يصف هذا البروتوكول عزل الضامة الخلالية الرئوية (IMs) ونقلها بالتبني بعد تحفيز IL-33 للحويصلات الهوائية الرئوية في نموذج الفأر ، والذي يمكن أن يسهل الدراسة في الجسم الحي للتليف الرئوي مجهول السبب (IPF).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
النقل بالتبني للبلاعم المحفزة ب IL-33 إلى نماذج الفئران المستحثة بالبليوميسين لدراسة تأثيرها على التليف الرئوي مجهول السبب في الجسم الحي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
تعد الاستجابة الالتهابية الناجمة عن إصابة الرئة المبكرة أحد الأسباب المهمة لتطور التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) ، والذي يصاحبه تنشيط الخلايا الالتهابية مثل الضامة والعدلات ، بالإضافة إلى إطلاق العوامل الالتهابية بما في ذلك TNF-α و IL-1β و IL-6. من المعروف أن الالتهاب المبكر الناجم عن الضامة الخلالية الرئوية المنشطة (IMs) استجابة لتحفيز IL-33 يلعب دورا حيويا في العملية المرضية ل IPF. يصف هذا البروتوكول النقل بالتبني للرسائل العضلية التي يحفزها IL-33 إلى رئتي الفئران لدراسة تطور IPF. وهو ينطوي على عزل وزراعة الحقن العضلي الأولي من رئتي الفأر المضيف ، يليه النقل بالتبني للرسائل العضلية المحفزة إلى الحويصلات الهوائية للفئران المتلقية IPF التي يسببها بليوميسين (BLM) (والتي تم استنفادها سابقا من البلاعم السنخية عن طريق العلاج بالليبوزومات الشحمية كلودرونات) ، والتقييم المرضي لتلك الفئران. تظهر النتائج التمثيلية أن النقل بالتبني للبلاعم المحفزة IL-33 يؤدي إلى تفاقم التليف الرئوي في الفئران ، مما يشير إلى أن إنشاء تجربة نقل البلاعم بالتبني هو وسيلة تقنية جيدة لدراسة أمراض IPF.
المقدمة
التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) هو مرض التهابي رئوي منتشر تسببه العديد من العوامل1. في البيئة المكروية السيتوكينية للاستجابة المناعية Th1 و Th2 ، يمكن استقطاب البلاعم إلى بلاعم منشطة بشكل كلاسيكي (M1) وبلاعم نشطة بدلا من ذلك (M2). تحفز عديدات السكاريد الدهنية (LPS) أو السيتوكين IFN- γ الضامة M1 على استقطاب وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك iNOS و IL-1 و IL-6 و TNF-α و IL-12. في المقابل ، فإن السيتوكينات من النوع الثاني IL-4 و IL-13 تقود استقطاب الضامة M2 ، والتي يمكن أن تنتج عوامل مختلفة لتعزيز نمو الخلايا الليفية ، مثل TGF-β و PDGF ، التي تعزز التليف الرئوي2. ويرافق العملية المرضية ل IPF تنشيط البلاعم و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع التجارب وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات رعاية الحيوان التجريبي بجامعة جيانغنان (JN No. 20211130m1720615 [501]).
ملاحظة: في المجموع ، تم استخدام 10 ذكور من الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ويزن 20-25 جم في هذه الدراسة. تضمنت المجموعات التجريبية الثلاث في الدراسة ثلاثة فئران متلقية لكل منها ، وتم استخدام فأر مضيف واحد لعزل IM.
1. استنزاف الضامة الرئوية للفأر
- أخرج قارورة كلودرونات ليبوزومات (انظر جدول المواد) من الثلاجة قبل 30 دقيقة ، وقم بتسخينها إلى درجة حرار....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم تلخيص البروتوكول المستخدم هنا في المخطط الانسيابي في الشكل 1. تم استخدام استنشاق الجسيمات الشحمية كلودرونات من خلال الأنف (الشكل 2) لاستنفاد الضامة الرئوية للفئران البالغة C57BL / 6 ، وهذا أنتج نموذجا جيدا للفأر المتلقي. تم عزل العضل الرئوي من فأر آخر (مضيف) غير معالج (الشكل 3 أ ، ب) واستزراعه في المختبر. تم تحفيز البلاعم المعزولة باستخدام IL-33 لمدة 24 ساعة ثم غرست داخل القصبة الهوائية في الفئران المت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توفر هذه الدراسة طريقة فعالة لاستنفاد البلاعم وعزلها واستزراعها ونقلها ، والتي يمكن أن تساعد في دراسة آليات التليف الرئوي في الفئران. هناك العديد من الطرق لاستنفاد بلاعم الفئران ، مثل إدارة القصبة الهوائية ، وحقن الوريد الذيل ، واستنشاق الأنف11. حسنت هذه الدراسة طريقة استنشاق الأنف ، وهي سهلة التشغيل ويمكن أن تستنفد الضامة الرئويةبشكل فعال 8,9. بعد تحفيز IL-33 للرسائل العضلية في الثقافة لمدة 24 ساعة ، تم نقل IMs بالتبني إلى رئتي الفئران ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يقر المؤلفون بالموضوع الخاص لإدارة المختبرات بجامعة جيانغنان: بناء مكتبة شرائح رقمية تعتمد على العينات المرضية (JDSYS202223) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81800065).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life technologies Biotechnology,الولايات المتحدة | الأمريكية 1508012 | |
| إبرة الشرايين الساكنة | B Braun Melsingen AG,ألمانيا | 21G15G8393 | |
| BD أكوري C6 Plus | Becton Dickinson ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| Bleomycin | Biotang ، الولايات المتحدة الأمريكية | Ab9465 | |
| حاضنة ثاني أكسيد الكربون | Thermo Forma ، الولايات المتحدة الأمريكية | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R & D Systems ، الولايات المتحدة الأمريكية | 1124F | |
| CD11c | R & D Systems ، الولايات المتحدة الأمريكية | N418 | |
| طبق ثقافة الخلية | Thermo Forma ، الولايات المتحدة الأمريكية | 174926 | |
| كلودرونات ليبوسومات ؛ | الجسيمات الشحمية كلودرونات ، هولندا | CI-150-150 | |
| كولاجيناز | سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10103578001 | |
| F4 / 80 | R & D Systems ، الولايات المتحدة الأمريكية | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton ، Dickinson and Company ، الولايات المتحدة الأمريكية | 352340 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة | الأمريكية 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin ؛ | نانجينغ جيانتشنغ تكنولوجي ، الصين | 06-570 | |
| LightCycler 480 نظام الكشف عن PCR | روش ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| عامل مؤتلف الفئران IL-33 | Peprotech ، الولايات المتحدة الأمريكية | 210-33 | |
| مجهر نيكون | شركة نيكون ، اليابان | 941185 | |
| البنسلين ، الستربتومايسين | تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية | 877113 | |
| الفوسفات عازلة (PBS) | قوانغدونغ هوانكاي التكنولوجيا الميكروبية ، الصين | 1535882 | |
| تحلل كرات الدم الحمراء | Beyotime للتكنولوجيا الحيوية ، الصين | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme شركة ، الصين | R401-01-AA | إجمالي كاشف استخراج الحمض النووي الريبي |
| RWD آلة التخدير الاستنشاق RWD | Shenzhen Rayward Life Technology ، الصين | R500 | |
| البارافين شبه الأوتوماتيكي قطاعة | لايكا ، ألمانيا | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara ، اليابان | 410800 | |
| Trypsin 0.25٪ | Life Technologies ، الولايات المتحدة | الأمريكية 1627172 |
المراجع
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray an....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
