مقالة منهجية

تحليل وتصوير الخلايا العظمية

DOI:

10.3791/64699

⸱

نوفمبر 29, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Science and Engineering, University of Missouri-Kansas City, 2Department of Oral and Craniofacial Sciences, School of Dentistry, University of Missouri-Kansas City

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدد هذه الدراسة طريقة تصور وتطوير نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) للخلايا العظمية داخل الشبكة الجوقرية القنوية (LCN) لتحليل ديناميكيات السوائل الحسابية (CFD). تساعد النماذج التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الطريقة على فهم الإحساس الميكانيكي للخلايا العظمية في العظام السليمة أو المريضة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العظمية هي خلايا العظام التي يعتقد أنها تستجيب للسلالات الميكانيكية وإجهاد قص تدفق السوائل (FFSS) عن طريق تنشيط مسارات بيولوجية مختلفة في عملية تعرف باسم النقل الميكانيكي. تعد النماذج المشتقة من الصور متحدة البؤر لشبكات الخلايا العظمية أداة قيمة لإجراء تحليل ديناميكيات السوائل الحسابية (CFD) لتقييم ضغوط القص على غشاء الخلايا العظمية ، والتي لا يمكن تحديدها عن طريق القياس المباشر. تم استخدام النمذجة الحسابية باستخدام هذه الصور عالية الدقة للبنية المجهرية للعظام لمحاكاة الحمل الميكانيكي الممارس على العظام عدديا وفهم التحفيز الناجم عن الحمل للخلايا العظمية.

توضح هذه الدراسة طرق تطوير نماذج خلية عظمية مفردة ثلاثية الأبعاد باستخدام صور المجهر متحد البؤر للشبكة اللاكونارية القناعية (LCN) لإجراء تحليل CFD باستخدام برامج النمذجة الحسابية المختلفة. قبل الفحص المجهري متحد البؤر ، يتم تقطيع عظام الفأر وتلطيخها بصبغة إيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC) لتسمية LCN. بدقة 100x ، يتم جمع صور Z-stack باستخدام مجهر متحد البؤر واستيرادها إلى برنامج MIMICS (برنامج معالجة قائم على الصور ثلاثية الأبعاد) لإنشاء نموذج سطحي لعمليات LCN والخلايا العظمية.

ثم يتم طرح هذه الأسطح باستخدام عملية منطقية في برنامج 3-Matic (برنامج تحسين البيانات ثلاثية الأبعاد) لنمذجة المساحة السائلة الثاقبة حول جسم الخلية العظمية والفضاء القني حول التشعبات التي تحتوي على سائل القناة الفراغية. يتم استيراد هندسة السوائل الحجمية ثلاثية الأبعاد إلى برنامج ANSYS (برنامج محاكاة) لتحليل CFD. يستخدم ANSYS CFX (CFD) لتطبيق الحمل الفسيولوجي على العظام كضغط سائل ، ويتم تحديد ضغوط قص الجدار على الخلايا العظمية والعمليات المتغصنة. يؤثر مورفولوجيا LCN على قيم إجهاد القص التي تشعر بها غشاء خلية الخلايا العظمية وعمليات الخلية. لذلك ، يمكن أن تكون تفاصيل كيفية تطوير النماذج القائمة على الصور متحدة البؤر ذات قيمة في فهم الإحساس الميكانيكي للخلايا العظمية ويمكن أن تضع الأساس للدراسات المستقبلية في هذا المجال.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يفترض أن الخلايا العظمية تنظم كتلة العظام استجابة لممارسة الرياضةالبدنية 1. تشوه الغشاء للخلايا العظمية وعملياتها التغصنية بسبب التحميل الميكانيكي ، يعرضها ل FFSS ، والذي يتم اكتشافه بواسطة الخلايا العظمية ويؤدي إلى إشارات داخل الخلايا2،3،4. تخضع البنية المجهرية للعظام من خلال تدهور أو تغييرات في مورفولوجيا القناة الجوبية بسبب الشيخوخة أو أمراض العظام مثل هشاشة العظام والسكري وفي حالات مثل نقص البيرليكان الذي يسبب ضعف الاستجابة الميكانيكية للخلايا العظمية5،6. تتسبب هذه التغييرات في بنية العظام في إصابة الخلايا العظمية بمستويات مختلفة من FFSS والسلالات7،8. الأهم من ذلك ، يصعب تحديد FFSS الذي تعاني منه الخلايا العظمية استجابة للتحميل الميكانيكي في الجسم الحي لأنها مضمنة في مصفوفة العظام المتكلسة.

النمذجة المستندة إلى الصور متحد البؤر هي تقنية قوية للتغلب على قيود دراسة الخلايا العظمية التي يتعذر الوصول إليها في بيئتها الطبيعية عن طريق تكرار نماذج الكمبيوتر الخاصة ب LCN9،10. كانت معالجة ونمذجة شبكة LCN المترابطة في 3D صعبة. هناك العديد من تقنيات التصوير ، مثل المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) ، والفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM) ، وتقسيم وجه الكتلة التسلسلية ، والفحص المجهري الإلكتروني لمسح شعاع الأيونات التسلسلي المركز (FIB / SEM) 2،11،12. تم تطوير تقنية قيمة لتصور العظام13،14،15 وإنشاء نماذج خلية عظمية ثلاثية الأبعاد عبر الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (CLSM). تم اختيار CLSM هنا للنمذجة الحسابية بدلا من تقنيات التصوير الأخرى نظرا لقدرتها على تصوير كل حجم الثغرة ومعظم القنوات في 3D16،17. يمكن إنشاء هندسة LCN باستخدام CLSM لتحليل العناصر المحدودة للخلايا العظمية (FEA) للتنبؤ بسلالات العظام. ومع ذلك ، فإن تحليل السوائل للتنبؤ ب FFSS الذي تعاني منه الخلايا العظمية أكثر تعقيدا لأنه يتطلب نمذجة غشاء الخلية للخلية العظمية وتشعباتها داخل LCN لتمكين نمذجة المساحة الضيقة الضيقة القناة ، حيث يتحرك السائل الخلالي حول18.

في هذا البروتوكول ، يتم تطبيق صبغة الفلورسينات إيزوثيوسيانات (FITC) على أقسام العظام السميكة غير المتكلسة قبل الفحص المجهري متحد البؤر لتسمية LCN داخل العظم ، ويتم نمذجة الأغشية المتغصنة للخلايا العظمية بناء على بيانات التصوير من LCN. تتم محاكاة المساحة الفراغية القناعية باستخدام النمذجة الحسابية ، ويتم نمذجة التحميل الفسيولوجي بسبب النشاط البدني باستخدام نهج CFD. تخضع الخلايا العظمية لتدرج ضغط السوائل في برنامج CFD لتحليل ملف تعريف السائل داخل LCN وقياس FFSS على الخلايا العظمية والأغشية المتغصنة. علاوة على ذلك ، يمكن لنهج FEA قياس سلالات أو ضغوط الخلايا العظمية من خلال تطبيق التحميل الميكانيكي الانضاغطي.

كما تم تطوير تقنية تعديل الهندسة لتعديل الهياكل المجهرية المشتقة من صور العظام الشابة السليمة من أجل محاكاة التشكل القناتي المتغير في المسنة أو تلك المصابة بأمراض العظام. تضمنت التعديلات في البنية المجهرية للعظام تقليل عدد القنوات مع تقدم العمر ، وتقليل مساحة الفضاء الجوقة والقناة لنمذجة ما يحدث في نقص البيرليكان وزيادته لنمذجة تأثيرات الشيخوخة ، وتقليل مساحة الجدار القني والتغصني لنمذجة عظام السكري5،6. تسمح لنا تقنية تعديل الهندسة بمقارنة FFSS التي تعاني منها الخلايا العظمية في العظام مع الهياكل المجهرية المختلفة ، مثل الشباب مقابل كبار السن أو العظام في السليمة مقابل المريضة.

بشكل عام ، تعد النمذجة المستندة إلى الصور متحدة البؤر أداة قيمة لمحاكاة مورفولوجيا الخلايا العظمية في العظام السليمة وكذلك في التغيرات المرتبطة بالشيخوخة / المرض في مورفولوجيا الخلايا العظمية. علاوة على ذلك ، يمكن قياس المعلمات المورفولوجية للخلايا العظمية ، مثل مساحة السطح وحجم المساحة القناية الثقيلة ، ومقارنتها في عظام مختلفة للتنبؤ بالاستجابات الخلوية للإجهاد الميكانيكي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء التجارب على بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة ميسوري ، كانساس سيتي (UMKC) ، وامتثلت للإرشادات الفيدرالية ذات الصلة.

1. عملية تحضير العظام

  1. اجمع عظم الفخذ من إناث الفئران C57BL6 البالغة من العمر 4 أشهر و 22 شهرا وثبتها في بارافورمالدهيد بارد بنسبة 4٪ في PBS لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف ، ثم اشطفها في PBS وقم بتخزينها في 70٪ من الإيثانول قبل التضمين.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم التثبيت حوالي 20 ضعف حجم الأنسجة
  2. قم بتضمين العظام بسرعة في أكريليك بلمرة سريع (جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: من المهم استخدام راتنج بلمرة سريع لهذه الخطوة (~ 10 دقائق). والغرض من ذلك هو دعم أنسجة العظام أثناء التقطيع باستخدام المنشار الماسي ، ولكن دون اختراق الراتنج إلى LCN ، مما يمنع بقعة FITC من الاختراق.
  3. قم بقص شرائح عرضية سميكة بسمك 300 ميكرومتر من موقع موحد فوق المدور الثالث باستخدام منشار ماسي وتخزينها عند 4 درجات مئوية في 70٪ من الإيثانول قبل تلطيخ FITC.
  4. قم بتلميع الأقسام باستخدام ورق صنفرة 600 و 800 ثم 1200 حصى رملية بسماكة نهائية ~ 90-100 ميكرومتر.
    ملاحظة: تم ضمان الوصول إلى السماكة المناسبة باستخدام الفرجار الرقمي.
  5. اشطف الأقسام بنسبة 70٪ و 95٪ و 100٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منها.
  6. قم بتلطيخها في 1٪ FITC في 100٪ من الإيثانول لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام مع اهتزاز معتدل.
  7. اغسل الأقسام بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 دقيقة مع رج لطيف في الظلام. ثم جففها بالهواء طوال الليل في الظلام.
  8. للتركيب ، ضع القسم في قطرة من وسائط التثبيت على شريحة مجهر زجاجي. استخدم الملقط لوضع القسم بشكل مسطح قدر الإمكان مقابل الانزلاق ، وتجنب توليد فقاعات الهواء واستخدام الراتنج المحيط لمعالجة العينة. قم بتركيب غطاء على العينة.

2. الفحص المجهري متحد البؤر

  1. استخدم مجهر متحد البؤر لتصوير شرائح العظام الملطخة ب FITC.
  2. استخدم هدف زيت 100x 1.44NA مع تكبير/تصغير رقمي يبلغ 1.7 وحجم خطوة يبلغ 0.126 ميكرومتر لتجميع مداخن Z مفصلة من 400 طائرة Z بدقة 1024 × 1024 بكسل ودقة 0.089 ميكرومتر بكسل.
  3. استخدم ليزر 488 نانومتر للإثارة ، مع نافذة تجميع انبعاثات من 496-596 نانومتر. اجمع مجموعات الصور باستخدام إعدادات التعويض لتصحيح فقدان الإشارة مع زيادة عمق التصوير.
  4. قم بزيادة دقة الصور ودقتها باستخدام تقنيات جمع الصور مثل الإفراط في أخذ العينات وزيادة متوسط الخطوط. أيضا ، اجمع الصور بتكبير 5x و 20x و 100x للمقاطع المستعرضة لأقسام عظم الفخذ كما هو موضح في الشكل 1.
    ملاحظة: تظهر الصورة منخفضة الدقة (5x) في الشكل 1 مساحة المقطع العرضي الكاملة لعظم الفخذ ، مع تحديد ثلاث مناطق لمجالات التصوير 100x.
  5. استخدم مكدسات Z 100x لنمذجة الخلايا العظمية بالكمبيوتر.

3. النمذجة الحاسوبية

  1. قم باستيراد الصور التي تم جمعها بمعدل 100 ضعف، بتنسيق TIFF، إلى برنامج ImageJ لإنشاء سلسلة من صور LCN في الاتجاه Z.
  2. قم باستيراد مكدسات Z إلى برنامج المعالجة المستند إلى الصور ثلاثية الأبعاد لإنشاء قناع ل LCN بعد تحديد اتجاه الصورة.
  3. عتبة الصورة الأصلية من الفئران الصغيرة وكبار السن بين 30,012-45,677 وحدة Hounsfield و 15,000-46,701 وحدة Hounsfield ، على التوالي ، لتشبه إلى حد كبير LCN. اضبط العتبة في قائمة القسم لتغيير حدود شدة البكسل لتضمينها في قناع.
  4. قم بقص ثغرة واحدة مع قنواتها كمنطقة الاهتمام (ROI) من المكدس باستخدام عملية قناع المحاصيل . حدد عائد الاستثمار بحيث يحيط بالثغرة في وسط المكعب ، وتمتد جميع قنواته المتصلة إلى جانبي المكعب. قم بتغليف الثغرة في مكعب وهمي أكبر بأطوال أضلاع تبلغ 21 ميكرومتر و 14 ميكرومتر و 19 ميكرومتر.
  5. نظرا لأن النموذج تم إنشاؤه من أجزاء متعددة ، قم بإجراء عملية نمو المنطقة لتحديد مناطق البكسل المتصلة وإزالة الضوضاء وإزالة البقع لإنشاء LCN موحد.
  6. قم بتحويل قناع القناة الجوائية إلى كائن باستخدام عملية الجزء المحسوب في برنامج المعالجة ثلاثي الأبعاد المستند إلى الصور.
  7. قم ببناء الخلايا العظمية والأغشية المتغصنة عن طريق تقليل حجم LCN باستخدام عملية التنعيم . قم بإجراء هذه العملية عدة مرات لتحقيق سمك فراغ وقناة يبلغ 0.75 ميكرومتر و 0.08 ميكرومتر ، على التوالي9،18.
  8. قم بتصدير الكائنات (تنسيق STL) كخطوة أخيرة في برنامج المعالجة المستند إلى الصور ثلاثي الأبعاد.
  9. قم باستيراد طبقتين من LCN والأغشية المتغصنة للخلايا العظمية إلى برنامج تحسين البيانات ثلاثي الأبعاد لإنشاء شبكة حجم.
  10. استخدم أداة معالج الإصلاح في البرنامج لتحديد مشاكل الشبكة في كل جزء. تحقق من جودة الشبكة في قسم التشخيص في معالج الإصلاح بعد كل عملية.
  11. قم بإزالة الأجزاء العادية المقلوبة والمثلثات المتقاطعة والخطوط السيئة باستخدام عملية الإصلاح التلقائي في معالج الإصلاح.
  12. استبدل المثلثات المتداخلة يدويا عن طريق تحديد مثلثات جديدة أو تلقائيا عبر عملية Fill Hole Normal .
  13. قم بتحسين جودة الشبكة باستخدام العمليات بما في ذلك تصفية المثلثات الحادة والحواف الصغيرة والأصداف الصغيرة.
  14. بعد تحسين جودة الشبكة ، اجمع بين سطحين من LCN والأغشية المتغصنة للخلايا العظمية في سطح واحد (مساحة سائلة جوبية-قناة) تنتمي إلى كلا الجزأين باستخدام مجموعة غير متشعبة.
  15. قم بإنشاء نموذج حجمي للمساحة القناة الجوقة باستخدام عملية Remesh ثم قم بتصديره كملف STL. اضبط مقياس الكائن ليكون بالميكرومتر في قسم التصدير.

4. تقنية تعديل الهندسة في برنامج المعالجة ثلاثي الأبعاد المستند إلى الصور وبرنامج تحسين البيانات ثلاثية الأبعاد

ملاحظة: تستخدم تقنية تعديل الهندسة لنمذجة التغييرات في مورفولوجيا الخلايا العظمية ، مثل كثافة القناة وقطرها وسماكة القناة الجوقة بسبب الشيخوخة أو أمراض العظام.

  1. اختر خلية العظام الصغيرة كنموذج أساسي وقم بتعديلها لبناء نماذج أخرى مميزة للخلايا العظمية من خلال تطبيق التعديلات المورفولوجية.
  2. قم بإنشاء نموذج خلية عظمية بكثافات قنوية مختلفة من النموذج الأساسي عن طريق تغيير عتبة الصورة في برنامج المعالجة ثلاثي الأبعاد المستند إلى الصور.
    1. حدد عتبة أقل لتقليل شدة الضوء للصورة والحصول على ثغرة بها عدد أقل من القنوات. تتمثل ميزة تقنية العتبة في أن شكل الثغرة وحجمها يظلان كما هي، ولا تتم دراسة سوى تأثير كثافة القناة. يوضح الشكل 2 النموذج القديم المحاكي الذي تم إنشاؤه من خلية العظم الصغيرة باستخدام تقنية تعديل الهندسة.
  3. تطوير نماذج الخلايا العظمية بسماكات مختلفة من مساحة القناة الفراغية أو أقطار التغصنات / القناة في برنامج المعالجة ثلاثي الأبعاد المستند إلى الصور وبرنامج تحسين البيانات ثلاثية الأبعاد. قم ببناء نماذج خلايا عظمية أكبر أو أصغر عن طريق عمليات التغليف أو التنعيم ، على التوالي. يوضح الشكل 3 ستة نماذج لخلايا العظام ذات هندسة متغيرة تم تطويرها من خلية العظام الصغيرة.

5. تحليل العقود مقابل الفروقات

ملاحظة: بعد إنشاء نماذج الخلايا العظمية الحجمية ، يتم إجراء عدة خطوات ، بما في ذلك الهندسة والشبكة والإعداد ، في وحدة CFX لبرنامج المحاكاة.

  1. قم بإنشاء تدفق السوائل في برنامج المحاكاة لإعداد النماذج لتحليل العقود مقابل الفروقات.
  2. قم باستيراد الأشكال الهندسية المطورة المستندة إلى الصور متحدة البؤر إلى قسم الهندسة في CFX ، المعروف باسم ANSYS SpaceClaim (أداة النمذجة ثلاثية الأبعاد). اضبط أبعاد الوحدة على نانومتر في الإعداد.
  3. تظهر الهندسة كوجهين لعمليات LCN والخلايا العظمية والتغصنية. انقر فوق Facet في القائمة العلوية وقم بإزالة الأخطاء الهندسية مثل التقاطعات أو الحواف الحادة أو المترابطة بشكل مفرط والرؤوس أو الفتحات أو الثقوب لكل وجه.
  4. انقر فوق طرح في قائمة Facet لتقليل عمليات الوجه الأصغر والخلايا العظمية من الوجه الأكبر ، LCN ، لتحقيق جسم واحد من الفضاء القناتي الجوئي. ثم انقر بزر الماوس الأيمن على الوجه الذي تم إنشاؤه وقم بتحويله من الجوانب إلى مجال صلب دون دمج الوجوه. يوضح الشكل 4 مساحة المقطع العرضي لنموذج الخلايا العظمية الشابة ، والتي تمثل المساحة الجوقة القنوية.
  5. انقر فوق الشبكة وحدد العناصر الخطية رباعية السطوح باستخدام حجم عنصر يبلغ 0.06 ميكرومتر. قم بتنقيح الشبكة من خلال دراسة تقارب الشبكة للحصول على عناصر كافية في النظام التغصني الصغير لضمان أن النتائج مستقلة عن حجم الشبكة.
  6. حدد السطح واختر القنوات الموجودة على الجانب العلوي من المكعب الوهمي كمداخل سائلة. حدد القنوات على الوجوه الخمسة الأخرى كمنافذ للسوائل باستخدام تحديد الصندوق .
  7. قم بتصدير الشبكة (تنسيق ملف بطلاقة) حيث يتم تحميلها بشكل أسرع في الإعداد في الخطوة التالية.
  8. قم بإنشاء تدفق سائل آخر في برنامج المحاكاة وقم باستيراد الشبكة بطلاقة إلى قسم الإعداد في CFX. حدد شرطين حدوديين للمداخل والمخارج للوجوه المحددة مسبقا كمداخل / منافذ باستخدام خيار إدراج الحدود .
  9. لتقليد الظروف الفسيولوجية ، قم بممارسة ضغط مدخل سائل يبلغ 300 باسكال و 0 باسكال على المداخل والمنافذ ، على التوالي19،20. تعامل مع الأسطح المتبقية كجدران بحالة عدم الانزلاق في هذا السائل الذي لا سرعة له عند واجهة الجدران. يتدفق السائل من المداخل حول التشعبات وجسم خلية العظم ويخرج من القنوات الأخرى المخصصة كمنافذ.
  10. عالج السائل الصفحي الخلالي كماء9 ، تم اختياره من مكتبة المواد. اضبط أقسام نقل الحرارة والاحتراق والإشعاع الحراري على لا شيء ، حيث لا يتم تحديد نقل الحرارة في المشكلة. حدد وضع الاضطراب كخاصية السائل في LCN ، وهو سائل رقائقي9.
  11. قم بتشغيل البرنامج باستخدام الدقة المزدوجة والبدء المباشر كنوع الإرسال. راقب الكتلة والزخم حتى تسقط البقايا وتصبح ثابتة. بعد تقارب الحل ، قم بقياس بيانات FFSS باستخدام قسم CFD-post في برنامج CFD.

6. معالجة ما بعد العقود مقابل الفروقات

  1. لتصوير FFSS التي تعاني منها الخلايا العظمية وتشعباتها ، أدخل كفافا جديدا في قسم النتائج في برنامج CFD. قم بإنشاء محيط FFSS عن طريق اختيار قص الجدار على أغشية الخلايا العظمية المتغصنة كمتغير في المجال.
    ملاحظة: لإظهار FFSS العالي بشكل أفضل على الأغشية المتغصنة ، يتم تعيين نطاق FFSS إلى محدد من قبل المستخدم لتعديل القيم الدنيا / القصوى ل FFSS.
  2. إدخال سرعة يبسط محيط داخل المجال القناة الجوقة بدءا من المداخل. اضبط أخذ العينات على متباعدة متساوية وحدد عدد النقاط على أنه 2500. يعرض قسم الرسوم المتحركة في برنامج CFD بدقة في 3D كيفية تدفق جزيئات السوائل داخل المساحات الجوقة والقناة باستخدام الرسم البياني لتبسيط السرعة.
  3. استخدم أداة حاسبة الوظيفة في برنامج CFD لتحليل حجم FFSS أو السرعة بناء على المعلمات الهندسية ، خاصة عندما تكون هناك نماذج مختلفة للخلايا العظمية (على سبيل المثال ، الشباب مقابل كبار السن). قم بقياس حجم ومساحة سطح مساحة القناة الجوقة كمعلمات هندسية جنبا إلى جنب مع قيم FFSS القصوى أو الدنيا أو المتوسطة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية تطوير نماذج الخلايا العظمية المشتقة من الكونفوكالات للتحقيق في مقدار إجهاد القص لتدفق السوائل التي تتعرض لها الخلايا العظمية وعملياتها المتغصنة بسبب التحميل الميكانيكي. تم اختيار فأر C57BL6 مسن وشاب لبناء نماذج خلايا عظمية متحدة البؤر صغيرة وكبيرة السن قائمة على الصور. تم إنشاء ستة نماذج أخرى محاكاة للخلايا العظمية من نفس نموذج الخلايا العظمية الصغيرة باستخدام تقنية تعديل الهندسة لدراسة تغيير مورفولوجيا LCN بسبب الشيخوخة أو أمراض العظام. تضمنت المعلمات المعدلة بالهندسة سمك القناة الجوقة وكثافة القناة والقطر. تم تطوير نماذج الخلايا العظمية المعدلة عن طريق تغيير معلمة واحدة في كل مرة مع الاحتفاظ بالمعلمات الأخرى كما هي. لذلك ، يتم فحص تأثير كل معلمة مورفولوجية على FFSS بمعزل عن غيرها. كشفت النتائج أن كمية FFSS التي تعاني منها الخلايا العظمية كانت مختلفة في نماذج الخلايا العظمية هذه ، مما يدل على اعتماد FFSS على مورفولوجيا LCN. تم التنبؤ بقيم FFSS في أجزاء مختلفة من نموذج الخلايا العظمية ، مثل جسم خلية العظم أو الأغشية المتغصنة. شهدت التشعبات في جميع النماذج قيم FFSS أكبر من غشاء جسم الخلية العظمية.

يوضح الشكل 5 ملامح FFSS لنماذج الخلايا العظمية الشابة مقابل المسنين التي تم إنشاؤها مباشرة من مكدسات صور FITC متحدة البؤر وستة نماذج أخرى للخلايا العظمية تم تطويرها من النموذج 1 باستخدام تقنية تعديل الهندسة. كان متوسط FFSS على الخلايا العظمية والأغشية المتغصنة في نموذج الخلايا العظمية الشابة (النموذج 1) 0.42 باسكال ، وهو أكثر أهمية من متوسط FFSS البالغ 0.13 باسكال في نموذج الخلايا العظمية القديم (النموذج 2). تظهر البيانات التي تم الحصول عليها زيادة في متوسط FFSS في الخلايا العظمية ذات المساحة القناية الأكبر (النموذج 7 والنموذج 8) وانخفاض في FFSS في الخلايا العظمية ذات الكثافة القنوية المنخفضة (النموذج 3 والنموذج 4) ، بينما لم يتغير FFSS بشكل كبير مع تغير قطر التغصنات في النموذج 5 والنموذج 6. كان للنموذج 2 والنموذج 4 أدنى قيم FFSS تبلغ 0.19 باسكال و 0.13 باسكال على التوالي. حجم FFSS في النموذج 8 أكبر مما هو عليه في نماذج الخلايا العظمية الأخرى. لا يقتصر الأمر على أن معظم التشعبات باللون الأحمر في الطراز 8 ، ولكن جسم الخلية العظمية يعاني أيضا من FFSS أعلى من النماذج الأخرى.

كما تم تقديم FFSS الذي تعاني منه الخلايا العظمية بناء على حجم مساحة القناة الفراغية ومساحة السطح ، والتي تم الحصول عليها عن طريق المعالجة اللاحقة في ANSYS CFX لمعرفة العلاقة بين FFSS والبنية المتغيرة ل LCN. كان من الممكن أيضا قياس مساحة سطح كل نموذج معرض ل FFSS أكبر من 0.8 باسكال ، والذي يعتقد أنه مستوى FFSS الذي يسبب تكوين العظام21،22. أظهرت نمذجة الخلايا العظمية وجود علاقة بين متوسط FFSS وحجم مساحة القناة الجوبية أو مساحة السطح لجميع نماذج الخلايا العظمية ، كما هو موضح في الجدول 1. خلية العظم القديمة (النموذج 2) والخلايا العظمية المحاكاة في منتصف العمر (النموذج 4) مع أقل كثافة قناة كان لها أدنى مساحة سطح قناة جوقرية تبلغ 1372.7 ميكرومتر2 و 1122.6 ميكرومتر2. كان للنموذج 2 والنموذج 4 أيضا أقل حجم فراغي للقناة يبلغ 229.4 ميكرومتر3 و 203.5 ميكرومتر3 ، على التوالي ، والتي يمكن ربطها بكميات منخفضة من FFSS. كان للنموذج 6 ، الذي يبلغ قطره الأكبر للتغصنات ، أكبر مساحة سطح قناة. كان للنموذج 8 أكبر حجم مساحة جوقة - قناة وأكبر قيم FFSS.

figure-results-1
الشكل 1: صور متحدة البؤر أحادية المستوى Z لمقطع عرضي من عظم الفخذ الملطخ ب FITC تم التقاطها بأهداف زيتية 5x و 20x و 100x. تظهر الشبكة القناة اللاكانية في الصورة الملتقطة بهدف 100x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: نماذج قائمة على الصور متحدة البؤر لخلية عظمية صغيرة (موديل 1) وسنة (موديل 2) تم إنشاؤها من عظم الفخذ الملطخ ب FITC لماوس C57BL6 البالغ من العمر 4 أشهر و 22 شهرا. تظهر الصورة المكبرة سماكة القناة الجوقرية (LC) للخلايا العظمية الصغيرة ونفس الشيء بالنسبة للخلايا العظمية المسنة. تم تعديل صورة النموذج 1 بإذن من Niroobakhsh et al.23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: ستة نماذج لخلايا العظام تم تطويرها من النموذج 1 باستخدام تقنية تعديل الهندسة. تم تقليل كثافة القناة لتوليد النموذج 3 (محاكاة منتصف العمر) والنموذج 4 (محاكاة الشيخوخة) ، بينما كان قطر التغصنات وسمك LC هما نفس النموذج 1. تم تطوير النموذج 5 والنموذج 6 بنفس كثافة القناة وسمك LC مثل النموذج 1 ، في حين كان قطر التغصنات أكبر مرتين وأربع مرات من النموذج 1. كان للنموذج 7 والنموذج 8 سمك القناة الجوقة أكبر مرتين وأربع مرات ، على التوالي ، بينما ظلت كثافة القناة وقطر التغصنات كما في النموذج 1. تم تعديل صورة النموذج 1 بإذن من Niroobakhsh et al.23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: عرض ثلاثي الأبعاد نموذج خلية عظمية شابة قائمة على الصورة متحدة البؤر. عرض ثلاثي الأبعاد لمنطقة المقطع العرضي لنموذج الخلايا العظمية الشابة القائم على الصورة متحدة البؤر الذي يصور نمذجة الفضاء القناة الجوني ، والذي يستخدم لتحليل السوائل حول الخلايا العظمية والتشعبات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: يوضح توزيع FFSS لجميع نماذج الخلايا العظمية اعتماد حجم FFSS على مورفولوجيا الخلايا العظمية. تظهر المناطق الحمراء أعلى قيم FFSS ، خاصة على الأغشية المتغصنة بدلا من جسم الخلية العظمية. تم تعديل هذه الصورة بإذن من Niroobakhsh et al.23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نماذجمساحة سطح القناة الترخية (ميكرومتر2)حجم الفضاء الترطيبي القناة (ميكرومتر3)افي FFSS (بنسلفانيا)
نماذج الخلايا العظمية القائمة على الصور متحدة البؤرنموذج 12652.92610.42
شاب (4 أشهر)
نموذج 21372.7229.40.19
العمر (22 شهرا)
نماذج محاكاة الخلايا العظمية التي تم إنشاؤها باستخدام تقنية تعديل الهندسةنموذج 31530.4242.60.27
(محاكاة منتصف العمر)
نموذج 41122.6203.50.13
(محاكاة الشيخوخة)
نموذج 53724.9302.90.49
(2 × قطر التغصن)
نموذج 647913370.57
(قطر التغصنات 4 ×)
نموذج 73116.3440.61.17
(2 × سمك LC)
نموذج 83542.2658.21.89
(4 × سمك LC)

الجدول 1: مقارنة بين نماذج الخلايا العظمية. مقارنة بين متوسط FFSS ، وحجم الفضاء الجامضي والقناة ، ومساحة السطح في ثمانية نماذج متميزة للخلايا العظمية ، بما في ذلك نموذجين قائمين على الصور متحد البؤر وستة نماذج محاكاة تم إنشاؤها من النموذج 1 باستخدام تقنية تعديل الهندسة.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول تقنية التصوير متحد البؤر للتصور والنمذجة الحسابية للخلايا العظمية. قبل التصوير متحد البؤر ، يتم إجراء عملية تحضير العظام لتقطيع عينات العظام وتلطيخها. يتم استيراد الصور متحدة البؤر للتكبير 100x إلى برامج مختلفة لتطوير نماذج حاسوبية للخلايا العظمية والفضاء الجوقي القناتي. يتم إجراء تحليل CFD أخيرا على النماذج المستندة إلى الصور متحدة البؤر لنمذجة FFSS المحيطة بالخلايا العظمية والأغشية المتغصنة بسبب النشاط البدني ، وهو أمر يمثل تحديا تقنيا في الجسم الحي بسبب عدم إمكانية الوصول إلى الخلايا العظمية في مصفوفة العظام. البروتوكول المقدم مفيد أيضا في تحديد الإجهاد أو السلالات الأخرى باستخدام نهج عنصر محدود أو تفاعل بنية السوائل (FSI) في نمذجة الفيزياء المتعددة.

تم استخدام التصوير متحد البؤر لتصور LCN7،9،24،25 بسبب الصور عالية الدقة التي يمكن تحقيقها باستخدام تلطيخ FITC للعظام. على الرغم من أن قطر القنوات قريب من حد دقة المجهر ، إلا أنه يمكن الحصول على صور متحدة البؤر موثوقة للقنوات ، والتي يمكن أن تلتقط معظم القنوات. نظرا لصغر قطر تشعبات الخلايا العظمية ، فمن الصعب تقنيا التقاط صور للتشعبات بدقة. لذلك تم تطوير تقنية مفيدة لنمذجة الخلايا العظمية والتشعبات من الصور متحدة البؤر ل LCN عن طريق تقليل حجمها باستخدام عملية تنعيم في البرنامج. استخدمت بعض الدراسات المنشورة الأخرى نهجا مشابها لتعويض LCN لتوليد الغشاء التغصني للخلاياالعظمية 9. تتمثل الفائدة الأخرى لتقنية التنعيم في تحسين بعض أخطاء التصوير في CLSM ، مثل استطالة قطر القناة الذي يحدث في المحور Z بسبب انخفاض دقة التصوير في المحور Z ، وهي سمة من سمات التصوير البصري. يعتبر فك الالتفاف أيضا طريقة بديلة لتقليل التمدد البصري في الاتجاه Z لأنه يحسن الإشارة إلى الضوضاء في مجموعة البيانات الأصلية. تم تصميم المساحة القناية الجوقة من LCN والأغشية المتغصنة للخلايا العظمية لتحليل ملف تعريف السائل داخل LCN.

والجدير بالذكر أنه تم إدخال تقنية جديدة فيما يتعلق بالطرق الحالية لتطوير نماذج الخلايا العظمية المعدلة بالهندسة دون التضحية بفأر آخر. تساعد تقنية تعديل الهندسة أيضا على محاكاة تغيير البنية المجهرية للعظام بسبب الشيخوخة أو أمراض العظام مثل هشاشة العظام والسكري وحالات مثل نقص البيرليكان وما إلى ذلك. في هذه التقنية ، تم استخدام نموذج خلية عظمية متحد البؤر قائم على الصورة للفأر الصغير لنمذجة مورفولوجيا الخلايا العظمية المسنة أو غيرها من الخلايا العظمية المريضة بالعظام عن طريق تعديل المعلمات مثل كثافة القناة ، والفضاء القناة الجوبي ، وقطر التغصنات). تم التحقق من صحة هذا النهج من خلال تشابه نموذجي الخلايا العظمية القديمين ، أحدهما من النمذجة المستندة إلى الصورة متحدة البؤر لخلية عظمية فعلية من فأر يبلغ من العمر 22 شهرا والآخر من نمذجة تعديل الهندسة لخلية عظمية تم تصويرها في الأصل من فأر يبلغ من العمر 4 أشهر عن طريق تقليل كثافة القناة. أظهر هذان النموذجين للخلايا العظمية المتقدمة في السن حجم FFSS مماثل ، والذي كان الأدنى بين جميع نماذج الخلايا العظمية. يمكن أن يكون لتقنية تعديل الهندسة العديد من التطبيقات في المجالات البيولوجية المختلفة حيث يمكنها التنبؤ بنتائج مماثلة لنماذج الخلايا العظمية التي تم إنشاؤها باستخدام خلايا عظمية حقيقية من. تتضمن بعض قيود هذا العمل فقدان بعض تفاصيل خشونة السطح بسبب تقنية التنعيم وحقيقة أن أقطار القناة في حدود دقة المجاهر متحدة البؤر ، مما قد يؤدي إلى بعض عدم الدقة للقنوات ذات الأقطار الأصغر ، وكذلك مثالية تدفق السوائل بدلا من النمذجة باستخدام التدفق التذبذبي.

لإثبات وظيفة التقنية ، تم قياس قيم FFSS لخلايا العظم لنماذج الخلايا العظمية المتميزة التي تم إنشاؤها من فأر صغير وكبير في السن أو باستخدام تقنية تعديل الهندسة. كانت إحدى النتائج الجديرة بالملاحظة باستخدام هذه النماذج الحاسوبية هي أن حجم المساحة الجوقة والقناة يتناسب طرديا مع متوسط FFSS الذي تعاني منه الخلايا العظمية. قد يكون لهذه النتيجة الجديدة ، التي لم يتم التحقيق فيها من قبل ، تطبيقات مختلفة في تحديد الاستجابة الميكانيكية للخلايا العظمية حيث يمكن أن تربط مورفولوجيا شبكة الخلايا العظمية ب FFSS المكتشفة بواسطة الخلايا العظمية وعملياتها.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم للمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF ، رقم الجائزة NSF-CMMI-1662284 PI: T Ganesh) ، والمعهد الوطني للصحة (المعاهد الوطنية للصحة - NIA P01 AG039355 PI: LF Bonewald) و (NIH / SIG S10OD021665 و S10RR027668 PI: SL Dallas) ، وبرنامج منحة أبحاث كلية الدراسات العليا بجامعة ميسوري - كانساس سيتي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1,200 حصى ورق الصنفرةBuehler30-5170-012-100
برنامج 3-MaticMaterialisehttps://www.materialise.com/en/industrial/software/3-maticبرنامج تحسين البيانات ثلاثي الأبعاد
600 حصى ورق الصنفرةBuehler30-5118-600-100
800 Grit ورق الصنفرةBuehler30-5170-800-100
برنامجANSYSANSYShttps://www.ansys.com/برنامج محاكاة
Fluorescein Isothiocyanate (FITC) برنامجSigma-AldrichF7250
ImageJhttps://imagej.net/ij/
زيت الغمر للمجاهرLeica Microsystems195371-10-9
Leica TCS Sp5 II مجهر متحد البؤر  Leica MicrosystemsTCS Sp5 II 
Leitz 1600 منشار الماس الثقب الداخليLeica 
برنامج MIMICS Innovation SuiteMaterializehttps://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suiteبرنامج معالجة ثلاثي الأبعاد قائم على الصور
Permount متوسطفيشر العلميSP15-500
Sampl-Kwick طقم أكريليك سريع العلاجBuehler20-3560
شاكر مختبر منصةواحدة موثوق به علمي INCموديل 55S

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, M. C. M., Chow, S. K. H., Wong, R. M. Y., Qin, L., Cheung, W. H. The role of osteocytes-specific molecular mechanism in regulation of mechanotransduction - A systematic review. J Orthop Translat. 29, 1-9 (2021).
  2. Fritton, S. P., Weinbaum, S. Fluid and solute transport in bone: Flow-induced mechanotransduction. Annu Rev Fluid Mech. 41, 347-374 (2009).
  3. Klein-Nulend, J., Bacabac, R. G., Bakker, A. D. Mechanical loading and how it affects bone cells: the role of the osteocyte cytoskeleton in maintaining our skeleton. Eur Cell Mater. 24, 278-291 (2012).
  4. Knothe Tate, M. L. "Whither flows the fluid in bone?" An osteocyte's perspective. J Biomech. 36 (10), 1409-1424 (2003).
  5. Tiede-Lewis, L. M., et al. Degeneration of the osteocyte network in the C57BL/6 mouse model of aging. Aging (Albany NY). 9 (10), 2190-2208 (2017).
  6. Lai, X., et al. The dependences of osteocyte network on bone compartment, age, and disease. Bone Res. 3 (1), 15009(2015).
  7. Schurman, C. A., Verbruggen, S. W., Alliston, T. Disrupted osteocyte connectivity and pericellular fluid flow in bone with aging and defective TGF-β signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (25), e2023999118(2021).
  8. van Tol, A. F., et al. The mechanoresponse of bone is closely related to the osteocyte lacunocanalicular network architecture. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (51), 32251-32259 (2020).
  9. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: a fluid-structure interaction approach. Biomech Model Mechanobiol. 13 (1), 85-97 (2014).
  10. Ganesh, T., Laughrey, L. E., Niroobakhsh, M., Lara-Castillo, N. Multiscale finite element modeling of mechanical strains and fluid flow in osteocyte lacunocanalicular system. Bone. 137, 115328(2020).
  11. Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Serial FIB/SEM imaging for quantitative 3D assessment of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 49 (2), 304-311 (2011).
  12. Kamioka, H., et al. A method for observing silver-stained osteocytes in situ in 3-microm sections using ultra-high voltage electron microscopy tomography. Microsc Microanal. 15 (5), 377-383 (2009).
  13. Ciani, C., Doty, S. B., Fritton, S. P. An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy. Bone. 44 (5), 1015-1017 (2009).
  14. Sharma, D., et al. Alterations in the osteocyte lacunar-canalicular microenvironment due to estrogen deficiency. Bone. 51 (3), 488-497 (2012).
  15. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Strain amplification in bone mechanobiology: a computational investigation of the in vivo mechanics of osteocytes. J R Soc Interface. 9 (75), 2735-2744 (2012).
  16. Goggin, P. M., Zygalakis, K. C., Oreffo, R. O., Schneider, P. High-resolution 3D imaging of osteocytes and computational modelling in mechanobiology: insights on bone development, ageing, health and disease. Eur Cell Mater. 31, 264-295 (2016).
  17. Kamioka, H., et al. Microscale fluid flow analysis in a human osteocyte canaliculus using a realistic high-resolution image-based three-dimensional model. Integr Biol. 4 (10), 1198-1206 (2012).
  18. Wang, L., et al. In situ measurement of solute transport in the bone lacunar-canalicular system. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (33), 11911-11916 (2005).
  19. Manfredini, P., Cocchetti, G., Maier, G., Redaelli, A., Montevecchi, F. M. Poroelastic finite element analysis of a bone specimen under cyclic loading. J Biomech. 32 (2), 135-144 (1999).
  20. Steck, R., Niederer, P., Knothe Tate, M. L. A finite element analysis for the prediction of load-induced fluid flow and mechanochemical transduction in bone. J Theor Biol. 220 (2), 249-259 (2003).
  21. You, L., Cowin, S. C., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for strain amplification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix. J Biomech. 34 (11), 1375-1386 (2001).
  22. Weinbaum, S., Cowin, S. C., Zeng, Y. A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses. J Biomech. 27 (3), 339-360 (1994).
  23. Niroobakhsh, M., Laughrey, L. E., Dallas, S. L., Johnson, M. L., Ganesh, T. Computational modeling based on confocal imaging predicts changes in osteocyte and dendrite shear stress due to canalicular loss with aging. Biomech Model Mechanobiol. 23 (1), 129-143 (2024).
  24. Dallas, S. L., Moore, D. S. Using confocal imaging approaches to understand the structure and function of osteocytes and the lacunocanalicular network. Bone. 138, 115463(2020).
  25. Boyde, A., Wolfe, L. A., Maly, M., Jones, S. J. Vital confocal microscopy in bone. Scanning. 17 (2), 72-85 (1995).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة