مقالة منهجية

استراتيجية قائمة على كريسبر بخطوة واحدة لوضع العلامات الجينية الداخلية في ذبابة الفاكهة الميلانية

1.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64729

⸱

يناير 26, 2024

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, 3Michigan Neuroscience Institute Affiliate, University of Michigan

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا مبسطا لوضع علامات على الجينات الداخلية لذبابة الفاكهة ، والذي يستخدم تقنية قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد التعديلات الجينية الناجحة بدون علامات ، مما يسهل تطوير خطوط طرق ثابتة.

الملخص

لقد تحولت دراسة توطين البروتين تحت الخلوي وديناميكياته وتنظيمه في الخلايا الحية بشكل عميق من خلال ظهور التقنيات التي تسمح بوضع علامات على الجينات الداخلية لإنتاج بروتينات الاندماج الفلورية. تمكن هذه الطرق الباحثين من تصور سلوك البروتين في الوقت الفعلي ، مما يوفر رؤى قيمة حول وظائفهم وتفاعلاتهم داخل البيئة الخلوية. تستخدم العديد من دراسات وضع العلامات الجينية الحالية عملية من خطوتين حيث يتم استخدام العلامات المرئية ، مثل تغيرات لون العين ، لتحديد الكائنات المعدلة وراثيا في الخطوة الأولى ، ويتم استئصال العلامة المرئية في الخطوة الثانية. هنا ، نقدم بروتوكولا من خطوة واحدة لإجراء علامات جينية داخلية دقيقة وسريعة في ذبابة الفاكهة الميلانية ، والتي تتيح فحص الخطوط المهندسة بدون علامة العين المرئية ، مما يوفر ميزة كبيرة على الطرق السابقة. للكشف عن أحداث وضع العلامات الجينية الناجحة ، نستخدم تقنية قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للنمط الجيني للذباب الفردي من خلال تحليل جزء صغير من ساقه الوسطى. ثم يتم استخدام الذباب الذي يجتاز معايير الفحص لإنتاج مخزونات مستقرة. هنا ، نوضح بالتفصيل تصميم وبناء بلازميدات تحرير كريسبر وطرق فحص وتأكيد الخطوط الهندسية. يعمل هذا البروتوكول معا على تحسين كفاءة وضع العلامات الجينية الداخلية في ذبابة الفاكهة بشكل كبير ويتيح دراسات العمليات الخلوية في الجسم الحي.

المقدمة

ظهرت البروتينات الفلورية كأدوات قوية لتصور توطين البروتين وديناميكياته وتفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا داخل الكائنات الحية 1,2. يتيح وضع علامات على الجينات الداخلية باستخدام البروتينات الفلورية التصوير الحي طويل المدى للعمليات الخلوية بدقة دون خلوية. علاوة على ذلك ، فإن تقنيات وضع العلامات الجينية الداخلية هذه لها العديد من المزايا مقارنة بنهج الإفراط في التعبير والمناعة المناعية. على سبيل المثال ، قد يؤدي الإفراط في التعبير عن البروتينات إلى اختلال البروتين ، والتفاعلات غير المحددة بين البروتين والبروتين ، وسوء التوطين3. حتى الآن ، تمكن الباحثون من إنشاء مكتبات واسعة من الجينات الداخلية المنصهرة في البروتينات الفلورية لعدد قليل من الكائنات الحية النموذجية ، مثل الخميرة الناشئة ، والتي يمكن أن تخضع لإعادة التركيب المتماثل الفعال4. في حالة ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، تم ابتكار أدوات مختلفة مثل MiMICs5 ، ومصائد المحسن القائمة على الترانسبوزون6 ، والحفريات7 لوضع علامات على الجينات الفلورية.

أتاح تطوير الأدوات المستندة إلى CRISPR-Cas9 إجراء تحرير الجينوم بكفاءة ، بما في ذلك وضع علامات على البروتينات الداخلية ، في مجموعة واسعة من الكائنات الحيةالنموذجية 8,9. Cas9 هو إنزيم موجه بالحمض النووي الريبي يشق الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بطريقة عالية الكفاءةومحددة 8 ، والتي يمكن إصلاحها بعد ذلك عن طريق مسار ربط نهاية غير متماثل (NHEJ) يؤدي إلى طفرات نقطية أو حذف. بدلا من ذلك ، يسمح مسار الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) بدمج الحمض النووي غير المتجانس في الكروموسوم.

اعتمدت الطرق السابقة لوضع العلامات الجينية القائمة على كريسبر في الكائن الحي النموذجي ، ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، على عملية من خطوتين10،11،12. يتضمن ذلك استخدام علامة لون العين المميزة ، Dsred ، لاكتشاف أحداث HDR الناجحة. بعد ذلك ، سيتم استئصال علامة Dsred باستخدام نظام إعادة التركيب Cre / loxP. لتبسيط هذه العملية وتسريعها ، نقدم هنا طريقة أبسط وأكثر كفاءة. يتحايل هذا النهج على الحاجة إلى التنميط الجيني القاتل ويسمح بالفحص المباشر للذباب الفردي. على وجه التحديد ، نستخدم نهجا قائما على تفاعل البوليميراز المتسلسل لاستخراج الحمض النووي من جزء صغير من الساق الوسطى للذبابة ، مما يسمح لنا بالتنميط الجيني للذباب الفردي. والجدير بالذكر أن هذا الإجراء لا يضر بالحيوية أو الحركة أو القدرات الإنجابية للذبابة التي تم أخذ عينات منها. فقط الأفراد المناسبين ، الذين تم تحديدهم من خلال هذه الطريقة ، يتم تطويرهم إلى مخزونات مستقرة.

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتوليد الذباب الموسوم بالبروتين الفلوري حيث يتم تمييز الجينات الداخلية بمراسلي الفلورسنت. تستخدم هذه التقنية تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 لدمج أي علامة فلوروفور مرغوبة مع الطرف N أو C للجين الداخلي. أدناه ، نصف تصميم وبناء بلازميدات gRNA والبلازميد المتبرع ، واستراتيجية الفحص من خطوة واحدة لاختيار الذباب الإيجابي لكريسبر ، وخطوات إنشاء خطوط مستقرة. على وجه التحديد ، نصف استراتيجيات لوضع علامة على جين ذبابة الفاكهة الأساسي الداخلي ، الدورة ، مع فلوروفور في المحطة C. كما نصف بإيجاز تجارب التحكم التي يجب إجراؤها للتأكد من أن البروتين الموسوم هو تقنيات وظيفية وتصوير حية لتصور بروتين الدورة الشهرية في الخلايا العصبية الحية على مدار الساعة داخل أدمغة ذبابة الفاكهة السليمة 13. ينطبق البروتوكول الموصوف هنا أيضا على نطاق واسع على فحص المرشحين لحذف وإدخال أجزاء معينة من الحمض النووي عن طريق تحرير الجينوم CRISPR-Cas9.

البروتوكول

1. تصميم وبناء كواشف تحرير الجينات

ملاحظة: لإجراء وضع العلامات الداخلية ، من الضروري تحديد الأشكال المتماثلة المختلفة للجين المطلوب. اعتمادا على الأهداف المحددة للتجربة ، يمكن دمج علامة الفلورسنت إما داخليا أو في N- أو C-termini لشكل (أشكال) البروتين المختارة. للحصول على التحرير الأمثل بوساطة كريسبر، من الضروري وضع اثنين من sgRNAs بالقرب بشكل مناسب من موقع الضرب المقصود. بعد ذلك ، لتمكين التحرير من خلال إعادة التركيب المتماثل ، يجب إعداد ناقل مانح يشمل تسلسلات متماثلة للجين المستهدف ، جنبا إلى جنب مع علامة الفلورسنت. يوجد أدناه دليل خطوة بخطوة لهذه العمليات (الشكل 1).

  1. تصميم sgRNA كما هو موضح أدناه.
    1. صمم sgRNAs لذبابة الفاكهة باستخدام هذه المواقع: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ أو http://www.flyrnai.org/crispr2/.
    2. بالنسبة لموقع flycrispr ، أدخل التسلسل ±100 bp المحيط بموقع الضربة القاضية المطلوب (محطة N أو محطة C أو أي موضع جينومي مهم). في حالة استخدام nos-Cas9 attP2 كخلفية للحقن ، اختر خيار الجينوم ذبابة الفاكهة الميلانية (nos-Cas9 III ، BDSC # 78782). يضمن نظام Nos-Cas9 تعبير Cas9 الخاص بالخط الجرثومي.
    3. لتحسين كفاءة تعبير sgRNA ، حدد أهداف CRISPR بخيار 5 'G ، لأن sgRNAs التي تبدأ بالجوانين ستعزز نشاط التحرير. ثم ، انقر فوق الزر "البحث عن أهداف كريسبر ". سيتم عرض قائمة بتسلسلات sgRNA المحتملة.
    4. لكل تسلسل ، انقر فوق الزر تقييم . يتحقق هذا الإجراء من أي أهداف محتملة لكل تسلسل بناء على الجينوم المحدد مسبقا. من القائمة المتوفرة ، اختر 2 sgRNAs التي تحتوي على 0 خارج الأهداف. تأكد من أن أحد sgRNA في المنبع والآخر في اتجاه مجرى النهر بالنسبة إلى موقع الضربة القاضية. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون مواقعها قريبة من موقع الضرب قدر الإمكان (<200 نقطة أساس) ، لكن يجب ألا تتداخل مع بعضها البعض (الشكل 2).
      ملاحظة: قد يكون من الصعب في بعض الأحيان العثور على sgRNAs المناسبة لجين مستهدف معين. يمكن زيادة الفجوة بين sgRNAs وموقع الضربة القاضية إلى ± 200 نقطة أساس. قد يؤدي استخدام sgRNAs التي لا تبدأ ب G إلى تقليل المعدل الإيجابي بشكل طفيف.
  2. قم بإجراء تحديد علامة الفلورسنت كما هو موضح أدناه.
    1. تقدم علامات الفلورسنت مجموعة متنوعة من الخصائص ، ولكل منها مزاياها وعيوبها الفريدة 1,2. عند تحديد علامة الفلورسنت المثالية لتسمية بروتين معين ، اعتني بالاعتبارات الرئيسية الموضحة في الخطوات التالية التي تدخل حيز التنفيذ.
    2. بالنظر إلى أن مستويات التعبير الطبيعي للبروتين عادة ما تكون أقل بكثير من تلك التي تظهر في تجارب التعبير المفرط 1,2 ، ابدأ بالعلامات الساطعة والقابلة للضوء والتي تناسب الإعداد التجريبي. تميل بعض علامات الفلورسنت ، وتحديدا بعض طلبات تقديم العروض مثل tdTomato و DsRed ، إلى تكوين multimers14 وقد تؤدي إلى تراكم البروتين.
    3. لتعزيز التنوع ، قم بربط علامات الخاتمة (على سبيل المثال ، FLAG أو V5) بعلامة الفلورسنت باستخدام رابط مرن ، والذي يسمح بإجراء تحليلات كيميائية حيوية مثل Western Blot أو Co-ImmunoPrecipitation.
  3. لتصميم الرابط ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. للحصول على الوظائف المثلى ، تأكد من طي كل من البروتين الداخلي محل الاهتمام وعلامة الفلورسنت بشكل منفصل في أشكالهما الوظيفية الخاصة. لتحقيق ذلك ، استخدم ببتيد رابط يتراوح طوله من 2-20 من الأحماض الأمينية. على سبيل المثال ، ضع اثنين من بقايا الجلايسين بين آخر حمض أميني من بروتين الدورة الشهرية وأول حمض أميني لبروتين الفلورسنت mNeonGreen.
    2. تأكد من أن تسلسلات الببتيد الرابط هذه تشتمل على أحماض أمينية مثل الجلايسين والسيرين ، والتي تضفي المرونة على الهيكل15. هذا يضمن أن السلوك الطبيعي وموقع البروتين الداخلي لا يتغير.
  4. تصميم ناقل المانحين كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يقوم ناقل المتبرع بإدخال علامة الفلورسنت إلى الموقع الداخلي المطلوب من خلال عملية الإصلاح الموجه بالتماثل ، والتي تبدأ بواسطة انشقاق كريسبر. على هذا النحو ، إلى جانب علامة الفلورسنت ، يجب أن يمتلك ناقل المتبرع تتابعات متماثلة على جانبي العلامة.
    1. ابدأ تصميم ناقل المتبرع عن طريق تنظيم تسلسل الحمض النووي للببتيد الرابط وعلامة الفلورسنت وتأكد من وجود تسلسلات متماثلة تحيط بكلا الطرفين (أذرع التماثل). للحصول على أفضل النتائج ، تأكد من أن أذرع التماثل تشمل ما لا يقل عن 800 نيوكليوتيد على كل جانب من موقع الضرب المقصود (الشكل 2).
      ملاحظة: تشير التقارير الأخيرة إلى أن أذرع التماثل يمكن أن تكون أقصر (100-200 نقطة أساس)16.
    2. تأكد من تعديل أي تسلسلات PAM داخل بلازميد المتبرع بطريقة تظل تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين الناتج دون تغيير. إذا كان تسلسل PAM موجودا في UTR ، فقم بإزالته بالكامل.
    3. يعتمد موضع كودون START و STOP على موقع العلامة. لوضع العلامات الداخلية ، تأكد من أن علامة الفلورسنت في إطار مع تسلسل الترميز للجين المستهدف. لوضع علامات N-terminus ، ضع علامة الفلورسنت قبل كودون البدء الداخلي. لوضع علامات C-terminus ، ضع علامة الفلورسنت قبل كودون التوقف الطبيعي وتأكد من الاحتفاظ بكودون بدء واحد فقط لتجنب مشكلات الترجمة المحتملة.
  5. توليف sgRNA والبلازميدات المانحة كما هو موضح أدناه.
    1. لإنشاء بلازميد sgRNA ، اتبع إرشادات استنساخ U6-gRNA ، والتي يمكن العثور عليها في flycrispr.org/protocols/grna/. استخدم نهج الاستنساخ البديل القائم على الإنزيم (المشار إليه باسم الإستراتيجية C في المورد المقدم) لإدخال تسلسل gRNA في بلازميد pU6-BbsI-chiRNA (Addgene ، # 45946).
    2. تحويل في DH5a E. الإشريكية القولونية (NEB ، C2987H) باتباع بروتوكولات التحويل القياسية المقدمة من الشركة المصنعة. للتحقق ، قم بإجراء تسلسل Sanger على النسخ الناتجة باستخدام بادئات التسلسل القياسية T3 أو T7.
    3. لإنشاء بلازميد مانح ، احصل على الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل مع تسلسل المتبرع المطلوب من الموردين التجاريين (على سبيل المثال ، IDT). قم بدمجه في موقع الاستنساخ المتعدد pBlueScriptII SK (-). تسلسل البلازميد المتبرع لضمان تعديل تسلسل sgRNA أو PAM بشكل صحيح وعدم وجود SNPs في البلازميد.
      ملاحظة: بديل للتكامل باستخدام pBlueScriptII هو PCR أذرع التماثل وشرائح علامة الفلورسنت بشكل منفصل ودمجها في العمود الفقري باستخدام تقنيات مثل Golden Gate Assembly أو Gibson Assembly.
  6. استخدم مخطط الحقن والعبور التالي.
    1. للحصول على الذباب المحرر بالخط الجرثومي ، شارك في حقن بلازميدات gRNA والبلازميد المتبرع في خلفية Cas9 المناسبة (على سبيل المثال ، nos-Cas9 III ، BDSC 78782). في حالة استخدام خدمات الحقن التجارية ، اتبع تعليمات البائع لإجراء تحضير البلازميد.
      ملاحظة: عادة ، يجب أن يتجاوز تركيز بلازميد gRNA 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر ، ويجب أن يكون تركيز البلازميد المانح أعلى من 1.0 ميكروغرام / ميكرولتر. الجدول الزمني المشترك من إرسال عينات البلازميد إلى تلقي الأجنة المحقونة هو حوالي 2 أسابيع. يتم تقديم استراتيجية لفحص أحداث تحرير الجينات على كروموسوم X الذي يستخدم سلالة موازن FM7 / L هنا. بالنسبة للجينات الموجودة على الكروموسوم الثاني أو الثالث ، استخدم سلالات الموازن المناسبة.
    2. لجمع الذباب المحقون (G0) ، تخدير بثاني أكسيد الكربون وفصل الذباب الذكور والإناث البكر. قم بإنشاء صلبان ذبابة عن طريق إقران كل ذكر G0 مع اثنين على الأقل من الإناث البكر FM7 / L في قوارير طعام CT ضيقة فردية. ضع قوارير متقاطعة في حاضنة مهواة يتم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية ورطوبة ~ 60٪ حتى يغلق ذباب F1 (FM7 / L هو موازن كروموسوم X الأكثر استخداما). وبالمثل ، قم بإقران كل أنثى G0 مع ذكر الذباب FM7 / Y.
    3. تخدير وجمع ما لا يقل عن 10 ذرية من الإناث البكر (F1) من كل من الصلبان الذكور والإناث G0. من الصلبان الأنثوية G0 ، اجمع ما لا يقل عن 10 ذكور من ذباب F1 (الشكل 3 أ). تأكد من تمييز كل ذبابة F1 بتفاصيل نسبها وتخزينها بشكل منفصل. انتقل إلى خطوة الفحص.
  7. استخدم بروتوكول PCR أحادي الساق التالي.
    1. إنشاء التمهيدي: تصميم زوج التمهيدي يشمل موقع تحرير الجين المستهدف. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون درجات حرارة انصهار البادئات متشابهة ، حوالي 55 درجة مئوية.
    2. تحضير محلول التحلل: قم بإعداد 10 ميكرولتر من محلول التحلل لكل عينة ذبابة. يتكون المخزن المؤقت من 10 mM Tris (pH 8.2) ، 1 mM EDTA (pH 8.0) ، 25 mM NaCl ، و 400 μg / mL Proteinase K. قم بإعداد مخزن التحلل كمزيج رئيسي ، ثم قم بتوزيع 10 ميكرولتر في كل بئر من لوحة PCR المكونة من 96 بئرا. تأكد من بقاء المخزن المؤقت باردا طوال عملية تشريح الساق (الشكل 3 ب).
    3. إعداد الأنبوب: قم بإعداد أنابيب شعرية زجاجية ، وملء أحد طرفيها بطعام السكروز أجار (2٪ أجار و 4٪ سكروز) ، ووضعها في صفيحة بئر عميقة مكونة من 96 بئرا ، والتي سيشار إليها باسم فندق الذباب (الشكل 3C).
    4. تشريح الساق: ضع وسادة تخدير ثاني أكسيد الكربون تحت مجهر ستيريو ، وقم بتخدير ذبابة مرشحة واحدة وقطع إحدى الأرجل الوسطى. ضع الساق في المخزن المؤقت للتحلل ، مما يضمن الانغماس الكامل. ليس من الضروري نقع الساق ، انتقل مباشرة إلى خطوة بروتوكول التحلل (الشكل 3 ب). امسك جناح الذبابة بزوج من الملقط المعدني الناعم ، وانقل الذبابة إلى فندق الذبابة ، وأغلق الأنبوب بالخيوط على الفور.
    5. عينات التحكم: يمكن استخدام اثنين من الذباب البري كضوابط سلبية بعد نفس إجراء تشريح الساق. يعمل بلازميد المتبرع المخفف كعنصر تحكم إيجابي.
    6. رعاية ما بعد التشريح: قم بإيواء فندق الذبابة في حاضنة مهواة يتم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية ورطوبة ~ 60٪. بينما يمكن للذباب البقاء على قيد الحياة بين عشية وضحاها ، يوصى بإكمال الخطوات اللاحقة والتزاوج في نفس اليوم.
    7. بروتوكول التحلل: ضع الأرجل المقطوعة في محلول التحلل العازل في دورة حرارية مضبوطة على 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة ، تليها 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وأخيرا عند 4 درجات مئوية. سيؤدي ذلك إلى استخراج كمية كافية من الحمض النووي من الساق المفردة لكل ذبابة (الشكل 3 ب).
    8. تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل: قم بتنظيم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، باستخدام 1.5 ميكرولتر من محلول ساق الذبابة كمصدر للحمض النووي.
    9. الرحلان الكهربائي الهلامي: إخضاع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز. تفسير النتائج من الجل على أساس حجم الشريط. عادة ، سيظهر ذباب التحكم السلبي نطاقا أقل ، وتعرض عناصر التحكم في البلازميد الإيجابية نطاقا أعلى. تأكد من أن أحجام الحزام المحددة متوافقة مع تصميم البلازميد الأصلي للمانح. ستعرض إناث الذباب الإيجابي شريطين لأنها متغاير الزيجوت ، وستقدم ذكور الإيجابيات شريطا واحدا (الشكل 3 ب).
      ملاحظة: عادة ، يمكن فحص 70 ذبابة في يوم واحد. تأكد من تحديد ما لا يقل عن 10 ذباب F1 إيجابي عبر 4 إلى 5 تقاطعات G0 مميزة ، حيث قد تكون بعض F1s معقمة بسبب طفرات خارج الهدف.
  8. قم بإجراء الإعداد المتقاطع التالي بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    1. بناء على نتائج الهلام ، حدد الذباب الإيجابي من فندق الذباب وعبوره بشكل فردي مع ذباب موازن (FM7 / L لوضع علامات على جينات كروموسوم X) لإنتاج جيل F2. بمجرد ظهور جيل F2 ، قم بإنشاء تقاطعات شقيقة لإنشاء مخزونات مستقرة متماثلة الزيجوت (الشكل 3D).
    2. استخدم مخزونا متماثل الزيجوت لتسلسل سانجر لموقع التحرير لضمان الدقة. تم التحقق من صحة خطوط الطيران Backcross مع الذباب من النوع البري لإزالة طفرات الخلفية. فحص كل جيل باستخدام بروتوكول تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي الساق.

النتائج

في تجاربنا ، وجدنا عادة معدل نجاح ~ 20٪ -30٪ في فحص مختلف الجينات الموسومة الداخلية على جميع الكروموسومات (X ، II ، III). يمكن أن تختلف كفاءة هذه العملية بناء على عدة عوامل ، مثل اختيار gRNA وطبيعة الجين وجودة الحقن. هنا ، نوضح نتائج استراتيجيتنا لوضع علامة على جين الفترة الداخلية باستخدام mNeonGreen fluorophore13. يلعب جين الدورة الشهرية ، الموجود على كروموسوم X ل D. melanogaster ، دورا محوريا في الساعة البيولوجية. تمتلك ذبابة الفاكهة شبكة ساعة مميزة تتكون من حوالي 150 خلية عصبية على مدار الساعة تعبر عن بروتينات الساعة17.

قمنا بوضع علامة على بروتين الدورة الشهرية ببروتين الفلورسنت الأخضر mNeonGreen في نهايته الطرفية C ، متصلة بواسطة رابط جليكاين مزدوج13. بعد حقن البلازميد ، عبرنا ذباب G0 بموازن FM7 / L ثم حصدنا جيل F1. من بين 126 ذبابة F1 تم فحصها باستخدام بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتخصصة (الجدول 1) ، حددنا 47 حالة إيجابية ، مما أدى إلى معدل نجاح بنسبة 37.3٪. من بين هؤلاء ، اخترنا 5 أفراد من F1 لإعداد تقاطعات إضافية لإنتاج مخزونات مستقرة. لم يؤثر الجنس على معدل النتائج الإيجابية خلال هذا الفحص. بعد التحقق من دقة تسلسل الجين الموسوم ، أجرينا اختبارات تحكم ، بما في ذلك التقييمات السلوكية وتقييمات qPCR لضمان تذبذبات mRNA لتأكيد وظائف البروتين الموسوم (PERIOD-mNeonGreen) 13.

لإجراء تجارب التصوير الحي ، عبرنا ذباب PERIOD-mNeonGreen مع Clock856-GAL4. يطير UAS-CD4-tdTomato ، حيث يقوم Clock856-GAL4 بتسمية جميع الخلايا العصبية على مدار الساعة19 و CD4 هو بروتين عبر الغشاء يقوم بتسمية أغشية الخلايا. بالنسبة لتجارب التصوير الحي ، قمنا بتشريح 3-4 أدمغة بالغة باستخدام وسط ذبابة الفاكهة من شنايدر البارد. تم تركيب الأدمغة وتصويرها باستخدام مجهر Airyscan متحد البؤر. يوضح الشكل 4 الصور التمثيلية التي تعرض بروتين الدورة الشهرية داخل الخلايا العصبية على مدار الساعة في أدمغة ذبابة الفاكهة .

sgRNA والمخطط الانسيابي لاستنساخ البلازميد المتبرع ، يوضح بالتفصيل حقن الأجنة CRISPR والفحص الجيني.
الشكل 1: رسم تخطيطي لبروتوكول تحرير الجينات القائم على كريسبر / كاس 9. يحدد البروتوكول سلسلة من الخطوات لتصميم وتجميع sgRNA والبلازميدات المانحة ، يليها الفحص من خلال طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي الساق وإنتاج خطوط هندسية مستقرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط تحرير الجينات CRISPR-Cas9 ؛ يظهر sgRNA ، Cas9 ، إصلاح الحمض النووي ، الإصلاح الموجه بالتماثل.
الشكل 2: رسم تخطيطي لتحرير جينوم كريسبر / كاس 9 لتوليد ذباب mNeonGreen في الفترة. (أ) مخطط يوضح إضافة علامة بروتين فلورية إلى الطرف C لجين داخلي. (ب) جين الدورة الداخلية (لكل) موسوم ب mNeonGreen ، وهو بروتين فلوري أخضر أحادي اللون لامع في نهاية الكربوكسيل. يوجد اثنان من sgRNAs في آخر exon و 3'UTR ، على التوالي. يحتوي ناقل المتبرع على تسلسلين متماثلين ~ 1 كيلو بايت يحيطان بعلامة mNeonGreen. يضاف كودون التوقف إلى نهاية العلامة لإنهاء الترجمة بشكل صحيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عملية فحص الذباب: التهجين الجيني وطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، الرسم البياني ، استخراج الحمض النووي الجيني ، الرحلان الكهربائي.
الشكل 3: استراتيجية فحص الذباب الإيجابي لكريسبر. (أ) نهج إعداد تهجينات الفحص المسبق للجينات المخصصة لوضع علامات كريسبر على الكروموسومين X وII. يشير G0 إلى الذباب المحقون في البداية ، بينما يمثل F1 نسلهم من الجيل الأول الذي يتطلب الفحص. (ب) يتم تحديد طريقة فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي الساق ومدة كل خطوة من خطوات الإجراء. (ج) تظهر هنا صورة لفندق فلاي. تمتلئ الأنابيب الزجاجية بالطعام المتطاير ومختومة في أحد طرفيها. يتم تحميل الذباب واحد في أنابيب فردية. بعد اختبار الحمض النووي المستخرج من الصمام الأوسط للذباب الفردي ، يتم أخذ الذباب المناسب من فندق الذباب ويتم إنشاء الخطوط المستقرة. (د) نهج لإعداد تهجينات الذباب بعد الفحص (كما هو موضح هنا باللون الأزرق) التي اجتازت اختبار الفحص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

صورة المجهر الفلوري للخلية. ZT0-ZT2 ؛ توطين البروتين مقارنة العملية الخلوية.
الشكل 4: صور تمثيلية لبروتين PERIOD-mNeonGreen في الخلايا العصبية على مدار الساعة. صور تمثيلية من فترة mNeonGreen و Clock-GAL4 و UAS-CD4-tdTomato الذباب المدربة على دورات الضوء والظلام. يشير ZT إلى وقت Zeitgeber ويشير ZT0 إلى وقت تشغيل الأضواء ويشير ZT12 إلى وقت إطفاء الأنوار. الغلاف النووي للخلية العصبية على مدار الساعة مكتوب عليه tdTomato ، كما هو موضح هنا باللون الأحمر ، ويتم تمييز بروتين PERIOD ب mNeonGreen ويظهر باللون الأخضر. يتم تنظيم بروتين الدورة الشهرية في بؤر نووية منفصلة طوال وقت متأخر من الليل ونقاط زمنية في الصباح الباكر. قضبان المقياس ، 1 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسمتسلسل الحمض النووي (5 'إلى 3')
التمهيدي لفحص الدورة الشهرية إلى الأمامATACTCGTCCATAGACCACG
عكس التمهيدي لفحص الدورة الشهريةACATTATCCTCGGCTTGCAT
لكل gRNA1-sensecttcACCAGACACAGCACGGAT
لكل gRNA1-antisenseaaacATCCCCGTGCTGTGTCTCTGGT
لكل gRNA2-sensecttcGTCAGCAGCAACTGCGGGTG
لكل gRNA2-antisenseآ
أذرع تماثل الفترة وإدراج mNeonGreenGAATTCCAAGCTGCTCATCCTGCCCATTGTCAGCAA
GGGCGACCTGACCATTCGGTTGAACGATGTGCACA
CAAAGGTTTGGATTACCGCCGCCAGTGAAGCGC
TCCGATGGCCACACCTATCTCAACATCACCGACTAC
AAGACGGCCACCAAGATCAAGGGgtgagcatggcctgcat
gtctagccaactgaatggtgacctcaaacctctcctcgtagTGGCCACT
TTGACCTGTCGAATCTGTTCAACCAACAAGGAGC
GCGCGACACCACGCTGAAGGTGCTGAACCAGGT
GGAGCACCCTGGCCCTCGATGTCCAGCCGAAGATC
AACGAGGCCTGCGCCAAGGCCTTCAGTGCCATCGT
ACAGAGTCTGTGGGCCAACATTCCCTACGACGAGTT
CTTCGAAAAGGAATGAACGCATATGTATCTAACAAAGT
CCGGTCTAACTAGCCACTCTAGCTAATTACTGATTAAA
CTACCTAATTGCAGCTAAATCCAATCCATCTTCGATTAA
AACAACTACTACAAGTGTTGGCGTTGGCTTTTCGATAT
TTATTGTACAATAAATAACTAAAAAAGATTCGGATATATA
AACCTTAGGGCTGAGAGAGGGTGGTTCGATGTTCGAAC
CCTCTCTAGTTTTCAATTCACTTAATATTCTGATTAAACAT
AGGATAGATATCATCTAAAAGCTTTGCTTGGCTTGAGAT
CTACATTATCCTCGGCTTGCATGGGTTCTGGGCATCCTT
CCACGTCAGTTCGTCTGATGCTTCTCGTTACTTGGGGA
TACTGAATGGTGACATCCCACGGAAGCGTTCGCGTTGAT
TCGAAGAActtgaagggaatggaagggagttagataggaactggtgg
gactggctggtactcggtgcccagaccggaggcaattgctcacTCGTTTCCA
GGACCCTGCTGCTCCTCGGTGTCTGCTGCTCGGATCATC
CCAGGGATCGACATTGTGCACTCGGTTGTGTACGTCGGT
CAGCAGCAACTGCGGGTGTCATTACTTGTACAGTTCGT
CCATACCCATGACATCGGTGAAAGCTTTTTGCCATTCTT
TGAAATTCAGCTCTGTTTTCGAGTGCTTCAGTTCGGTTT
TTCGAAAGACATACATCGGTTGGTTCTTGAGATAGTTAG
CCGCCATCGGCTTGGCAAAAGTGTACGTTGTTCGCGCT
GTGGAGCGATACCTTTTTCCATTTCCTGTTGTATAGGAC
CATTTGAAAGTGGAAATAATAGTCTTATCATTGGGGTAG
GTCTTTTTGCTGCGGCACCAGTCAGCGGCAGTGAGC
GAATTTGTCATAACTGGGCCATCAGCGGGGAAACCCG
TTCCCTTGACTTGGGCTTCGCCTTTAATGGCTACCT
TCGTAAGTGTACCGATAGTTCACCGTGAGCGAGGCTC
CGTCTTCAAATTGCATTGTTCGATGCACCTGGTAGCCC
GAGCCATCTACCATCGCGGCTTGGAAGGGCGACATGC
CATCTGGATACGGCAAATACTGATGGAATCCGTAACCG
ATGTGTGGAACCAGGATCCAAGGAAGGAATTGGAGAT
CGCCTTTAGTCGATTTCAGATTGAGCTCTTCGTAGCC
GTCGTTGGGGTTTCCCGTACCCTGTCCGACCATATC
GAAGTCGACTCCATTGATCGAACCAAAGATATGCAG
CTCGTGTGTAGCCGGCAACGAAGCCATATTATCTTC
TTCACCCTTCTCCACACCTCCCCCCGTCGCCGTGCT
GTGTCTGGTCCTCCTCCGGGTGCTCCATGATCTTGC
TCTCAGATGTGCTCATGCTctgcaaaagaacggaaatggatta
cattgaatcgcatcgtggactgaactgtacgtacCTTCAGCTTTCGG
TGCTTGGGGTCTCTTGGGTGTCCGGCGGACTCTC
CGATCCGTCCGTGGTCTTGATGAAGGACGAGTAGA
AGGAGGAGAGCTGGAGCCATCCATGTCGTCGCTA
TTCCCATTGCTGTCCGTGTATTTctgtggatgagaccatgttc
ttcataatgaccaatcaccaatggacctcattcgtatagcatacCTTGTT
GTTGGCGGGATTGCTGCTGCTGCGGCGGGGGGGGGGGGGGG
GAGTTGTAGTCCCCATCACGGAGGAGGAGGAGGGCGA
GGAGTCCGGCACCTCTCTTGCAGGGATCGGATA
CCGCTGCACTGGAGCCCCCCCCCTCTTGACGGA
TGCGCTGCGGGAGGGAGGCTGCACCTGGGC
AGGAGTGGTGACCGAGTGGAATGCACCCCCCACC
TTCTTCGTCATGGACGCCGGCGTGGTctatggacgagta
tggagttggagttggagttaagacagttcggtgaggcaccaccccactg
acttacCGTGTACACCGACTTGTTGTACGCGGATTGGG
AGCCCAACGGACGTTCGGGAATCTGGAGAGCGTTG
GCCATTCCCGGGGAAAGCATCGGCTGGTACATCAT
GGCCGTGGGCCCGCCCCGCCGGGTGTGTGTGTAG
AAAAGCGAAGGATGCGGGTACATCACGCCCCCCAT
GTACTGCAGCGGCATGGCCTGGGCGGCGGCGGCGGCA
GCCGCCTGCTGGGGGGTGGTGGGCATCCGTGC
CACCCTTGTGCGGATGCTTGTGCATCCGGGGAGAG
CGCGTGGGACTGGTGGGCGTCAAGGAGGGGGGGGA
TGTAGTAGAGGTCGGGAGGAGGGCGGAGGA
GAAGCTGCTGGGCCATGGCCGTGTGCGTGGAG
TGAACGGGCGGTGTGATGCCCACCGAGAACGGTG
GCCAGAGGTTTATGTTCTAGA

الجدول 1: قائمة تسلسلات sgRNA لوضع علامة على جين الدورة الشهرية الداخلية في الطرف C والبادئات المستخدمة لإجراء فحص PCR أحادي الساق.

المناقشة

تظهر النتائج استراتيجية مبسطة وبسيطة من خطوة واحدة تعتمد على كريسبر لوضع علامات على الجينات الداخلية في ذبابة الفاكهة. في البروتوكول ، نستخدم اثنين من gRNAs لتحفيز كسر الشريط المزدوج للحمض النووي وإعادة التركيب المتماثل بشكل أكثر كفاءة. يتم حقن gRNAs والبلازميد المتبرع في أجنة ذبابة الفاكهة ، والتي تعبر عن إنزيم Cas9 في خطها الجرثومي. تزرع هذه الأجنة لاحقا في ظل ظروف قياسية حتى مرحلة البلوغ ، وعند هذه النقطة يتم تهجينها مع ذباب الموازن لإنتاج الجيل الأول (F1) من النسل. يتم إجراء التنميط الجيني PCR على الساق الوسطى لكل عينة F1 لفحص الذباب المعدل وراثيا. توفر هذه الطريقة ميزة كبيرة على طرق الفحص الحالية التي تستخدم خطوتين من الفحص ، حيث تعتمد الخطوة الأولى على استخدام علامة مرئية مثل لون العين لتحديد النمط الجيني المناسب والخطوة الثانية تتضمن إزالة علامة لون العين10. هنا ، نقدم طريقة تستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل على الحمض النووي المستخرج من جزء صغير من الساق الوسطى لذبابة فردية تسمح بالتنميط الجيني غير المميت للذباب الفردي ، مما يوفر بديلا أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة للطرق الحالية. تسمح هذه الطريقة بفحص المرشحة واحدة تلو الأخرى أو على دفعات حتى يتم عزل النمط الجيني المناسب. يختلف عدد التي يتم فحصها قبل عزل المخزونات المناسبة من تجربة إلى أخرى ، اعتمادا على العديد من العوامل بما في ذلك كفاءة sgRNAs المختارة ، وكفاءة الحقن ، والإدخالات خارج الهدف التي يمكن أن تؤثر على البقاء. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام الحمض النووي من الأجنحة المفردة من الذباب الفردي لأغراض التنميط الجيني18.

من الممكن أن تؤثر إضافة علامة إلى الطرف N أو C للجين سلبا على وظيفة الجين ، مما قد يؤثر على صلاحية الذباب. إذا كانت معلومات بنية البروتين متاحة ، فيمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان وضع العلامات الطرفية N أو C قد يحافظ بشكل أفضل على وظيفة وتوطين البروتين الأصلي. يوصى دائما بإجراء تجارب التحكم ، بما في ذلك اختبار ما إذا كان البروتين الموسوم يظهر نمط توطين مماثل للبروتين البري بطرق تلطيخ الأجسام المضادة. يمكن استخدام نفس استراتيجية الفحص لفحص أنواع أخرى من عمليات الإدراج أو الحذف الجينية القائمة على كريسبر. في الختام ، فإن استراتيجية الفحص ذات الخطوة الواحدة تجعل من الأسهل بكثير توليد ذباب محرر بتقنية كريسبر وتفتح العديد من الاحتمالات لدراسة التوطين تحت الخلوي وديناميكيات الجينات الداخلية في سياقها الأصلي.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر جورج واتاس وجوزي كلوني على المناقشات خلال المراحل الأولى من تطوير البروتوكول. تم دعم العمل بأموال من المعاهد الوطنية للصحة (المنحة رقم R35GM133737 إلى SY) ، وزمالة Alfred P. Sloan (إلى S. Y.) وجائزة McKnight Scholar (إلى S. Y.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5M EDTA pH8.0InvitrogenAM9260G
5-alpha Competencet E. coli ( كفاءة عالية)NEBC2987H
96 بئر لوحة بئر عميقةالعلامةالتجارية 701354
أجارفيشر العلميBP1423-500
BbsI-HFNEBR3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo ScientificK1081
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
EcoRI-HFNEBR3101S
حمض الهيدروكلوريكفيشر ScientificA142-212
إطالة الزجاج المضاد للتلاشي تصاعد متوسطInvitrogenP36982
Proteinase KQIAGEN19131
Schneider's ذبابة الفاكهة< / em> متوسطGibco21720001
كلوريدالصوديومفيشر ساينتفيكS271-500
T4 DNA ligaseNEBM0202S
تريس بيسفيشر ScientificBP152-500
XbaINEBR0145S

المراجع

  1. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
  2. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
  3. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  4. Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
  5. Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  6. Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
  7. Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068(2016).
  8. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
  9. Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
  10. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  11. Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539(2019).
  12. Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
  13. Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118(2021).
  14. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
  16. Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077(2022).
  17. Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
  18. Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
  19. Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR sgRNA PCR

مقالات ذات صلة