وصفنا بروتوكولا يوضح بالتفصيل عزل خبايا القولون الفئران لتطوير القولون ثلاثي الأبعاد. يمكن بعد ذلك تمييز القولون الثابت بشكل نهائي ليعكس التركيب الخلوي لظهارة المضيف قبل تلقي تحد التهابي أو توجيهه لإنشاء طبقة أحادية ظهارية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران الراسخ
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب ظهارة الأمعاء دورا أساسيا في صحة الإنسان ، حيث توفر حاجزا بين المضيف والبيئة الخارجية. توفر طبقة الخلايا عالية الديناميكية هذه خط الدفاع الأول بين المجموعات الميكروبية والمناعية وتساعد على تعديل الاستجابة المناعية المعوية. اضطراب الحاجز الظهاري هو السمة المميزة لمرض التهاب الأمعاء (IBD) وهو ذو أهمية للاستهداف العلاجي. نظام زراعة القولون 3 الأبعاد هو نموذج مفيد للغاية في المختبر لدراسة ديناميات الخلايا الجذعية المعوية وفسيولوجيا الخلايا الظهارية في التسبب في مرض التهاب الأمعاء. من الناحية المثالية ، فإن إنشاء القولون من الأنسجة الظهارية الملتهبة للحيوانات سيكون أكثر فائدة في تقييم التأثيرات الجينية والجزيئية على المرض. ومع ذلك ، فقد أظهرنا أن التغيرات الظهارية في الجسم الحي لا يتم الاحتفاظ بها بالضرورة في القولون الذي تم إنشاؤه من الفئران المصابة بالتهاب حاد. لمعالجة هذا القيد ، قمنا بتطوير بروتوكول لعلاج القولون بمزيج من الوسطاء الالتهابيين الذين عادة ما يكونون مرتفعين أثناء مرض التهاب الأمعاء. في حين يمكن تطبيق هذا النظام في كل مكان على ظروف الثقافة المختلفة ، فإن هذا البروتوكول يؤكد على العلاج على كل من القولون المتمايز والطبقات أحادية الأبعاد 2 المشتقة من القولون الثابت. في بيئة الثقافة التقليدية ، يتم إثراء القولون بالخلايا الجذعية المعوية ، مما يوفر بيئة مثالية لدراسة مكانة الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، لا يسمح هذا النظام بتحليل ميزات فسيولوجيا الأمعاء ، مثل وظيفة الحاجز. علاوة على ذلك ، لا توفر القولونات التقليدية الفرصة لدراسة الاستجابة الخلوية للخلايا الظهارية المتمايزة نهائيا للمنبهات الالتهابية. توفر الطرق المعروضة هنا إطارا تجريبيا بديلا لمعالجة هذه القيود. يوفر نظام الثقافة أحادية الطبقة 2 الأبعاد أيضا فرصة لفحص الأدوية العلاجية خارج الجسم الحي. يمكن علاج هذه الطبقة المستقطبة من الخلايا بوسطاء التهابيين على الجانب القاعدي من الخلية وبالتزامن مع العلاجات المفترضة قميا لتحديد فائدتها في علاج مرض التهاب الأمعاء.
المقدمة
مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو مرض مزمن وتحويل وانتكاس يتميز بنوبات من الالتهاب والسكون السريري. مسببات مرض التهاب الأمعاء متعددة العوامل ، ولكن السمات المميزة الرئيسية للمرض تشمل وظيفة الحاجز المعيب وزيادة نفاذية ظهارة الأمعاء ، بالإضافة إلى شلالات الإشارات الالتهابية التي يتم تنشيطها داخل المقصورة الظهارية 1,2. تم استخدام العديد من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي لتلخيص الاستجابة الظهارية أثناء مرض التهاب الأمعاء ، بما في ذلك زراعة الخلايا ونماذج الفئران للالتهاب3. ومع ذلك ، فإن كل هذه الأنظمة لديها أوجه قصور مهمة تحد من قدرتها على تلخيص التغيرات الظهارية خلال IBD
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع التجارب باستخدام أنسجة الفئران الموصوفة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة بيتسبرغ وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة البحوث والرعاية الحيوانية في جامعة بيتسبرغ و UPMC.
1. التحضير للثقافة
ملاحظة: يتم سرد جميع الكواشف في قسم جدول المواد ويمكن العثور على جميع تركيبات المحلول في جدول تكوين المحلول (الجدول 1).
- تحضير وسط غسل الماوس كما هو موضح في الجدول 1. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
- قم بإعداد المخزن المؤقت لعزل التشفير 1 (CIB1) كما هو موضح في الجدول 1
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نظام ثقافة القولون المعوي 3D هو أداة لا تقدر بثمن لدراسة المساهمة الجوهرية للظهارة في توازن الغشاء المخاطي في الأمعاء. يوفر البروتوكول الموصوف تعليمات مفصلة حول كيفية عزل الخبايا من الفئران C57BL / 6J (WT) في عمر 8 أسابيع وإنشاء نظام زراعة القولون طويل الأجل يمكن معالجته لتطبيقات متعددة في المصب. عند عزل وطلاء الخبايا في مصفوفة الغشاء القاعدي ، تظهر الخبايا كثيفة ومتعددة الخلايا في الهيكل عند تصورها بواسطة المجهر مشرق المجال. يمكن أن تكون كروية الشكل أو ممدودة وأسطوانية ، تشبه البنية المفردة التي تشبه القبو والتي يتم ملا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أحدث تطور المواد العضوية ثورة في الطريقة التي يدرس بها المجتمع العلمي أنظمة الأعضاء في المختبر مع القدرة على تلخيص البنية الخلوية والوظيفة جزئيا من أو إنسان في طبق. علاوة على ذلك ، توفر الأنظمة العضوية المشتقة من البشر المصابين بأمراض أداة واعدة للطب الشخصي الذي يمكن أن يوجه عملية صنع القرار العلاجي. هنا ، نصف بروتوكول عزل القبو الذي يعمل بشكل جيد ويقدم خطوات رئيسية تسمح بتنظيف الحطام الزائد في العزل قبل الطلاء. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح التفاصيل الرئيسية التي غالبا ما يتم تجاهلها في العملية - القدرة على حساب الخب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون المساهمون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R01DK120986 (إلى K.P.M.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.4-& مو M شفاف transwell ، 24 بئر | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15 مل أنابيب مخروطية | Thermo Fisher ؛ | 12-565-269 | |
| 50 مل أنابيب مخروطية | Thermo Fisher & nbsp ؛ | 12-565-271 | |
| 70-& مو ؛ مصفاة الخلايا M | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM / F12 | Invitrogen | 12634-010 | تركيز المخزون (1x) ؛ التركيز النهائي (1x) مكمل |
| B-27 ؛ | Invitrogen | 12587-010 | تركيز المخزون (50x) ؛ التركيز النهائي (1x) |
| مجموعة قطب عيدان تناول الطعام ل EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | تركيز المخزون (100٪) ؛ التركيز النهائي (100٪) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | تركيز المخزون (1 م) ؛ التركيز النهائي (1.5 مل); مذيب (ماء فائق النقاء) |
| DMEM ارتفاع الجلوكوز | ثيرمو فيشر | 11960-069 | تركيز المخزون (1x) ؛ التركيز النهائي (1x) |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco بدون الكالسيوم والمغنيسيوم | Gibco ؛ | 14190-144 | تركيز المخزون (1x) ؛ التركيز النهائي (1x) حمض |
| الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (ETDA) | سيجما ألدريتش | E7889 | تركيز المخزون (0.5 م) ؛ التركيز النهائي (30 ملم) |
| تركيز مخزون مصل الأبقار الجنيني | Bio-Techne | S11150H | (100٪) ؛ التركيز النهائي (1٪) |
| مجهر Fisherbrand Superfrost Plus ، أبيض ، 25 × 75 مم | Thermo Fisher ؛ | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | التركيز النهائي (400 & micro; ز /& مايكرو ؛ ل) |
| كاشف الجنتاميسين | جيبكو / فيشر | 15750-060 | تركيز المخزون (50 مجم / مل) ؛ التركيز النهائي (250 مو ؛ جم / مل) |
| تركيز المخزون GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | (100x) ؛ التركيز النهائي (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | تركيز المخزون (1 م) ؛ التركيز النهائي (10 ملم) |
| hIFN & جاما ؛ | R & D Systems | 285-IF | تركيز المخزون (1000 نانوغرام/&ميكرو ؛ L); التركيز النهائي (10 نانوغرام / مل); المذيبات (ماء عالي النقاء) |
| hIL-1 & بيتا ؛ | R & D Systems | 201-LB | تركيز المخزون (10 نانوغرام /& ميكرو ؛ L); التركيز النهائي (20 نانوغرام / مل) ؛ المذيب (ماء عالي النقاء) |
| hTNF & alpha ؛ | R & D Systems | 210-TA | تركيز المخزون (10 نانوغرام /&ميكرو ؛ L); التركيز النهائي (40 نانوغرام / مل); مذيب (ماء عالي النقاء) |
| بيروكسيد الهيدروجين ؛ | سيجما | H1009 | (30٪) ؛ التركيز النهائي (0.003٪) ؛ المذيبات (وسائط غسيل الماوس) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | التركيز النهائي (400 & micro; ز /& مايكرو ؛ L) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | تركيز المخزون (0.5 وميكرو ؛ ز /& مايكرو ؛ L); التركيز النهائي (50 نانوغرام/مل); مذيب (D-PBS + 1٪ BSA) |
| N-2 مكمل | Invitrogen | 17502-048 | تركيز المخزون (100x) ؛ التركيز النهائي (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | تركيز مخزون A9165-5G | (500 ملم) ؛ التركيز النهائي (1 مليمتر) ؛ مذيب (ماء فائق النقاء) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | تركيز المخزون (0.1 نانوغرام /& ميكرو ؛ L); التركيز النهائي (100 نانوغرام / مل) ؛ مذيب (ماء فائق النقاء + 0.1٪ BSA) |
| بنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) | ثيرمو فيشر | 15140-122 | تركيز المخزون (100x) ؛ التركيز النهائي (1x) |
| أطباق بتري (معقمة ؛ 100 مم × 15 مم) البوليسترين القابل للتصرف | VWR | 25384-342 | |
| ألواح دقيقة من البوليسترين ، 24 زراعة أنسجة جيدة معالجة ، معقمة | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R & D Systems | 3474-RS-050 | تركيز المخزون (0.25 وميكرو ؛ ز /& مايكرو ؛ L); التركيز النهائي (500 نانوغرام / مل); مذيب (D-PBS + 1٪ BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | تركيز المخزون (10x) ؛ التركيز النهائي (1x) ؛ مذيب (1 ملي مولار EDTA) |
| ماء فائق النقاء ؛ | Invitrogen | 10977-023 | تركيز المخزون (1x) ؛ التركيز النهائي (1x) |
| Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد ؛ | Abcam | ab120129 | تركيز المخزون (10 ملم) ؛ التركيز النهائي (10 وميكرو ؛ M); مذيب (ماء فائق النقاء) |
المراجع
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
