مقالة منهجية

نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة

DOI:

10.3791/64679

⸱

نوفمبر 30, 2022

 ,  , 
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا العمل بروتوكولا لنظام التحوير المعياري Tol2 ، وهو طريقة استنساخ قائمة على البوابة لإنشاء وحقن تركيبات معدلة وراثيا في أجنة الزرد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتميز اضطرابات طيف الكحول الجنيني (FASD) بمجموعة متغيرة للغاية من العيوب الهيكلية والإعاقات المعرفية التي تنشأ بسبب التعرض للإيثانول قبل الولادة. نظرا لعلم الأمراض المعقد ل FASD ، أثبتت النماذج الحيوانية أهميتها لفهمنا الحالي للعيوب التنموية التي يسببها الإيثانول. أثبت الزرد أنه نموذج قوي لفحص العيوب التنموية التي يسببها الإيثانول بسبب الدرجة العالية من الحفاظ على كل من الوراثة والتنمية بين الزرد والبشر. كنظام نموذجي ، تمتلك أسماك الزرد العديد من السمات التي تجعلها مثالية للدراسات التنموية ، بما في ذلك أعداد كبيرة من الأجنة المخصبة خارجيا والتي تكون شفافة وراثيا. وهذا يسمح للباحثين بالتحكم بدقة في توقيت وجرعة التعرض للإيثانول في سياقات جينية متعددة. إحدى الأدوات الوراثية المهمة المتاحة في الزرد هي الجينات المحورة. ومع ذلك ، فإن توليد تركيبات معدلة وراثيا وإنشاء خطوط محورة وراثيا يمكن أن يكون معقدا وصعبا. لمعالجة هذه المشكلة ، أنشأ باحثو الزرد نظام التحوير Tol2 القائم على الترانسبوزون. يستخدم هذا النظام المعياري نهج استنساخ بوابة متعدد المواقع للتجميع السريع للتركيبات المعدلة وراثيا الكاملة القائمة على Tol2. هنا ، نصف صندوق أدوات نظام Tol2 المرن وبروتوكول لتوليد تركيبات معدلة وراثيا جاهزة لجين الزرد المحورة واستخدامها في دراسات الإيثانول.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤدي التعرض للإيثانول قبل الولادة إلى سلسلة متصلة من العجز الهيكلي والإعاقات المعرفية تسمى اضطرابات طيف الكحول الجنيني (FASD) 1،2،3،4. العلاقات المعقدة بين عوامل متعددة تجعل دراسة وفهم مسببات FASD في البشر صعبة. لحل هذا التحدي ، تم استخدام مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية. أثبتت الأدوات البيولوجية والتجريبية المتاحة في هذه النماذج أنها حاسمة في تطوير فهمنا للأساس الميكانيكي للإيثانول المسخي ، وكانت النتائج من هذه الأنظمة النموذجية متسقة بشكل ملحوظ مع ما هو موجود في دراسات الإيثانول البشرية 5,6. من بين هؤلاء ، برزت أسماك الزرد كنموذج قوي لدراسة تكوين الإيثانولالمسخي 7,8 ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الإخصاب الخارجي ، والخصوبة العالية ، وقابلية السحب الوراثي ، والأجنة الشفافة. تتحد نقاط القوة هذه لجعل الزرد مثاليا لدراسات التصوير الحية في الوقت الفعلي ل FASD باستخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا.

تم استخدام الزرد المعدل وراثيا على نطاق واسع لدراسة جوانب متعددة من التطور الجنيني9. ومع ذلك ، فإن إنشاء تركيبات معدلة وراثيا وخطوط معدلة وراثيا لاحقة يمكن أن يكون صعبا للغاية. يتطلب جين التحوير القياسي عنصر محفز نشط لدفع جين التحوير وإشارة بولي أ أو "ذيل" ، كل ذلك في ناقل بكتيري مستقر لصيانة النواقل العامة. يتطلب الجيل التقليدي من بنية محورة وراثية متعددة المكونات خطوات استنساخ فرعية متعددة تستغرقوقتا طويلا 10. ويمكن للنهج القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل، مثل تجميع جيبسون، أن تتحايل على بعض المسائل المرتبطة بالاستنساخ الفرعي. ومع ذلك ، يجب تصميم واختبار الاشعال الفريدة لتوليد كل بنية معدلة وراثيا فريدة10. وبعيدا عن بناء الجينات المحورة، كان التكامل الجينومي، وانتقال الخط الجرثومي، وفحص التكامل السليم لجينات التحوير أمرا صعبا أيضا. هنا ، نصف بروتوكولا لاستخدام نظام التحوير Tol2 القائم على الترانسبوزون (Tol2Kit) 10,11. يستخدم هذا النظام المعياري استنساخ بوابة متعددة المواقع لإنشاء تركيبات متعددة معدلة وراثيا بسرعة من مكتبة دائمة التوسع من متجهات "الدخول" و "الوجهة". تزيد عناصر Tol2 المدمجة القابلة للنقل بشكل كبير من معدل الجينات المحورة ، مما يسمح بالبناء السريع والتكامل الجيني لجينات التحوير المتعددة. باستخدام هذا النظام ، نوضح كيف يمكن استخدام توليد خط الزرد المعدل وراثيا للأديم الباطن لدراسة العيوب الهيكلية الخاصة بالأنسجة الكامنة وراء FASD. في النهاية ، في هذا البروتوكول ، نظهر أن الإعداد المعياري وبناء التركيبات المعدلة وراثيا سيساعد بشكل كبير في أبحاث FASD القائمة على الزرد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تربية وتربية جميع أجنة الزرد المستخدمة في هذا الإجراء وفقا لبروتوكولات IACUC12 المعمول بها. تمت الموافقة على هذه البروتوكولات من قبل جامعة لويزفيل.

ملاحظة: تم استخدام سلالة الزرد من النوع البري ، AB ، وخط bmp4st72 ؛ smad5b1100 المزدوج الطافر في هذه الدراسة. كل المياه المستخدمة في هذا الإجراء كانت مياه التناضح العكسي المعقمة. تم التقاط الصور متحدة البؤر تحت مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. تم إجراء قياسات الأديم الباطن باستخدام أداة القياس في ImageJ. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام البرامج الإحصائية.

1. صنع الحلول والوسائط

  1. الوسائط البكتيرية: قم بإذابة مرق LB أو أجار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، والأوتوكلاف. قبل صب الوسائط في أطباق بتري 100 مم ، أضف إما الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) ، كاناميسين (50 ميكروغرام / مل) ، أو مزيج الأمبيسلين / الكلورامفينيكول (50 ميكروغرام / مل و 30 ميكروغرام / مل ، على التوالي).
  2. لعمل 20x مخزون وسائط جنينية ، قم بإذابة ما يلي في 1 لتر من الماء: 17.5 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.75 جم من KCl ، 2.9 جم من CaCl 2 ، 0.41 جم من K 2 HPO 4 ، 0.142 جم من Na 2 HPO 4 ، و4.9 جم من MgSO 4 · 7H 2O. قم بتصفية وتعقيم محلول المخزون باستخدامنظام ترشيح فراغ 0.22 ميكرومتر ، ويحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تجاهل الراسب الأبيض الذي يتشكل; هذا لن يؤثر على وسائل الإعلام.
  3. في 19 لترا من الماء ، قم بإذابة 1.2 جم من NaHCO3 وأضف 1 لتر من مخزون وسائط الجنين 20x لتوليد محلول وسائط الجنين العامل ، والحفاظ على هذا المحلول عند 28 درجة مئوية.
  4. للحصول على محلول الفينول الأحمر بنسبة 2٪ ، قم بإذابة 20 مجم من ملح الفينول الأحمر الصوديوم في 1 مل من الماء الخالي من RNase ، واحفظه في درجة حرارة الغرفة.

2. قوالب حقن الجنين

  1. لعمل صفيحة حقن الأغاروز ، قم بإذابة الأغاروز في وسط الجنين إلى تركيز نهائي قدره 3٪ عن طريق التسخين حتى الغليان.
  2. صب 50 مل من الأغاروز في أطباق بتري 100 مم ، وبينما لا يزال الأغاروز سائلا ، ضع قالب الحقن برفق في الأغاروز لمنع تكوين الفقاعة تحت القالب.
  3. دع ألواح الأغاروز تبرد. بمجرد أن يصبح الأغاروز صلبا ، قم بإزالة قالب الحقن وتخزينه على حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

3. ماصات الحقن

  1. اسحب الشعيرات الدموية مقاس 1.0 مم (OD) التي تحتوي على خيوط إلى إبر باستخدام مجتذب ماصة عمودي مع ضبط الملف اللولبي على 2.5 وضبط عنصر التسخين على 14.6.
    ملاحظة: أي مجتذب ساخن سيعمل إذا سحب الشعيرات الدموية إلى إبرتين نظيفين ومتساويين ، ولكن يجب سحب إبر الحقن في غضون 1 أسبوع من حقن أجنة الزرد للحصول على نتائج حقن متسقة.
    1. ضع الشعيرات الدموية في الساحب ، وشد المشبك في كل طرف ، ثم قم بتنشيط عنصر التسخين.
    2. اسحب الشعيرات الدموية لإنشاء إبرتين للحقن.
    3. قم بإزالة الشعيرات الدموية من الساحب ، وقم بتخزينها في طبق بتري فارغ مع شريط من طين النمذجة الذي يعمل كحامل للإبرة.

4. إعداد ترانسبوزاز mRNA

  1. خطي البلازميد Tol2Kit الذي يحتوي على ترانسبوزاز مع نوكلياز داخلي لتقييد NotI من خلال الجمع بين ما يلي في أنبوب طرد مركزي دقيق 0.5 مل: 10 ميكرولتر من بلازميد ترانسبوزاز (150 نانوغرام / ميكرولتر) ، 1.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل نوكلياز التقييد ، 0.3 ميكرولتر من نوكلياز NotI.
  2. املأ التفاعل حتى 20 ميكرولتر بالماء الخالي من RNase ، ثم اخلطه واهضمه عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  3. أوقف هضم الترانسبوزاز بإضافة 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (درجة الحموضة 8.0) ، 2 ميكرولتر من 5 M NH4OAc ، و 80 ميكرولتر من 100٪ EtOH إلى تفاعل الهضم ، ثم اخلطها واتركها تبرد عند -20 درجة مئوية طوال الليل.
  4. قم بطرد المحلول عند 14000× جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الحمض النووي في ماء خال من RNase.
  5. حدد تركيز البلازميد الخطي بالنانوجرام لكل ميكرولتر (نانوغرام / ميكرولتر) باستخدام مقياس الفلورومتر عن طريق تشغيل 2 ميكرولتر أولا من فراغ ماء خال من RNase ثم تشغيل 2 ميكرولتر من البلازميد الخطي.
    ملاحظة: تتراوح تركيزات البلازميد عادة بين 100-200 نانوغرام / ميكرولتر
  6. قم بإعداد إنتاج SP6 mRNA من خلال الجمع بين المكونات التالية بالترتيب في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل: 10 ميكرولتر من 2x NTP / CAP ، 2 ميكرولتر من محلول تفاعل 10x ، 0.1-1 ميكروغرام من قالب الحمض النووي الخطي ، و 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم SP6.
  7. املأ التفاعل حتى 20 ميكرولتر بالماء الخالي من RNase ، ثم اخلطه واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  8. بعد الحضانة لمدة 2 ساعة ، أضف 1 ميكرولتر من DNase ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية.
  9. لإيقاف تفاعل SP6 ، أضف 30 ميكرولتر من محلول ترسيب LiCl إلى أنبوب التفاعل ، ثم اخلطه واتركه يبرد عند -20 درجة مئوية طوال الليل.
  10. قم بطرد المحلول عند 14000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتكوير mRNA ، ثم استنشاق المادة الطافية وغسل حبيبات mRNA ب 1 مل من 80٪ EtOH (مخفف بالماء الخالي من RNase).
  11. جهاز طرد مركزي المحلول عند 14000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتكوير mRNA ، ثم استنشاق المادة الطافية. اترك الحبيبات تجف في الهواء.
  12. أعد تعليق حبيبات mRNA في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، وحدد تركيز mRNA بالنانوجرام لكل ميكرولتر (نانوغرام / ميكرولتر) باستخدام مقياس الفلور كما هو موضح في الخطوة 4.5 (يجب أن يكون 100 نانوغرام / ميكرولتر على الأقل) ، والقسمة 100 نانوغرام من mRNA لكل أنبوب للاستخدام الفردي ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: للتأكد من عدم تحلل mRNA ، يمكن تشغيل 2 ميكرولتر من mRNA بسرعة على هلام الرحلان الكهربائي للحمض النووي لتأكيد نطاق واحد عند 1,950 بت في الثانية.

5. استنساخ بوابة متعددة المواقع لإنشاء ناقلات دخول لجينات التحوير

ملاحظة: تم تعديل هذا البروتوكول من Kwan et al.10 ، مع تفاعل LR مكتوب كتفاعل نصف LR وبحجم إجمالي قدره 5 ميكرولتر. لتوليد عناصر دخول جديدة ، يجب استخدام تفاعلات BP باستخدام ناقلات المانحين 5 'و 3' و 3 '10,13.

  1. لإجراء التفاعل ، اجمع 10 fmol لكل من p5E و pME و p3E و 20 fmol من المتجه الوجهة (pDest).
    ملاحظة: تستخدم إعادة التركيب LR متعددة المواقع أربعة متجهات بلازميدية مختلفة: متجه دخول 5 بوصات (p5E) ، وناقل دخول متوسط (pME) ، ومتجه دخول 3 بوصات (p3E) ، وناقل وجهة (pDest) ، لتوليد بنية معدلة وراثيا فريدة محاطة بتكرارات Tol2 جاهزة للحقن في أجنة الزرد.
    1. حدد حجم جميع المتجهات الأربعة في أزواج القواعد من مصدر البلازميد (الجدول 1 ، Tol2Kit Wiki صفحة14 أو Addgene11 ؛ انظر جدول المواد).
      ملاحظة: بالنسبة للمتجهات الجديدة ، يمكن أن يوفر تسلسل البلازميد الكامل عبر شركات التسلسل التجاري حجم البلازميد الدقيق في بت في الثانية.
    2. أوجد تركيز جميع المتجهات الأربعة بالنانوجرام لكل ميكرولتر (نانوغرام/ميكرولتر) باستخدام مقياس الفلورومتر، كما هو موضح في الخطوة 4.5.
    3. باستخدام وزن الحمض النووي ك 660 جم / مول وحجم البلازميد (في بت في الثانية) ، احسب إجمالي النانوجرام (نانوغرام) من البلازميد اللازم للوصول إما إلى 10 fmol (متجهات الدخول) أو 20 fmol (متجه الوجهة).
      figure-protocol-1
      ملاحظة: أنشأ مختبر Mosimann في جامعة كولورادو ، حرم أنشوتز الطبي ، جدول بيانات متاحا مجانا لحساب كمية البلازميد اللازمة (بالنانوغرام) وحجم (بالميكرولتر) من المتجهات اللازمة في تفاعل LR15.
  2. لإنشاء البنية الموضحة أدناه ، sox17: EGFPCAAX ، استخدم المتجهات التالية: ناقل p5E يحتوي على مروج الزرد sox17 ، وهو 6,918 bp في الحجم16 ؛ ناقل pME يحتوي على EGFP prenylated ، وهو 3,345 bp في الحجم10 ؛ متجه p3E يحتوي على تسلسل إشارة SV40 المتأخر بولي A ، والذي يبلغ حجمه 2,838 نقطة أساس في الحجم10 ؛ و pDest ، وهو 5,883 bp في الحجم10.
  3. باستخدام تركيز البلازميد المحدد في الخطوة 5.1.2 والكمية بالنانوجرام (نانوغرام) لكل متجه (الخطوة 5.1.3) ، احسب إجمالي الميكرولتر (ميكرولتر) لكل بلازميد مطلوب للوصول إما إلى 10 fmol (متجهات الدخول) أو 20 fmol (متجه الوجهة) ، ثم قسم هذا على اثنين للاستخدام في تفاعلات نصف LR 5 ميكرولتر (جميع القيم المذكورة أدناه مدرجة في الجدول 2).
    figure-protocol-2
    1. لتوليد 10 fmol من p5E-sox17 ، استخدم 45.66 نانوغرام (بتركيز 140.3 نانوغرام / ميكرولتر) وخفف بالماء المعقم بعامل 4 للحصول على 0.65 ميكرولتر.
    2. لتوليد 10 fmol من pME-EGFPCAAX ، استخدم 22.08 نانوغرام (بتركيز 213.5 نانوغرام / ميكرولتر) وقم بتخفيفه بالماء المعقم بعامل 10 للحصول على 0.52 ميكرولتر.
    3. لتوليد 10 fmol من p3E-poly A ، استخدم 15.73 نانوغرام (بتركيز 276.1 نانوغرام / ميكرولتر) وقم بتخفيفه بالماء المعقم بعامل 20 للحصول على 0.57 ميكرولتر.
    4. بالنسبة ل 20 fmol من المتجه الوجهة ، استخدم 77.66 ng من pDest (بتركيز 307.3 نانوغرام / ميكرولتر) وخفف بالماء المعقم بمعامل 5 للحصول على 1.63 ميكرولتر.
  4. لإعداد تفاعل نصف LR 5 ميكرولتر ، اجمع بين أحجام p5E و pME و p3E و pDest المحددة في الخطوة 5.3 في أنبوب طرد مركزي دقيق 0.5 مل ، ثم أضف الماء المعقم للوصول إلى حجم تفاعل إجمالي يبلغ 4 ميكرولتر.
  5. دوامة بقوة يخلط إنزيم LR 2x لمدة دقيقة واحدة لكل منهما لضمان الخلط المناسب ، ثم أضف 1 ميكرولتر إلى التفاعل واخلطه جيدا.
  6. احتضان في 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها (16+ ساعة).
  7. أوقف تفاعل LR بإضافة 0.5 ميكرولتر من البروتيناز K (2 ميكروغرام / ميكرولتر) ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  8. قم بتحويل 3-4 ميكرولتر من البلازميد إلى خلايا مذابة ومختصة كيميائيا عن طريق إضافة البلازميد وترك الخلايا تجلس على الجليد لمدة 25-30 دقيقة.
  9. بينما تجلس الخلايا على الجليد ، قم بتسخين لوحين من أجار LB-ampicillin إلى درجة حرارة الغرفة.
  10. قم بصدمة الخلايا الحرارية في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية بالضبط.
  11. بعد الصدمة الحرارية ، أضف 250 ميكرولتر من الوسائط السائلة الغنية الخالية من المضادات الحيوية إلى الخلايا ، واحتضانها بالاهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  12. انشر 300 ميكرولتر من البكتيريا على طبق أمبيسلين واحد ، واحتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  13. في صباح اليوم التالي ، قم بفحص المستعمرات بحثا عن وجود نمطين ظاهريين ، واضحين وغير شفافين ، واختر المستعمرات الصافية (كما هو موضح في Kwan et al.10) واحدة تلو الأخرى ، وقم بتلقيح الثقافة السائلة ، ثم رجها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: تحتوي المستعمرات الواضحة دائما على مستعمرة LR الصحيحة (>85٪ من الوقت).
  14. باستخدام مجموعة تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، قم بإجراء تحضير البلازميد على كل مزرعة سائلة، وقم بهضم كل بلازميد تشخيصيا لتأكيد الحجم المناسب للبنية المعدلة وراثيا، مما يشير إلى أن تفاعل بوابة LR قد عمل بشكل صحيح.
  15. إعادة تحويل التركيبات المعدلة وراثيا الصحيحة باستخدام بروتوكول التحول البكتيري القياسي كما هو موضح في الخطوات 5.4-5.12 باستخدام 0.5-1 ميكرولتر من البلازميد ، واحتضانها فقط عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  16. أعد خط المستعمرات ، وتأكد من أن لكل منها بنية LR المعدلة وراثيا كما في الخطوة 5.14.
  17. تحديد تركيز البلازميد كما هو موضح في الخطوة 4.5 (يلزم ما لا يقل عن 150 نانوغرام / ميكرولتر لحقن الجنين).

6. حقن الجينات المحورة في الأجنة

  1. قم بإذابة عينة mRNA transposase ذات الاستخدام الواحد وبنية Tol2 المعدلة وراثيا على الجليد وحذر مسبقا من لوحة حقن الأغاروز إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. الجمع بين ما يلي على الجليد: 150 نانوغرام من البلازميد ، 100 نانوغرام من ترانسبوزاز mRNA ، و 2٪ الفينول الأحمر (0.3 ميكرولتر). ثم أضف الماء الخالي من الحمض النووي الريبي لتعويض الحجم إلى 3 ميكرولتر.
  3. انقل أجنة مرحلة خلية واحدة باستخدام ماصات النقل إلى لوحة الحقن (الموضحة في الخطوة 2) المملوءة ب EM الذي يغطي الأجار بالكامل ، ثم اضغط برفق على ما يقرب من 50-75 جنينا لكل فتحة من لوحة الحقن.
  4. أضف خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر إلى الطرف المفتوح لإبرة الحقن الشعري ، ضع الإبرة الشعرية في حديد التسليح بجهاز الحقن ، وقم بتشغيل جهاز الحقن.
    ملاحظة: يستخدم جهاز الحقن الغاز المضغوط ، مثل الهواء ، لنبض الحجم المطلوب (الموصوف في الخطوة 6.5) من خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر في الجنين عند تنشيطه.
  5. اخفض الإبرة الشعرية في EM للوحة الحقن ، وكسر الطرف باستخدام ملقط للسماح بضخ كمية صغيرة فقط من خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر بواسطة جهاز الحقن.
  6. حقن الأجنة ببلعة صغيرة 3 nL من خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر في جسم خلية الجنين.
    ملاحظة: بلعة 3 nL هي حجم من خليط mRNA / البلازميد / الفينول الأحمر حيث يمكن أن تتناسب سبع بلعات نظريا بالتساوي عبر خط الوسط للجنين.
  7. عند الانتهاء من حقن الأجنة ، قم بإزالتها من لوحة الحقن عن طريق إخراجها برفق من الفتحة ونقل ماصة إلى طبق بتري 100 مم مع EM طازج (حوالي 40 مل) ، ثم احتضانها عند 28.5 درجة مئوية للسماح للأجنة بالنمو.

7. فحص الأجنة لإدخالها في علم الوراثة

  1. للتعبير عن البروتينات الفلورية ، اختر المرحلة التنموية المناسبة عندما يجب التعبير عن جين التحوير الفلوري ، وفحص وجود مضان تحت مجهر تشريح الفلورسنت.
    ملاحظة: ستكون هذه الأجنة فسيفساء في تعبيرها وتظهر إدخالا جينوميا للبنية المعدلة وراثيا.
  2. فحص الجينات المحورة غير الفلورية عن طريق فحص علامة محورة وراثيا فلورية (كما هو موضح في الخطوة 7.1) ، مثل GFP مدفوعا من قبل المروج الخاص بالقلب للجين cmlc2 أو mCherry مدفوعا بواسطة المروج الخاص بالعدسة ل αcyrstallin ، والتي توجد في ناقلات وجهة متميزة.
  3. السماح للأجنة الإيجابية للإدخال المعدل وراثيا بالتطور الكامل إلى مراحل الزرد البالغة.
  4. بمجرد وصول الأسماك المعدلة وراثيا المحتملة إلى سن التكاثر ، قم بفحصها بشكل فردي بحثا عن كل من انتقال الخط الجرثومي والتعبير الجيني عن طريق تربيتها إلى أسماك الزرد من النوع البري.
  5. يتم الاحتفاظ بالبالغين الذين تنمو أجنةهم بشكل طبيعي وتعطي أقوى وأنسب تعبير عن الجينات المحورة كخطوط فريدة من نوعها لأسماك الزرد المعدلة وراثيا للعمل والتحليلات المستقبلية.
    ملاحظة: كنهج بديل لفحص الإدخال الجينومي للتركيبات المعدلة وراثيا ، صمم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تضخم فقط البنية المعدلة وراثيا وليس الحمض النووي من النوع البري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوليد التركيبات المعدلة وراثيا ، استخدمنا نظام التحوير Tol2. تم استخدام ثلاثة ناقلات دخول ، بما في ذلك p5E ، الذي يحمل عناصر المروج / المحسن للجين ، pME ، الذي يحمل الجين المراد التعبير عنه بواسطة عناصر المروج / المحسن ، و p3E الذي يحمل ، على الأقل ، ذيل polyA ، لتوليد البنية المعدلة وراثيا عبر استنساخ LR متعدد المواقع. يوفر ناقل الوجهة ، pDest ، تكرارات Tol2 للإدخال الجيني للبنية المعدلة وراثيا في أجنة الزرد ويحتوي على جميع المعلومات الوراثية الأساسية لنمو البكتيريا (الشكل 1 أ). ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتبر الزرد مناسبا بشكل مثالي لدراسة تأثير التعرض للإيثانول على حالات النمووالمرض 7,8. ينتج الزرد أعدادا كبيرة من الأجنة الشفافة والمخصبة خارجيا والقابلة للسحب وراثيا ، مما يسمح بالتصوير الحي للعديد من الأنسجة وأنواع الخلايا الموسومة بالجينات المحورة في وقت واحد في سياقات بيئية متعددة19,20. هذه القوة ، جنبا إلى جنب مع الحفظ الوراثي التنموي القوي مع البشر ، تجعل الزرد نظاما نموذجيا قويا لتصوير تأثير الإيثا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم البحث المقدم في هذه المقالة بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول (NIH / NIAAA) R00AA023560 إلى C.B.L.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صندوق أدوات Addgene Tol2https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
الهواءيتم توفيره مباشرة من قبل الجامعة
AmpicillinFisher ScientificBP1760
الميزان التحليليVWR10204-962
Borosil 1.0 مم OD × 0.75 مم معرف الشعيرات الدمويةFHC30-30-0
كلوريد الكالسيومVWR97062-590
كلورامفينيكولبيوفيجن2486
EDTAفيشر ScientificBP118-500
مجهر تشريح الفلورسنتأوليمبوسSZX16
كاناميسينفيشر ScientificBP906
مجهر متحد البؤر بالمسح بالليزرأوليمبوسFluoview FV1000
Lawson Lab مانح البلازميد الإعداديةhttps://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB AgarFisher ScientificBP9724
LB مرقفيشر ScientificBP1426
منخفض EEO / متعدد الأغراض / بيولوجيا جزيئية درجة AgaroseFisher ScientificBP160-500
LR كلوناز II Plus إنزيمفيشر12538200
كبريتات المغنيسيوم (هيبتاهيدرات) فيشرساينتفيكM63-500
حامل ماصة صغيرةالأجهزة العلمية التطبيقيةMIMPH-M-PIP
أنبوب الطرد المركزي الدقيق 0.5 مل & nbsp ؛VWR10025-724
أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل & nbsp ؛VWR10025-716
جهاز المعالجة الدقيقةالأجهزة العلمية التطبيقيةMM33
نصائح الماصة الدقيقة 10 & mu ؛ L فيشر 13611106
العلماء نصائح الماصة الدقيقة 1000 مو ؛ L 13611127
علمية أطراف الماصات الدقيقة 200 مو ؛ L فيشر ساينتفيك13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6فيشر ScientificAM1340
Mosimann Lab Tol2https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
الطيف الضوئي NanoDropNanoDrop NanoDropND-1000
NcoINEBR0189S
NotINEBR0189S
أطباق بتري 100 مم  فيشر ساينتفيكFB012924
الفينول ملح الصوديوم الأحمرسيجما ألدريتشP4758-5G
Pipetman L p1000L MicropipetteGilsonFA10006M
Pipetman L p200L MicropipetteGilsonFA10005M
Pipetman L p2L MicropipetteGilsonFA10001M
كلوريد البوتاسيومفيشر ScientificP217-500
فوسفات البوتاسيوم (ثنائي الأساسي)VWRBDH9266-500G
حاقن الضغطالأجهزة العلمية التطبيقيةMPPI-3
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
بيكربونات الصوديومVWRBDH9280-500G
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS271-500
فوسفات الصوديوم (ثنائي الأساسي)فيشر ScientificS374-500
Stericup .22 & micro; م نظام الترشيح الفراغي MilliporeSCGPU11RE
Tol2 Wiki Pagehttp://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 المختصة كيميائيا E. القولونية< / em>فيشر العلميC404010
مجتذب الماصةالعمودي ديفيد كوبف إنسترولز720
قالب الحقن الدقيق لأسماك الزردأدوات العلوم التكيفيةi34
العلميةفيشر ورقة عمل الحساب مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460(2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
  14. The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
  15. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  16. Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  17. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  18. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  19. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).
  20. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  22. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  23. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  24. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  25. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Tol2 Gateway

مقالات ذات صلة