مقالة منهجية

مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

DOI:

10.3791/64700

⸱

ديسمبر 23, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Skidmore College

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الطريقة مقايسة الترسيب في المختبر القائمة على الليكتين لتحديد تقارب الارتباط بين فوسفاتيز الجلوكان والأميلوبكتين. يمكن الاعتماد على اختبار الترسيب المشترك هذا لقياس ارتباط ركيزة الجلوكان الفوسفاتيز ويمكن تطبيقه على ركائز الجلوكان المختلفة القابلة للذوبان.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتمي فوسفاتاز الجلوكان إلى عائلة أكبر من الفوسفاتاز ثنائية الخصوصية (DSP) التي تزيل الفسفور ركائز الجلوكان ، مثل الجليكوجين في الحيوانات والنشا في النباتات. تكشف الهياكل البلورية لفوسفاتيز الجلوكان مع ركائز الجلوكان النموذجية عن واجهات ربط جلوكان مميزة مصنوعة من DSP ومجالات ربط الكربوهيدرات. ومع ذلك ، فإن القياسات الكمية لتفاعلات الفوسفاتيز الجلوكان - الجلوكان مع الركائز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أساسية للفهم البيولوجي لعائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكان وتنظيم استقلاب الطاقة. تشير هذه المخطوطة إلى اختبار ترسيب في المختبر قائم على Concanavalin A (ConA) مصمم للكشف عن تقارب ربط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان ضد ركائز الجلوكان المختلفة. كدليل على المفهوم ، تم تحديد ثابت التفكك (KD) لفوسفاتيز الجلوكان أرابيدوبسيس ثاليانا النشا الزائد 4 (SEX4) والأميلوبكتين. يوضح توصيف طفرات SEX4 والأعضاء الآخرين في عائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكان فائدة هذا الفحص لتقييم الارتباط التفاضلي للتفاعلات بين البروتين والكربوهيدرات. توضح هذه البيانات مدى ملاءمة هذا الفحص لتوصيف مجموعة واسعة من البروتينات المتفاعلة مع النشا والجليكوجين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فوسفاتاز الجلوكان هي أعضاء في فصيلة فرعية متنوعة وظيفيا من الفوسفاتاز ثنائي الخصوصية (DSPs) داخل عائلة بروتين التيروزين الفوسفاتيز (PTP)1. تم العثور عليها في معظم أشكال الحياة ، بما في ذلك الكائنات الحية الضوئية المتباينة على نطاق واسع ، والبشر ، والفقاريات ، وبعض اللافقاريات والطلائعيات2،3،4. تحتوي النباتات على ثلاثة فوسفاتاز جلوكان معروفة: النشا الزائد 4 (SEX4) ، مثل الجنس four1 (LSF1) ، ومثل الجنس four2 (LSF2) 5،6،7. تظهر النباتات التي تفتقر إلى فوسفاتاز ال....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد حبات ConA-Sepharose

  1. اصنع 250 مل من مخزن مؤقت ملزم يحتوي على 67 مللي مول HEPES (درجة الحموضة 7.5) و 10 مللي مول MgCl 2 و 0.2 مللي مول CaCl2. اضبط الأس الهيدروجيني باستخدام محلول 1 M NaOH.
  2. ماصة 250 ميكرولتر من تعليق حبة ConA-Sepharose في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي محتويات في 10000 × غرام لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى 250 ميكرولتر من حبات ConA-Sepharose في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لكل تركيز أميلوبكتين يستخدم في الفحص.
  3. أضف 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط إلى كل أنبوب يحتوي على 250 ميكرولتر من حبات ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من السمات الرئيسية لعائلة بروتينات الفوسفاتيز الجلوكان هي قدرتها على الارتباط بركائز الجلوكان. أولا ، تم تحليل قدرة ربط SEX4 ب ConA-Sepharose: حبات الأميلوبكتين باستخدام SDS-PAGE (الشكل 2A). كان ألبومين مصل الأبقار (BSA) بمثابة عنصر تحكم سلبي للكشف عن أي ارتباط غير محدد للبروتينات بخرز ConA-Sepharose: الأميلوبكتين. أظهر تحليل SDS-PAGE للبروتينات وجود بروتين SEX4 في جزء الحبيبات و BSA في الجزء الطافي. كما تم تضمين W278A ، وهو متحولة SEX4 معروفة مع قدرة ربط جلوكان منخفضة بشكل كبير ، في ا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الدراسة التطور الناجح لمقايسة ترسيب جديدة في المختبر تسمح بتحديد تقارب الارتباط لتفاعلات الفوسفاتيز الجلوكان والجلوكان. يستفيد تصميم الفحص من الارتباط المحدد لليكتين كونا بالجلوكان عبر بقايا هيدروكسيل الجلوكوز لالتقاط ركائز الكربوهيدرات القابلة للذوبان بشكل غير مباشر على حبات السيفاروز. وهذا يسمح بفصل كسور البروتين المرتبطة وغير المنضمة عن طريق الطرد المركزي وتحديد تقارب الربط لركائز الجلوكان القابلة للذوبان وفوسفاتاز الجلوكان. تم العثور على جميع فوسفاتاز الجلوكان التي تم اختبارها لترت.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل جائزة المؤسسة الوطنية للعلوم MCB-2012074. يشكر المؤلفون الدكتور كريج دبليو فاندر كوي من قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة فلوريدا على المناقشات والدعم القيمين. كما يشكر المؤلفون الدكتور ماثيو س. جينتري من قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة فلوريدا على دعمه. نود أن نشكر الدكتورة سارة لاجالوار ، رئيسة برنامج علم الأعصاب في كلية سكيدمور ، على السماح لنا باستخدام ماسح اللطخة LICOR C-digit لتصوير البقع الغربية.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6x- الجسم المضاد أحادي النسيلة (HIS. H8) ، HRPTherm Fisher ScientificMA1-21315-HRP
Biorad هلام الرحلان الكهربائي ومجموعة اللطخة الغربيةBiorad & nbsp ؛1703930
كلوريد الكالسيومSigma-Aldrich208291
C-Digit BLOT BLAW SCANNERLICOR3600-00Blot Scanner
كوكتيل كامل مثبط البروتيازSigma-Aldrich11836170001
Concanavalin A-sepharose الخرزSigma-AldrichC9017يحتوي هذا المنتج على  في المخزن المؤقت 0.1 M من الأسيتات ، الرقم الهيدروجيني 6 ، الذي يحتوي على 1 M كلوريد الصوديوم ، 1 ملي كالوريد < > 2 < / فرعي > ، 1 ملي مولار MnCl < > 2 < / فرعي > ، و 1 ملي مولار MgCl 2< / sub > في 20٪ إيثانول & nbsp ؛
جهاز طردمركزي Eppendorf 5425R
جلايسينفيشر ScientificBP381-5
GraphPad Prism 8.0 برنامجGraphPad الإصدار 8.0برنامج تحليل البيانات 
HEPESSigma-AldrichH8651
Image StudioLICOR3600-501برنامج الاستحواذ
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتشM2670
ميثانولفيشر ScientificA452SK-4
كبريتات دوديسيل الصوديومفيشرPI28312
البطاطا أميلوبكتينسيجما ألدريتشA8515
المواد الهلامية SDSPAGE مسبقة الصبGenscriptM00653S
قاعدة تريسفيشر ScientificBP154-1
Tween 20Fisher ScientificMP1TWEEN201
Westernsure الركيزة الكيميائية الممتازة   ؛LI-COR  926-95000

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
  2. Gentry, M. S., et al. The phosphatase la....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS PAGE 4

مقالات ذات صلة