$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. إنبات بذور القمح
- اختر 1000 بذرة قمح (Jimai 20) مع حبيبات كاملة وأجنة سليمة وحجم موحد (الطول: 6 مم ± 0.5 مم).
- انقل 333.3 مل من محلول 30٪ H 2O 2 إلى دورق حجمي سعة 1 لتر وخفف بالماء منزوع الأيونات لتحضير 1 لتر من محلول H2 O2 10٪. اغمر بذور القمح في محلول 10٪ H 2 O2لمدة 15 دقيقة لتطهير سطح البذور (الشكل 1).
- شطف بذور القمح 5x بالماء المعقم الجاري لمدة 10 ثوان في كل مرة.
- انشر بذور القمح بالتساوي مع توجيه الأجنة لأعلى في طبق بتري زجاجي يحتوي على ورق ترشيح معقم رطب (الشكل 2). ضع طبق بتري في حاضنة مناخ اصطناعي عند 30 درجة مئوية ورطوبة نسبية 80٪. استزرع بذور القمح في الظلام لمدة 3 أيام حتى تنبت وتتجذر.

الشكل 1: تطهير بذور القمح. تم نقع بذور القمح في محلول 10٪ H 2 O2(في دورق) لمدة 15 دقيقة لتطهير سطح البذور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إنبات بذور القمح. تم نشر بذور القمح بالتساوي في طبق بتري زجاجي يحتوي على ورق ترشيح معقم رطب. تم وضع طبق بتري في حاضنة مناخية اصطناعية لإنبات بذور القمح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. زراعة شتلات القمح
- قم بإذابة 551 مجم من خليط الملح القاعدي Hoagland في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات لتحضير 1/2 محلول مغذي Hoagland (يحتوي على 0.75 مليمول / لتر K2SO 4 ، 0.1 مليمول / لتر KCl ، 0.6 مليمول / لتر MgSO 4 ، 4.0 × 10−2 مليمول / لتر FeEDTA ، 1.0 × 10−3 مليمول / لتر H 3 BO3 ، 1.0 × 10−3 مليمول / لتر MnSO4 ، 1.0 × 10−3 ملليمول/لتر ZnSO 4، 1.0 × 10−4 ملليمول/لتر CuSO 4، و5.0 × 10−6 ملليمول/لتر Na2 MoO 4).
- بعد أن تنبت بذور القمح (الخطوة 1.4) ، ضع 15 شتلة قمح في معدات الزراعة المائية (انظر جدول المواد) تحتوي على 100 مل من 1/2 محلول مغذي Hoagland للزراعة المائية (الشكل 3). ضع جهاز الزراعة المائية بالكامل في حاضنة مناخية اصطناعية (انظر جدول المواد) واحتضانها لمدة 7 أيام عند 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية 80٪ مع فترة ضوئية مظلمة لمدة 16 ساعة / 8 ساعات.

الشكل 3: الزراعة المائية لشتلات القمح. تمت زراعة شتلات القمح في الماء لمدة 0 يوم و 3 أيام و 7 أيام في 100 مل من محلول مغذي Hoagland. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. تجربة تعريض نباتات القمح لمحلول إيميداكلوبريد
- بعد فترة الزراعة المائية لمدة 7 أيام ، قم بزرع نباتات القمح في محلول مغذي Hoagland يحتوي على 0.5 مجم / لتر أو 5 مجم / لتر إيميداكلوبريد لإجراء تجارب التعرض لإيميداكلوبريد. تنمو 15 نبات القمح في كل جهاز مائي. قم بإعداد 15 جهازا مائيا لكل مجموعة تركيز إيميداكلوبريد لضمان أخذ عينات كافية أثناء أخذ العينات.
- ضع معدات الزراعة المائية بأكملها في حاضنة مناخ اصطناعي لمدة 3 أيام عند 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية 80٪ مع فترة ضوئية مظلمة لمدة 16 ساعة / 8 ساعات.
- طوال فترة التعرض ، اجمع جذور القمح (0.2 جم لكل نبات قمح) والأوراق (0.5 جم لكل نبات قمح) يوميا. دمج عينات القمح من كل جهاز مائي خامس كمجموعة متوازية وتحديد محتوى إيميداكلوبريد للعينات.
4. إجراء استخراج إيميداكلوبريد من القمح
- استخراج إيميداكلوبريد من جذور القمح
- لتجنب الأخطاء التجريبية ، اغسل جذور القمح 4x بالماء المعقم الجاري لمدة 10 ثوان في كل مرة لإزالة أي إيميداكلوبريد ممتز على سطح الجذر.
- قطعي جذور القمح إلى قطع حوالي 1 سم بالمقص (الشكل 4). تزن 10.00 جم من جذور القمح المبشورة وتوضع في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
- أضف 10 مل من الأسيتونيتريل إلى أنبوب الطرد المركزي ودوامة الأنبوب على دوامة لمدة 1 دقيقة. ثم أضف 4 جم من MgSO4 اللامائي و 1.5 جم من كلوريد الصوديوم إلى أنبوب الطرد المركزي ودوامة الأنبوب على الفور لمدة 30 ثانية. جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 5 دقائق عند 6000 × جم.
- نضح المادة الطافية بحقنة يمكن التخلص منها وتمريرها عبر مرشح حقنة (حجم مسام 0.22 ميكرومتر) للحصول على العينة.
- استخراج إيميداكلوبريد من أوراق القمح (الشكل 5)
- قطعي أوراق القمح الطازج إلى قطع بحجم 1 سم تقريبا بالمقص (الشكل 4). تزن 10.00 جم من أوراق القمح المقطعة وتوضع في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
- أضف 10 مل من الأسيتونيتريل إلى أنبوب الطرد المركزي ودوامة الأنبوب على دوامة لمدة 1 دقيقة.
- أضف 4 جم من MgSO4 اللامائي و 1.5 جم من كلوريد الصوديوم إلى أنبوب الطرد المركزي ودوامة الأنبوب على الفور لمدة 30 ثانية.
- جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 5 دقائق عند 6000 × جم.
- بعد الطرد المركزي ، أضف 2 مل من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 5 مل يحتوي على 50 مجم من أسود الكربون الجرافيتي (GCB) و 150 مجم من MgSO4 اللامائي (لإزالة الصباغ والرطوبة من العينة) ، ودوامة أنبوب الطرد المركزي لمدة 30 ثانية (الشكل 6). جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 5 دقائق عند 6000 × جم.
- نضح المادة الطافية بحقنة يمكن التخلص منها وتمريرها عبر مرشح حقنة (حجم مسام 0.22 ميكرومتر) للحصول على العينة.

الشكل 4: جذور وأوراق القمح المبشورة. تم تمزيق جذور وأوراق القمح الطازج باستخدام المقص إلى قطع حوالي 1 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: استخلاص إيميداكلوبريد في أوراق القمح. تم استخراج إيميداكلوبريد في العينات باستخدام طريقة QuEChERS (الخطوات 4.2.1-4.2.4 من البروتوكول). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تنقية إيميداكلوبريد في أوراق القمح. كان التطهير 50 ملغ GCB + 150 ملغ MgSO4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. القياس الكمي للإيميداكلوبريد
- تحديد كمية الإيميداكلوبريد في العينة باستخدام مطياف الكتلة الترادفي اللوني السائل (LC-MS-MS) ، بناء على منحنى قياسي (y = 696.61x + 56.411 ، R = 1) تم الحصول عليه من 0.2-250 ميكروغرام / لتر تركيزات إيميداكلوبريد. (الشكل 7). تم تجهيز مطياف الكتلة بعمود C18 (100 مم × 2.1 مم ، 3 ميكرومتر) ومصدر تأين بالرش الكهربائي (ESI +). يتم عرض برنامج الشطف ومعلمات مصدر الأيونات في الجدول 1.

الشكل 7: مخطط كروماتوجرام ومطياف كتلي للإيميداكلوبريد في أوراق القمح. تظهر اللوحة العلوية كروماتوجرام إيميداكلوبريد (وقت الاحتفاظ = 0.93 دقيقة). تظهر اللوحة السفلية مخطط الطيف الكتلي للإيميداكلوبريد عند 0.93 دقيقة ، مما يدل على شدة استجابة إنتاج (م / ض = 208.8) من إيميداكلوبريد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| درجة حرارة العمود | 40 درجة مئوية |
| المذيب أ | 99.9٪ ماء / 0.1٪ حمض الفورميك (V / V) |
| المذيب ب | الأسيتونيتريل |
| برنامج الشطف | 0-0.5 دقيقة ، أ = 20٪ |
| 0.5-2 دقيقة ، أ = 20٪ - 50٪ |
| 2-3 دقائق ، أ = 50٪ |
| 3-3.1 دقيقة ، أ = 50٪ - 20٪ |
| 3.1-5 دقائق، A=20٪ |
| معدل التدفق (مل / دقيقة) | 0.3 |
| حجم الحقن (ميكرولتر) | 5 |
| درجة حرارة الشعيرات الدموية (°C) | 330 |
| درجة حرارة المرذاذ (°C) | 350 |
| معدل تدفق الغاز غمد (Arb) | 40 |
| معدل تدفق غاز Aux (Arb) | 20 |
| رذاذ الجهد (V) | 3900 |
| ضغط غاز الاصطدام (mTorr) | 1.5 |
| أيون السلائف | 256.1 |
| طاقة أيون المنتج / الاصطدام (eV) | 208.8/16 |
الجدول 1: برنامج الشطف ومعلمات مصدر الأيونات لطريقة كروماتوغرافيا السائل - قياس الطيف الكتلي.