تعد طرق قياس نشاط ALDH1A1 في الخلايا الحية أمرا بالغ الأهمية في أبحاث السرطان نظرا لوضعها كعلامة حيوية للجذع. في هذه الدراسة ، استخدمنا مسبارا فلوروجينيا انتقائيا للشكل لتحديد المستويات النسبية لنشاط ALDH1A1 في لوحة من خمسة خطوط خلايا سرطان المبيض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطبيق AlDeSense لتقسيم خلايا سرطان المبيض إلى طبقات على أساس نشاط ألدهيد ديهيدروجينيز 1A1
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
غالبا ما يعزى الانتكاس بعد علاج السرطان إلى استمرار مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية المعروفة باسم الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) ، والتي تتميز بقدرتها الرائعة على بدء الورم وتجديده ذاتيا. اعتمادا على أصل الورم (على سبيل المثال ، المبايض) ، يمكن أن يختلف ملف تعريف العلامات الحيوية لسطح CSC بشكل كبير ، مما يجعل تحديد هذه الخلايا عن طريق تلطيخ المواد الكيميائية المناعية مسعى صعبا. على العكس من ذلك ، برز ألدهيد ديهيدروجيناز 1A1 (ALDH1A1) كعلامة ممتازة لتحديد الخلايا الجذعية السرطانية ، نظرا لملف تعريف التعبير المحفوظ في جميع الخلايا السلفية تقريبا بما في ذلك الخلايا الجذعية السرطانية. ينتمي الشكل المتماثل ALDH1A1 إلى عائلة فائقة من 19 إنزيما مسؤولة عن أكسدة مختلف الألدهيدات الداخلية و xenobiotic إلى منتجات حمض الكربوكسيل المقابلة. قام Chan et al. مؤخرا بتطوير AlDeSense ، وهو مسبار "تشغيل" انتقائي للشكل للكشف عن نشاط ALDH1A1 ، بالإضافة إلى كاشف تحكم مطابق غير تفاعلي (Ctrl-AlDeSense) لحساب التلوين خارج الهدف. وقد ثبت بالفعل أن هذه الأداة الانتقائية للشكل الأيزوفورم هي أداة كيميائية متعددة الاستخدامات من خلال الكشف عن نشاط ALDH1A1 في خلايا ابيضاض الدم النقوي K562 ، والغلاف الثديي ، والطعوم الخارجية CSC المشتقة من سرطان الجلد. في هذه المقالة ، تم عرض فائدة المسبار من خلال القياس الفلوري الإضافي ، والفحص المجهري متحد البؤر ، وتجارب قياس التدفق الخلوي حيث تم تحديد نشاط ALDH1A1 النسبي في لوحة من خمسة خطوط خلايا سرطان المبيض.
المقدمة
الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية التي تظهر خصائص تشبه الخلايا الجذعية1. على غرار نظيراتها غير السرطانية ، تمتلك CSCs قدرة غير عادية على التجديد الذاتي والتكاثر. جنبا إلى جنب مع الآليات المدمجة الأخرى ، مثل تنظيم ناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP ، غالبا ما يتم تجنيب الخلايا الجذعية السرطانية من جهود إزالة الانتفاخ الجراحية الأولية ، بالإضافة إلى العلاج المساعداللاحق 2. نظرا لدورها الحاسم في مقاومة العلاج3 ، والانتكاس4 ، وورم خبيث5 ، أصبحت الخلايا الجذعية السرطانية أولوية في أبحاث السرطان. على الرغم من وجود مجموعة متنو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. قياس إجمالي نشاط ALDH1A1 في تجانس خلايا سرطان المبيض عن طريق القياس الفلوري
- ذوبان 1 × 106 خلايا في دورق زراعة الخلايا T25 في 5 مل من وسائط زراعة الخلايا التالية:
- IGROV-1 و PEO4: معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسط مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S).
- BG-1 و Caov-3: وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع 10٪ FBS و 1٪ P / S.
- OVCAR-3: RPMI 1640 مع 20٪ FBS و 1٪ P / S و 0.01 مجم / مل من الأنسولين.
- الحفاظ على الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ممرين إلى ثلاثة ممرات. تأكد من أن الخلايا لا تتجاوز التقاء 80٪ -90٪ قبل ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إجمالي نشاط ALDH1A1 لمتجانسات خلايا سرطان المبيض
متوسط عمليات التشغيل للطي لكل خط خلية تم الحصول عليه من هذا الفحص هو: BG-1 (1.12 ± 0.01) ؛ IGROV-1 (1.30 ± 0.03) ؛ Caov-3 (1.72 ± 0.06) ؛ PEO4 (2.51 ± 0.29) ؛ و OVCAR-3 (10.25 ± 1.46) (الشكل 2).
الشكل 2: تشغيل الفلورسنت الطي للصبغة ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الانتقائية الشاملة هي قيد رئيسي للعديد من تحقيقات ALDH. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ مؤخرا عن العديد من الأمثلة الانتقائية للأشكالالمتماثلة 32،33،34،35،36،37،38،39،40،41. يمثل المسبار الفلوري.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
نكشف عن براءة اختراع معلقة (US20200199092A1) لتقنية AlDeSense.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R35GM133581 إلى JC) ومركز السرطان في منحة الدراسات العليا في إلينوي (الممنوحة ل SG). تشكر JC مؤسسة Camille and Henry Dreyfus على الدعم. يشكر المؤلفون الدكتور توماس إي بيرود على مساهمته الأولية في إعداد مخزون AlDeSense و AlDeSense AM. بيشاردو بيغيرو والسيد جوزيف أ. فورزانو على مساعدتهما في إعداد مختلف السلائف الاصطناعية. نشكر البروفيسور إريك نيلسون (قسم علم وظائف الأعضاء الجزيئي والتكاملي ، UIUC) لخلايا Caov-3 و IGROV-1 و PEO4. نشكر البروفيسور بول هيرجنروثر (قسم الكيمياء ، UIUC) على خلايا BG-1. نشكر المرافق الأساسية في معهد Carl R. Woese لعلم الأحياء الجينومي للوصول إلى مجهر Zeiss LSM 700 Confocal والبرامج المقابلة. نشكر م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25٪ تربسين ، 0.1٪ EDTA في HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم وبيكربونات الصوديوم | Corning | ؛ 25-050-CI | |
| 1x محلول ملحي عازلة للفوسفات | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | مركب داخليا | ||
| BG-1 | هدية مقدمة من مختبر البروفيسور بول هيرجنروثر ، جامعة إلينوي أوربانا شامبين | ||
| بيوليت 25 سم < سوب > 2 < / سوب> قارورة | ثيرمو فيشر العلمية | 130189 | |
| خزانة السلامة الحيوية 1300 سلسلة A2 | ثيرمو فيشر العلمي ؛ | ||
| Caov-3 | هدية مقدمة من مختبر البروفيسور إريك نيلسون ، جامعة إلينوي Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | مركبة | ||
| داخليا DMEM ، 10٪ FBS ، 1٪ P / S | من إعداد خلية UIUC منشأة إعلامية | ||
| Falcon أنابيب اختبار البوليسترين المستديرة القاع مع غطاء مفاجئ لمصفاة الخلية ، 5 مل | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | مقدمة من UIUC CMtO | ||
| FL المجهر | EVOS | ||
| مقياس الفلور | تكنولوجيا الفوتون International | ||
| Forma Series II CO2 & nbsp ؛ حاضنة | فيشر Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | هدية مقدمة من مختبر البروفيسور إريك نيلسون ، جامعة إلينوي أوربانا شامبين | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R المحتضنة شاكر | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered # 1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | هدية مقدمة من مختبر البروفيسور إريك نيلسون ، جامعة إلينوي أقراص | ||
| مثبطات بيرس للبروتياز | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI، 10٪ FBS، 1٪ P/S | محضر بواسطة منشأة الوسائط الخلوية UIUC | ||
| RPMI، 20٪ FBS، 1٪ P/S، 0.01 ملغم/مل أنسولين | أعدته منشأة وسائط الخلايا UIUC |
المراجع
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC tr....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
