا المعاد تعليقها بنسبة 1: 1 v / v بين الخلايا التي تحتوي على التركيبات المناسبة (الخطوة 2.2.5).
    5. بالنسبة للتسلل الزراعي مزدوج البناء ، امزج حصص ثقافتين ، وبالنسبة للتسلل الزراعي أحادي البناء ، امزج حصص نفس الثقافة:
      1. البروتينات المختبرة: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (البكتيريا التي تؤوي تركيبات p35S::OTLD1-mRFP و p35S::LSH10-GFP).
      2. التحكم السلبي: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (البكتيريا التي تؤوي p35S :: OTLD1-mRFP و p35S :: LSH4-GFP بنيات).
      3. التحكم السلبي: LSH10-GFP + mRFP مجاني (البكتيريا التي تؤوي p35S::LSH10-GFP و pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. التحكم الإيجابي: mRFP-GFP (البكتيريا التي تؤوي p35S :: mRFP-GFP بناء).
    6. احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 0.5-1 ساعة.
  3. أداء التسلل الزراعي.
    1. قم بتحميل الثقافة البكتيرية في حقنة عديمة الإبر سعة 1 مل.
    2. اضغط برفق ولكن بحزم على فوهة المحقنة على الجانب المحوري من أوراق N. benthamiana الموسعة بالكامل أثناء إمساك الورقة بإصبع قفاز على الجانب المحوري.
    3. تسلل ما يصل إلى أربع نقاط على ورقة ، وثلاث أوراق لكل نبات ، واثنين أو ثلاثة نباتات لكل ثقافة بكتيرية. تغيير القفازات بين العينات لمنع التلوث المتبادل.
    4. الحفاظ على النباتات الزراعية المتسللة في نفس غرفة النمو في ظل نفس الظروف ، كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 ، لمدة 24 ساعة إلى 36 ساعة. لا تحتفظ بالنباتات الزراعية المتسللة لمدة تزيد عن 36 ساعة ، لأن هذا سيقلل من إشارة التألق.

3. المجهر متحد البؤر

  1. إعداد شرائح المجهر للتصور مضان.
    1. بعد 24-36 ساعة من التسلل ، استخدم شفرة حلاقة لقطع كل ورقة زراعية إلى قطع صغيرة (2 مم × 4 مم) بين الأوردة.
    2. ضع قطع الأوراق على شريحة زجاجية بحيث يكون سطح الورقة المحوري متجها لأعلى. ضع قطرة ماء على قطع الأوراق وقم بتغطيتها بزجاج الغطاء. اضغط قليلا على زجاج الغطاء لإزالة فقاعات الهواء.
    3. قم بتشغيل المجهر والليزر (انظر جدول المواد). ضع الشريحة في حامل مرحلة المجهر للتصوير تحت معلمات FRET المحددة (الخطوتان 3.2 و 3.3).
    4. ابدأ عمليات الرصد باستخدام عدسة موضوعية 10x لتحديد الخلايا التي تظهر إشارات GFP و mRFP ، ثم استخدم عدسة موضوعية 40x للملاحظات التفصيلية اللاحقة.
      ملاحظة: الأهم من ذلك ، عادة ما يتم إجراء SE-FRET و AB-FRET على نفس عينة الأنسجة ، مما يسمح باستخدام نفس إعدادات القناة (الخطوة 3.2) باستثناء قناة FRET ، التي يتم تشغيلها / إيقاف تشغيلها لملاحظات SE-FRET و AB-FRET ، على التوالي (الخطوتان 3.2.2.3 و 3.3.1).
  2. قم بإعداد المعلمات ل SE-FRET (الشكل 1 أ).
    1. افتح أداة الاكتساب متعدد الأبعاد (MDA).
    2. إنشاء مجموعة من ثلاث قنوات متحدة البؤر في نفس مجال الرؤية (الشكل التكميلي 1).
      1. اضبط القناة المانحة (قناة GFP) لإثارة وانبعاث الفلوروكروم المانح باستخدام ليزر الإثارة 405 نانومتر ومرشح الانبعاث 400-597 نانومتر.
      2. اضبط قناة المستقبل (قناة mRFP) لإثارة وانبعاث الفلوروكروم المستقبلي باستخدام ليزر الإثارة 561 نانومتر ومرشح الانبعاث 400-597 نانومتر.
        ملاحظة: تم ضبط مرشح الانبعاث ل mRFP على 400-597 نانومتر لفصل إشارة mRFP عن إشارة FRET عند 597-617 نانومتر (الخطوة 3.2.2.3) وبالتالي تقليل انبعاث mRFP المستقل عن FRET.
      3. اضبط قناة FRET لإثارة المتبرع وانبعاث الفلوروكرومات المتقبلة باستخدام ليزر الإثارة 405 نانومتر ومرشح الانبعاث 597-617 نانومتر.
    3. اضبط شدة إثارة المتبرع عند الحد الأدنى لمراقبة FRET مع تجنب التبييض الضوئي ، مما يقلل من كفاءة SE-FRET.
      ملاحظة: يتم اختيار شدة الإثارة هذه تجريبيا قبل إجراء إجراء FRET لتجنب التبييض الضوئي. يختلف حسب سمك الورقة وعمرها والوقت بعد الإفراط في التعبير.
    4. قم بإثارة المتبرع وابحث عن الخلايا التي تحتوي على إشارة التألق المتوقعة للمتقبل.
    5. حدد المنطقة التي تحتوي على إشارة التألق محل الاهتمام.
    6. احصل على تسلسل صور SE-FRET بالضغط على زر Snap .
      1. صورة 10-15 خلية تعبر عن بنية mRFP-GFP (التحكم الإيجابي) أولا ؛ اضبط معلمات التركيز والتكبير / التصغير والكسب الذكي للتركيز على مجال الاهتمام المراد التقاطه (الشكل التكميلي 2).
      2. باستخدام نفس الإعدادات ، قم بتصوير 10-15 خلية ، كل منها يعبر عن OTLD1-mRFP أو mRFP المجاني أو LSH10-GFP أو LSH4-GFP بشكل منفصل.
        ملاحظة: يتم الحصول على هذه الصور بواسطة المكون الإضافي "PixFRET" الخاص ب ImageJ (انظر جدول المواد) ، والذي تم استخدامه لتحليل بيانات FRET (الخطوة 3.4.1) لتحديد قيم التسييل الطيفي (SBT) للمقبلين والمانحين ؛ يتم استخدام هذه الصور من قبل البرنامج لإنشاء صور SE-FRET ل OTLD1-mRFP + LSH10-GFP و OTLD1-mRFP + LSH4-GFP و LSH10-GFP + أزواج بروتين mRFP المجانية (الخطوة 3.2.6.3).
      3. أيضا ، باستخدام نفس الإعدادات ، صورة 10-15 خلية تعبر عن OTLD1-mRFP + LSH10-GFP و OTLD1-mRFP + LSH4-GFP و LSH10-GFP + أزواج بروتين mRFP مجانية.
  3. قم بإعداد معلمات AB-FRET (الشكل 1B).
    1. استخدم معلمات قناة المتبرع والمستقبل المحددة ل SE-FRET (الخطوة 3.2.2) ولكن قم بإيقاف تشغيل قناة FRET.
    2. اضبط معلمات التبييض الضوئي للمتقبل (mRFP) (الشكل التكميلي 3).
      1. تأكد من أن التبييض يبدأ بعد خمس صور. السماح ب 200 تكرار لكل منطقة مبيض. حافظ على كثافة الليزر بنسبة 100٪ عند 561 نانومتر.
      2. الحفاظ على مدة التبييض من 45 ثانية. تأكد من سرعة مسح ضوئي تبلغ 512 × 512 بكسل عند 400 هرتز.
    3. ارسم منطقة الخلية المراد تبييضها ؛ على سبيل المثال ، بالنسبة للتفاعلات النووية ، يتم رسم المناطق ذات الاهتمام حول كامل مساحة نواة الخلية39.
    4. قم بتنشيط التبييض بالضغط على زر بدء التجربة ؛ سيؤدي تنشيط هذه الوظيفة إلى إجراء التبييض الضوئي والحصول على تسلسل صورة AB-FRET.
  4. تحليل بيانات FRET.
    1. لتحليل بيانات SE-FRET ، استخدم المكون الإضافي "PixFRET" لبرنامج ImageJ لإنشاء صور مصححة لكفاءة SE-FRET بعد طرح SBT40 (الخطوة 3.2.6.2).
    2. لتحليل بيانات AB-FRET ، احسب ٪ AB-FRET كنسبة مئوية للزيادة في انبعاث GFP بعد التبييض الضوئي mRFP باستخدام الصيغة التالية41: ٪ AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] × 100 ، حيث GFPpost هو انبعاث GFP بعد التبييض الضوئي mRFP ، و GFPpre هو انبعاث GFP قبل التبييض الضوئي mRFP.
    3. عند مراجعة صور FRET ، انتبه إلى التوطين تحت الخلوي لإشارة FRET.
      ملاحظة: في كثير من الحالات ، يمكن تحديد هذه المقصورات الخلوية (على سبيل المثال ، النواة ، البلاستيدات الخضراء ، ER ، إلخ) بسهولة ، وكميزة إضافية لتقنية FRET ، توفر أدلة مهمة على الوظيفة البيولوجية للبروتينات المتفاعلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 2 النتائج النموذجية لتجربة SE-FRET ، حيث تم تسجيل نوى الخلية في وقت واحد في ثلاث قنوات (أي GFP المانحة ، و mRFP المتقبل ، و SE-FRET). تم استخدام هذه البيانات لإنشاء صور لكفاءة SE-FRET مشفرة في مقياس ألوان زائفة. على هذا المقياس ، يتوافق الانتقال من الأزرق إلى الأحمر مع زيادة في كفاءة FRET ، وهو مقياس لقرب البروتين والبروتين من 0٪ إلى 100٪. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تسجيل إشارة SE-FRET في نواة الخلية ، وكانت شدتها بعد التعبير المشترك ل LSH10 و OTLD1 مماثلة لتلك التي لوحظت بعد ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول FRET هذا بسيط وسهل التكاثر. كما يتطلب الحد الأدنى من الاستثمار في التوريد ويستخدم المعدات القياسية للعديد من المختبرات الحديثة. على وجه التحديد ، هناك خمس ميزات تقنية رئيسية تميز تنوع هذا الإجراء. أولا ، يتم إنشاء بنيات FRET باستخدام إعادة التركيب الخاصة بالموقع ، وهو نهج استنساخ سهل الاستخدام ، وينتج نتائج دقيقة ، ويوفر الوقت مقارنة بالاستنساخ التقليدي القائم على إنزيم التقييد. ثانيا ، نباتات N. benthamiana سهلة النمو ، وتنتج كميات كبيرة نسبيا من الأنسجة ومتوفرة في معظم المختبرات. ثالثا ، يؤدي الارتشاح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم العمل في مختبر V.C. بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (R35GM144059 و R01GM50224) و NSF (MCB1913165 و IOS1758046) و BARD (IS-5276-20) إلى V.C.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أسيتوسيرينغون (3 & prime ;, 5 & -dimethoxy-4 & prime ;-hydroxyacetophenone)Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto AgarBD Biosciences# 214010
Bacto tryptonBD Biosciences# 211705
مستخلص الخميرة باكتوBD Biosciences# 212750 
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (CLSM)ZeissLSM900أي CLSM ذو قدرات مماثلة مناسب
EHA105VWR104013-310نستخدم المخزون في مجموعة مخزون مختبر Citovsky
Gateway BP Clonase II & nbsp ؛Invitrogen# 11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen# 11791020
GV3101VWR104013-296نستخدم المخزون في مجموعة مخزون مختبر Citovsky البكتيرية
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich# 69889-10G
MgCl2< / sub> Sigma-Aldrich# 63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana< / em> بذورHerbalistics PtyRA4 أو LABنستخدم المخزون في مجموعة مخزون مختبر بذور Citovsky
pDONR207Invitrogen# 12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 & nbsp;غير متاحالمراجع 15 ، 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1N / Aتم إنشاؤه بناء على بناء pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 (انظر المراجع 15 ، 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 غير متاحتم إنشاؤه بناء على بناء pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1
RifampicinSigma-Aldrich#R7382-5G
SpectinomycinSigma-Aldrich#S4014-5G
محاقن بدون إبرBD309659
Zen للتصوير CLSMإصدار ZeissZEN 3.0يجب أن يكون البرنامج متوافقا مع CLSM المستخدم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274(2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56(2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83(2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125(2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39(2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712(2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511(2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237(2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Histone Modifying EnzymesTranscription FactorsProtein Protein InteractionFluorescence Resonance EnergySE FRETAB FRETPlant LeavesAgroinfiltrationConfocal MicroscopyImageJ Analysis

مقالات ذات صلة