Method Article

تحليل عينات جذمور Cyperi الخام والمعالجة باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة في الفئران المصابة بعسر الطمث الأولي

DOI:

10.3791/64691

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم تقديم تحليل مقارن لعينات جذمور Cyperi الخام والمعالجة (CR) باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي الترادفي عالي الدقة للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (UPLC-MS / MS) في الفئران المصابة بعسر الطمث الأولي. تم فحص التغيرات في مستويات الدم من المستقلبات ومكونات العينة بين الفئران المعالجة ب CR و CR المعالجة بالخل (CRV).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم Cyperi rhizoma (CR) على نطاق واسع في أمراض النساء وهو دواء عام لعلاج أمراض النساء في الصين. نظرا لأن التأثير المسكن ل CR يتم تعزيزه بعد المعالجة بالخل ، فإن CR المعالج بالخل (CRV) يستخدم بشكل عام سريريا. ومع ذلك ، فإن الآلية التي يتم من خلالها تعزيز التأثير المسكن عن طريق معالجة الخل غير واضحة. في هذه الدراسة ، تم استخدام تقنية قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة ذات الضغط العالي للغاية (UPLC-MS / MS) لفحص التغيرات في مستويات الدم للمكونات الخارجية والمستقلبات بين الفئران المعالجة ب CR والمعالجة ب CRV المصابة بعسر الطمث. كشفت النتائج عن مستويات مختلفة من 15 مكونا واثنين من المستقلبات في دم هذه الفئران. من بينها ، كانت مستويات (-) -myrtenol و [(1R ، 2S ، 3R ، 4R) -3-hydroxy-1،4،7،7-tetramethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl] حمض الخليك في مجموعة CRV أعلى بكثير منها في مجموعة CR. خفضت CRV مستوى البروستانويدات من السلسلة 2 و 4 من الليكوترينات مع أنشطة الالتهاب وتراكم الصفائح الدموية وتضيق الأوعية وقدمت تأثيرات مسكنة عن طريق تعديل حمض الأراكيدونيك واستقلاب حمض اللينوليك والتخليق الحيوي للأحماض الدهنية غير المشبعة. كشفت هذه الدراسة أن معالجة الخل تعزز التأثير المسكن ل CR وتساهم في فهمنا لآلية عمل CRV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عسر الطمث الأولي (PD) هو الحالة الأكثر انتشارا في أمراض النساء السريرية. يتميز بألم الظهر أو التورم أو آلام البطن أو عدم الراحة قبل أو أثناء الحيض دون أمراض الحوض في الجهاز التناسلي1. أظهر تقرير عن انتشاره أن 85.7٪ من الطلاب يعانون من PD2. موانع الحمل الفموية منخفضة الجرعة هي العلاج القياسي ، لكن آثارها الجانبية الضارة ، مثل تجلط الأوردة العميقة ، جذبت اهتماما متزايدا3. يبلغ معدل انتشار تجلط الأوردة العميقة بين مستخدمي وسائل منع الحمل عن طريق الفم >1 لكل 1000 امرأة ، ويكون الخطر أعلى خلال الأشهر 6-12 الأولى وفي المستخدمين الذين تزيد أعمارهم عن 40 عاما4.

يستخدم Cyperi rhizoma (CR) منذ فترة طويلة في الطب الصيني التقليدي (TCM) ، وهو مشتق من جذمور مجفف من Cyperus rotundus L. من عائلة Cyperaceae. ينظم CR اضطرابات الدورة الشهرية ويخفف من الاكتئاب والألم5. يستخدم CR على نطاق واسع في أمراض النساء ويعتبر دواء عام لعلاج أمراض النساء6. عادة ما يتم استخدام CR المعالج بالخل (CRV) سريريا. بالمقارنة مع CR ، يظهر CRV تنظيما معززا للحيض وتخفيف الآلام. أظهرت الدراسات الحديثة أن CR يثبط انزيمات الأكسدة الحلقية -2 (COX-2) والتوليف اللاحق للبروستاجلاندين (PGs) ، وبالتالي تحقيق تأثير مضاد للالتهابات. وفي الوقت نفسه ، يظهر CR تأثيرا مسكنا بدون آثار جانبية7 ، مما يجعل CR خيارا جيدا لمرضى عسر الطمث. ومع ذلك ، فإن الآلية الكامنة وراء تنظيم الحيض وتوفير تخفيف الآلام بواسطة CRV غير واضحة. ركزت أبحاث CR بشكل أساسي على التغيرات في مكوناتها الكيميائية النشطة وأنشطتها الدوائية ، مثل آثارها المضادة للالتهابات ومضادات الاكتئاب والمسكنات8،9،10،11،12.

على الرغم من أن مكونات الطب الصيني التقليدي معقدة ، إلا أنها تمتص في الدم ويجب أن تصل إلى تركيز دم معين لتكون فعالة13. يمكن تضييق نطاق فحص المكونات النشطة للطب الصيني التقليدي من خلال استخدام استراتيجية تحديد المكونات في الدم. يمكن تجنب العمى في دراسة المكونات الكيميائية في المختبر ، ويمكن تجنب جانب واحد في دراسة المكونات الفردية14. من خلال مقارنة تركيبات CR و CRV في الدم ، يمكن اكتشاف التغييرات في المكونات النشطة ل CR المعالج بشكل فعال وسريع. فعالية الدواء هي العملية التي يؤثر بها الدواء على الجسم. يمكن تحديد التغييرات في مكونات الدواء بسبب الاستجابة الأيضية للجسم ، والتي قد تكون مرتبطة بآلية عمل الدواء ، باستخدام الأيض. يهدف الأيض إلى قياس الاستجابات الأيضية الشاملة والديناميكية ، والتي تتوافق مع تحديد الفعالية الكلية للطب الصيني التقليدي15. علاوة على ذلك ، فإن المستقلبات هي المنتج النهائي للتعبير الجيني ، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا بالأنماط الظاهرية16. وبالتالي ، قد تكون الأيضات مناسبة لاستكشاف الاختلافات في المسارات الأيضية بين CR و CRV في علاج مرض باركنسون. تتميز الأيضات غير المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي الترادفي عالي الدقة (LC-MS / MS) القائمة على الكروماتوغرافيا السائلة بالإنتاجية العالية والحساسية العالية والدقة العالية ويمكن استخدامها لقياس العديد من المكونات الجزيئية الصغيرة المختلفة17,18 . يمكن لهذه الطريقة تحديد المستقلبات الداخلية والمكونات الخارجية التي يتم امتصاصها في الدم في وقت واحد. تم استخدام الأيض على نطاق واسع في الدراسات التي أجريت على الطب الصيني التقليدي19 ، وعلم السمومالدوائية 20 ، والإدارة الصحية 21 ، والرياضة22 ، والغذاء23 ، وغيرها من المجالات.

في هذه الدراسة ، تم قياس الاختلافات في المكونات الخارجية الممتصة في الدم والمستقلبات الداخلية بين الفئران النموذجية لعسر الطمث المعالجة ب CR والمعالجة ب CRV باستخدام الأيض غير المستهدف القائم على LC-MS / MS للكشف عن آليات التأثيرات المسكنة ل CRV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب المتعلقة بالحيوان بموافقة من لجنة أخلاقيات التجارب في معهد تشونغتشينغ للطب الصيني التقليدي. تم استخدام أربعة وعشرين أنثى من فأر Sprague Dawley (SD) التي كان عمرها 8-10 أسابيع ووزنها 200 جم ± 20 جم في هذه التجربة.

1. إعداد الاستخراج

  1. حساب
    1. خطط لإدارة مستخلص CR أو CRV لمجموعة علاج مكونة من ستة فئران Sprague-Dawley (10 جم / [كجم ∙day]) لمدة 3 أيام. استخدم مستخلص CR أو CRV بتركيز 1 جم / مل (يتم الحصول على 1 مل من المستخلص من 1 جم من الأعشاب).
      ملاحظة: جرعة CR هي 6-10 جم. في هذه الدراسة ، تم استخدام الجرعة القصوى من 10 غرام كجرعة. نظرا لأن متوسط وزن الشخص البالغ هو 60 كجم ، فإن جرعة البالغين هي 0.1667 جم / كجم. وفقا لخوارزمية تحويل الوزن24 ، حيث أن معامل تحويل الجرعة بين البشر والجرذان هو 6.3 ، فإن جرعة الفئران هي 1.05 جم / كجم. تمت زيادة جرعة الدواء بمقدار 10 مرات إلى 10.5 جم / كجم للفئران. تم تحديد الجرعة على أنها 10 جم / كجم لتسهيل الحساب والتجربة الفعلية. على سبيل المثال ، من خلال الحساب ، إذا كانت هناك حاجة إلى ما مجموعه 36 جم من CR أو CRV ، فيجب تحضير الأدوية العشبية الصينية مرتين على الأقل. وبالتالي ، كان مطلوبا 200 غرام من CR - تم استخدام 100 غرام من CR كسجل تجاري ، وتم معالجة 100 غرام من CR في CRV.
    2. احسب حجم CR أو CRV المراد تطبيقه لكل فأر باستخدام المعادلة (1):
      V = 10 جم / (كجم ∙ يوم) × 200 جم / (1 جم / مل) = 2 مل (1)
  2. معالجة CRV
    1. امزج 100 جم من CR و 20 جم من الخل (>5.5 جم حمض الأسيتيك / 100 مل) جيدا واحتضنها لمدة 12 ساعة.
      ملاحظة: للتأكد من ترطيب الجزء الداخلي من CR بالخل بعد 12 ساعة ، تم خلط CR والخل ، وتقليبه جيدا ، ثم تقليبه مرة أخرى حتى يصبح الجزء الداخلي رطبا.
    2. يقلب المزيج في مقلاة حديدية لمدة 10 دقائق على حرارة 110-120 درجة مئوية. ثم أخرجي الخليط واتركيه يبرد في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: لمنع احتراق CR ، من الضروري التقليب باستمرار أثناء التسخين. إذا كان CRV المعالج رطبا جدا ، فيمكن تجفيفه عند 60 درجة مئوية. عندما يكون سطح CR بني داكن ، يمكن إيقاف القلي السريع.
  3. إستخلاص
    1. استخراج CR
      1. أضف 10 مرات (كمية CR) من الماء النقي إلى CR ، وانقعها لمدة 2 ساعة. تأكد من أن المواد الطبية أقل من مستوى السائل عند النقع.
        ملاحظة: يجب قطع CR إلى النصف فقط قبل الاستخراج. الغرض من النقع هو استخراج المكونات النشطة بشكل أكثر فعالية. عملية النقع ضرورية.
      2. يغلى مزيج الماء والدواء على نار عالية ، ويترك يغلي على نار خفيفة لمدة 20 دقيقة. تصفية مع قطعة قماش مرشح (100 شبكة) ، وجمع المرشح.
        ملاحظة: عند الفك ، تم استخدام حرارة عالية قبل الغليان ، وتم استخدام حرارة منخفضة للحفاظ على الغليان.
      3. كرر الخطوة 1.3.1.2 مرة واحدة ، وادمج المرشحات.
      4. ركز المستخلص بمبخر دوار إلى 1 جم / مل (بناء على الدواء الأصلي ، يجب أن تكون درجة حرارة التركيز أقل من 60 درجة مئوية).
        ملاحظة: المكونات النشطة في CR متطايرة ، لذلك يجب ألا تزيد درجة حرارة التركيز عن 60 درجة مئوية.
    2. مستخلص CRV
      1. نفذ نفس الخطوات (1.3.1.1-1.3.1.3) لطريقة استخراج CR.
    3. استخراج CR للاختبار
      1. ماصة 500 ميكرولتر من مستخلص CR و 500 ميكرولتر من الميثانول في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، ودوامة لمدة 30 ثانية للخلط.
        ملاحظة: مزيج من الميثانول والماء يستخرج المكونات النشطة بشكل أفضل. لا ينبغي تصفية المستخلص مباشرة للاختبار.
      2. أجهزة الطرد المركزي كل عينة لمدة 15 دقيقة عند 16502 × جم عند 4 درجات مئوية. قم بتصفية المادة الطافية ، ثم انقلها إلى قارورة العينة للاختبار.
        ملاحظة: بعد الطرد المركزي عالي السرعة لخليط الميثانول والمستخلص ، يمكن نقل المادة الطافية مباشرة إلى زجاجة العينة لتحديدها دون ترشيح. بسبب الحرارة الناتجة عن عملية الطرد المركزي ، يفضل استخدام جهاز طرد مركزي مبرد.
    4. مستخلص CRV للاختبار
      1. نفذ الخطوات 1.3.3.1-1.3.3.2 لتحضير مستخلص CRV للاختبار.

2. الحيوانات

  1. حساب
    1. خذ 50 ملغ من بنزوات استراديول ، وأضفه إلى 50 مل من زيت الزيتون لتحضير محلول 1 ملغ / مل. تناول 50 ملغ من الأوكسيتوسين ، وأضفه إلى 50 مل من المحلول الملحي العادي لتحضير محلول 1 ملغ / مل.
      ملاحظة: جرعة الحقن داخل الصفاق من بنزوات استراديول والأوكسيتوسين هي 10 ملغ / (كجم ∙ يوم). يذوب بنزوات استراديول في زيت الزيتون ، ويذوب الأوكسيتوسين في محلول ملحي عادي. ليس من السهل إذابة استراديول بنزوات في زيت الزيتون ويمكن علاجه بالموجات فوق الصوتية لتسريع الذوبان. يجب تحضير كل من محاليل استراديول بنزوات والأوكسيتوسين يوميا.
    2. احسب حجم محلول بنزوات استراديول المراد تطبيقه لكل فأر (على سبيل المثال ، V = 10 مجم / [كجم ∙ يوم] × 200 جم / [1 جم / مل] = 2 مل). احسب حجم محلول الأوكسيتوسين المراد تطبيقه لكل فأر (على سبيل المثال ، V = 10 مجم / [كجم ∙ يوم] × 200 جم / [1 جم / مل] = 2 مل).
  2. تجميع الحيوانات وإدارتها
    ملاحظة: تم تخصيص عشرة أيام للإدارة25,26. أثناء العلاج ، كان لدى الفئران وصول غير مقيد إلى الطعام القياسي والماء. في غضون 30 دقيقة من إعطاء الأوكسيتوسين ، تم تتبع نشاط كل فأر يتلوى. تم تطوير نموذج الفئران PD بنجاح ، كما يتضح من استجابات التواء الفئران النموذجية ، والتي تضمنت تقلص الرحم ، ودوران طرف واحد ، وتمديد الطرف الخلفي ، وجذع مجوف ، وتقلص البطن26.
    1. قم بتعيين 24 أنثى من فأر Sprague-Dawley (فئران SD ، عمرها 8-10 أسابيع ، ويزن 200 جم ± 20 جم) في أربع مجموعات في التحكم العشوائي ، والنموذج ، و CR ، و CRV - وإطعامهم لمدة 7 أيام.
    2. إدارة الحيوان
      1. حقن الفئران داخل الصفاق في مجموعات النموذج و CR و CRV مع 2 مل من محلول بنزوات استراديول كل يوم. حقن الفئران داخل الصفاق في المجموعة الضابطة مع 2 مل من المياه المالحة العادية.
      2. من اليوم 8 ، أكمل الخطوة 2.2.2.1. بعد ذلك ، يتم تطبيق 2 مل من مستخلص CRV داخل المعدة للفئران في مجموعة CRV ، و 2 مل من مستخلص CR للفئران في مجموعة CR ، و 2 مل من المحلول الملحي العادي للفئران في مجموعات التحكم والنموذج.
      3. في اليوم 10 ، أكمل الخطوة 2.2.2.2. بعد ذلك ، حقن الفئران داخل الصفاق في مجموعات النموذج ، CR ، و CRV مع 2 مل من محلول الأوكسيتوسين والفئران في المجموعة الضابطة مع 2 مل من المحلول الملحي العادي.
    3. سجل أوقات التلوي للفئران في غضون 30 دقيقة من حقن الأوكسيتوسين.
  3. جمع العينات
    1. جمع عينات دم الشريان الأورطي البطني ، واستئصال الرحم بسرعة وبشكل كامل ، وفصل بعناية النسيج الضام والدهون الملتصقة بجدار الرحم.
      ملاحظة: تم جمع الدم في غضون 1 ساعة بعد الجرعة النهائية.
    2. استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة للحفاظ على أنسجة الرحم ونقلها إلى النيتروجين السائل. قم بتخزين عينات الأنسجة في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    3. أجهزة الطرد المركزي عينات الدم لمدة 10 دقائق في 4125 × غرام. قم بإزالة المادة الطافية المحتوية على المصل وأجهزة الطرد المركزي عند 16502 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بطرد المصل ، ثم احتفظ به في الأنبوب عند -80 درجة مئوية للتخزين.
      ملاحظة: يجب ترك عينات الدم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة لإعادة المعالجة.
  4. معالجة العينات
    1. عينات المصل
      1. ضع 400 ميكرولتر من الميثانول و 200 ميكرولتر من المصل في أنبوب طرد مركزي دقيق ، ودوامة لمدة 30 ثانية للخلط. أجهزة الطرد المركزي كل عينة لمدة 15 دقيقة عند 16502 × جم عند 4 درجات مئوية. املأ زجاجات العينات بالمادة الطافية بعد التجميع والترشيح. امزج جميع المواد الطافية من كل عينة بنفس الحجم لإعداد عينات مراقبة الجودة للاختبار.
    2. عينات أنسجة الرحم
      1. خذ 100 ملغ من أنسجة الرحم من الجزء المماثل وطحنها بحجم تسعة أضعاف من المياه المالحة الطبيعية. أجهزة الطرد المركزي المجانسة لمدة 10 دقائق عند 4125 × جم ، وجمع المادة الطافية. ضع المادة الطافية في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية للاختبار أو عند -80 درجة مئوية إذا لم يتم اختبارها في نفس اليوم.
      2. ضع المحلول الملحي العادي والأنسجة والكرات الفولاذية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل ، وضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق في النيتروجين السائل لمدة 3-5 ثوان ، ثم ضع الأنسجة في مطحنة الأنسجة للطحن.
  5. اختبار العينة
    1. استخدم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لقياس محتوى PGF2α و PGE2 في أنسجة الرحم لعينات الفئران.
      ملاحظة: تم استخدام مجموعة الفئران PGE 2 ELISA لقياس محتوى PGE 2 ، وتم استخدام مجموعة الفئران PGF 2α ELISA لقياس مستوى PGF2α. يمكن العثور على الخطوات التفصيلية في تعليمات الشركة المصنعة. وترد تفاصيل المجموعة في جدول المواد.
    2. قم بتقييم عينة المصل ومستخلص CR ومستخلص CRV باستخدام UPLC-MS / MS.
      1. بالنسبة ل UPLC ، استخدم عمود C18 (2.6 ميكرومتر ، 2.1 مم × 100 مم) وطريقة تدرج ثنائي مع المرحلة المتنقلة A التي تحتوي على 0.1٪ من حمض الفورميك والمرحلة المتنقلة B التي تحتوي على الأسيتونيتريل. اضبط تدرج الشطف على النحو التالي: من 0 دقيقة إلى 1 دقيقة ، 15٪ ب ؛ من 1 دقيقة إلى 8.5 دقيقة ، 15٪ إلى 85٪ ب ؛ من 8.5 دقيقة إلى 11.5 دقيقة ، 85٪ ب ؛ من 11.5 دقيقة إلى 11.6 دقيقة ، 99٪ إلى 1٪ ب ؛ ومن 11.6 دقيقة إلى 15 دقيقة ، 15٪ B. اضبط معدل التدفق على 0.35 مل / دقيقة وحجم الحقن على 2 ميكرولتر.
      2. بالنسبة ل MS ، اضبط درجة الحرارة على 600 درجة مئوية ، ومعدل تدفق غاز الستارة (CUR) على 0.17 ميجا باسكال ، ومعدلات تدفق كل من الغمد والغاز الإضافي على 0.38 ميجا باسكال. اضبط جهد الرش الأيوني لوضع الأيونات الموجبة ووضع الأيونات السالبة على 5.5 كيلو فولت و -4.5 كيلو فولت ، على التوالي ، جهد جهد إزالة التجميع (DP) على 80 فولت أو -80 فولت ، وطاقة الاصطدام (CE) على 40 فولت أو -25 فولت ، وتراكب طاقة الاصطدام (CES) على 35 فولت ± 15 فولت.
      3. قم بإجراء الاختبار باتباع بروتوكول الشركة المصنعة باستخدام UPLC-MS / MS. قم بإجراء MS لنطاق كتلة من 50-1000 م / ض.
      4. احصل على نتائج UPLC-MS/MS باستخدام برنامج محطة العمل المطابق جنبا إلى جنب مع اكتساب وضع الكشف المعتمد على المعلومات وعامل تصفية العيوب الجماعية المتعددة وخصم الخلفية الديناميكي. استخدم عينات مراقبة الجودة للمصل المجمع لاختبار قابلية تكرار واستقرار معدات UPLC-MS / MS للتحقق من النهج التقليدي. قبل عينات البحث ، قم بحقن عينات مراقبة الجودة لأربعة أشواط متتالية ، ثم حقنها بعد كل خمس عينات مصل.

3. معالجة البيانات

  1. إعداد البيانات
    1. استخدم برنامج التحويل لتحويل البيانات الأولية إلى تنسيق mzXML. تطبيع إجمالي بيانات التيار الأيوني (TIC) لكل عينة.
      ملاحظة: تم استخدام تطبيق داخلي قائم على R (www.lims2.com) مبني على XCMS لتحليل المعلومات الخاصة بالتكامل والمحاذاة والاستخراج واكتشافالذروة 27.
    2. قم بإجراء التعليق التوضيحي للمستقلب باستخدام قاعدة بيانات MS2 (www.lims2.com). اضبط حد التعليق التوضيحي على 0.328.
      ملاحظة: تم تحديد المستقلبات الداخلية في كل مجموعة.
  2. تحليل المكون الرئيسي والتحليل التمييزي الجزئي المتعامد للمربع الصغرى
    1. استخدم برنامج التحليل لإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) والنمذجة. استيراد البيانات الموحدة للمستقلبات إلى برنامج التحليل. بعد ذلك، استخدم الاحتواء التلقائي لإنشاء نموذج التحليل. أخيرا ، استخدم النتيجة للحصول على مخطط تشتت النتيجة ل PCA.
      ملاحظة: تم الحصول على تجميع كل مجموعة باستخدام مخطط تشتت النتيجة ل PCA. PCA هو وضع تحليل غير خاضع للإشراف يقوم بشكل أساسي بتجميع العينات من خلال تقليل الأبعاد دون تدخل.
    2. استخدم برنامج التحليل لإجراء التحليل التمييزي الجزئي المتعامد للمربع الأصغر (OPLS-DA).
      1. استيراد البيانات الموحدة على المستقلبات في مجموعات CR و CRV إلى برنامج التحليل.
      2. استيراد البيانات من مجموعة CR إلى مجموعة CR التي تم إنشاؤها ، واستيراد البيانات من مجموعة CRV إلى مجموعة CRV التي تم إنشاؤها.
        ملاحظة: OPLS-DA هو وضع تحليل خاضع للإشراف ، وتجميع العينات ضروري.
      3. بعد ذلك ، استخدم الاحتواء التلقائي لإنشاء نموذج التحليل ، واستخدم النتيجة للحصول على مخطط تشتت النتيجة ل OPLS-DA. أخيرا ، استخدم VIP للحصول على الأهمية المتغيرة في قيمة الإسقاط (VIP) في OPLS-DA.
        ملاحظة: تم الحصول على الدلالة المتغيرة في قيم الإسقاط (VIP) للمستقلبات في مجموعتي CR و CRV من خلال OPLS-DA.
  3. تحديد المستقلبات التفاضلية المحتملة
    1. احجب المستقلبات ذات قيم VIP أكبر من 1 في الخطوة 3.2.2.3.
    2. استخدم برنامجا إحصائيا لحساب قيمة P للمستقلبات التي تم فحصها في الخطوة 3.3.1 بواسطة اختبار t للطالب.
      ملاحظة: تم تحديد الاختلافات ذات الدلالة الإحصائية في المستقلبات التفاضلية المحتملة في مجموعتي CR و CRV بواسطة اختبار t للطالب. كانت المستقلبات التفاضلية المحتملة هي تلك التي لها قيمة p لاختبار t للطالب < 0.05 وأهمية متغيرة في الإسقاط (VIP) أكبر من 1. تم إنجاز التمثيل باستخدام مؤامرة بركانية.
  4. تحديد المستقلبات التفاضلية
    1. افحص المستقلبات التفاضلية المحتملة في الخطوة 3.3. استخدم نتائج الخطوة 3.1.2 لتحديد هذه الأيضات التفاضلية.
      ملاحظة: تم تحديد عدد صغير من المستقلبات التفاضلية المحتملة، وأصبحت المستقلبات التفاضلية المرشحة.
    2. قم بفحص المستقلبات التفاضلية المراد مطابقتها في قاعدة بيانات KEGG. أظهر التغييرات في المستقلبات التفاضلية في مجموعات CR و CRV عن طريق رسم خريطة حرارية.
      ملاحظة: تمت مطابقة عدد صغير من المستقلبات التفاضلية المرشحة ، وأصبحت المستقلبات التفاضلية.
  5. فحص المسارات الأيضية المحتملة
    1. قم بتحميل المستقلبات المختلفة إلى قاعدة بيانات Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. استخدم تحليل المسارات للحصول على المسارات الأيضية المحتملة.
      ملاحظة: تم الحصول على المسارات الأيضية المحتملة في مجموعات CR و CRV. كانت قيمة P وقيمة التأثير مؤشرين مهمين للغاية في اختيار المسارات الحرجة. كانت قيمة P أكثر أهمية من قيمة التأثير. تم تعريف الأهمية بقيمة P < 0.05 ؛ ارتبطت قيم التأثير الأكبر بارتباطات أفضل.
    3. تحليل المسارات الأيضية المحتملة عن طريق تحميل المستقلبات المختلفة إلى قاعدة بيانات KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      ملاحظة: يجب أيضا مراعاة العلاقة بين وظيفة المسار الأيضي ومرض باركنسون. تم الحصول على المسارات الأيضية الحرجة.
  6. تحديد المكونات الممتصة في الدم
    1. تحديد المكونات الكيميائية في مستخلصات CR و CRV باستخدام قاعدة بيانات MS2 الداخلية (www.lims2.com) ، وقاعدة بيانات الأيض البشري (HMDB) ، وقواعد بيانات Massbank و Chemspider.
    2. تحديد المكونات الممتصة في الدم في مجموعات CR و CRV ، ومقارنة المكونات بين مجموعات CR و CRV.
      ملاحظة: يجب الكشف عن المكونات الممتصة في الدم في مجموعات CR أو CRV ولكن لا يمكن اكتشافها في المجموعة الضابطة.
  7. التحليل الإحصائي
    1. تحليل البيانات باستخدام التحليل أحادي المتغير (UVA) والأساليب الإحصائية متعددة المتغيرات ، بما في ذلك تحليل التباين (ANOVA) واختبار t للطالب.
      ملاحظة: عرضت المعلومات التجريبية باستخدام برامجيات إحصائية كمتوسط ± الانحراف المعياري (±SD). P < 0.01 اعتبر فرقا ذا دلالة كبيرة ، و P < 0.05 يمثل فرقا كبيرا28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل تجربة نموذج عسر الطمث
لم تكن هناك استجابة متلوية في غضون 30 دقيقة في المجموعة الضابطة لأن هذه الفئران لم يتم حقنها داخل الصفاق بالأوكسيتوسين وبنزوات استراديول لتسبب الألم. أظهرت الفئران في مجموعات النموذج و CR و CRV تفاعلات تلوي كبيرة بعد حقن الأوكسيتوسين. توضح هذه النتائج فعالية تركيبة استراديول بنزوات والأوكسيتوسين لإحداث عسر الطمث. كانت الاختلافات في مستويات PGF 2α و PGE 2 و PGF2α / PGE 2 بين النموذج والمجموعات الضابطة كبيرة (P < 0.001 ، P < 0.0...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا للتنوع الواسع والطبيعة المختلفة للطب الصيني التقليدي ، لا تعمل هذه الأعشاب في بعض الأحيان في الممارسة السريرية ، وقد يكون هذا بسبب المعالجة غير المناسبة وتفكيك الطب الصيني التقليدي. أصبحت آليات الطب الصيني التقليدي أكثر وضوحا مع استخدام العلوم والتكنولوجيا المعاصرة29,30. تظهر هذه الدراسة أن كلا من CR و CRV لهما تأثيرات علاجية في الفئران النموذجية PD وأن التأثير العلاجي ل CRV أكثر جوهرية. يمكن أن تكون آلية عمل CRV مرتبطة بحقيقة أن معالجة الخل قد تؤثر على مكون...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع علوم وتكنولوجيا الطب الصيني التابع للجنة الصحة وتنظيم الأسرة في بلدية تشونغتشينغ (رقم المشروع: ZY201802297) ، والمشروع العام لمؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (رقم المشروع: cstc2019jcyj-msxmX065) ، وخطة بناء فريق ابتكار نظام التكنولوجيا الزراعية عالية الكفاءة المميزة لمنطقة تشونغتشينغ الجبلية الحديثة 2022 [10] ، ومشروع بناء الانضباط الرئيسي للجنة الصحة في بلدية تشونغتشينغ للمواد الصينية معالجة ميديكا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أسيتونيتريل  فيشر ساينتفيك، بيتسبرغ، بنسلفانيا، الولايات المتحدة الأمريكية197164
بيكمان كولتر ميكروفيوج 20بيكمان  شركة كولترMRZ15K047
استراديول بنزواتشنغهاي ماكلين للكيمياء الحيوية المحدودةC10042616
حمض الفورميكفيشر العلمية ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية177799
نظام LC 30Aشيمادزو ، كيوتو ، اليابان228-45162-46
زيت الزيتونشنغهاي Yuanye التكنولوجيا الحيوية المحدودةH25A11P111909
الأوكسيتوسين الاصطناعيةتشجيانغ الببتيد علم الأحياء المحدودة  2019092001
Rat PGF2α < / فرعي> مجموعة ELISAشنغهاي lmai الهندسة الحيوية المحدودة202101
الفئران PGFE2< / sub> مجموعة ELISAShanghai lmai Bioengineering Co., LtdEDL202006217
SPF Sprague-Dawley ratsHunan SJA Laboratory Animal Co., Ltdرقم الشهادة SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH ، النمسا1510002987
نظام Triple TOF 4600SCIEX ، فرامنغهام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةBK20641402
المياهفيشر العلمية ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية152720

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009(2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558(2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962(2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832(2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867(2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709(2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238(2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773(2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763(2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642(2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233(2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801(2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768(2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181(2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119(2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448(2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966(2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191(2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683(2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628(2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555(2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cyperi RhizomaVinegar ProcessingPrimary DysmenorrheaLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryMetabonomics AnalysisDifferential MetabolitesKEGG PathwayPrincipal Component AnalysisOrthogonal Partial Least Squares

Related Articles