مقالة منهجية

دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران الراسخ

DOI:

10.3791/64804

⸱

يونيو 2, 2023

 ,  ,  , 
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا بروتوكولا يوضح بالتفصيل عزل خبايا القولون الفئران لتطوير القولون ثلاثي الأبعاد. يمكن بعد ذلك تمييز القولون الثابت بشكل نهائي ليعكس التركيب الخلوي لظهارة المضيف قبل تلقي تحد التهابي أو توجيهه لإنشاء طبقة أحادية ظهارية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب ظهارة الأمعاء دورا أساسيا في صحة الإنسان ، حيث توفر حاجزا بين المضيف والبيئة الخارجية. توفر طبقة الخلايا عالية الديناميكية هذه خط الدفاع الأول بين المجموعات الميكروبية والمناعية وتساعد على تعديل الاستجابة المناعية المعوية. اضطراب الحاجز الظهاري هو السمة المميزة لمرض التهاب الأمعاء (IBD) وهو ذو أهمية للاستهداف العلاجي. نظام زراعة القولون 3 الأبعاد هو نموذج مفيد للغاية في المختبر لدراسة ديناميات الخلايا الجذعية المعوية وفسيولوجيا الخلايا الظهارية في التسبب في مرض التهاب الأمعاء. من الناحية المثالية ، فإن إنشاء القولون من الأنسجة الظهارية الملتهبة للحيوانات سيكون أكثر فائدة في تقييم التأثيرات الجينية والجزيئية على المرض. ومع ذلك ، فقد أظهرنا أن التغيرات الظهارية في الجسم الحي لا يتم الاحتفاظ بها بالضرورة في القولون الذي تم إنشاؤه من الفئران المصابة بالتهاب حاد. لمعالجة هذا القيد ، قمنا بتطوير بروتوكول لعلاج القولون بمزيج من الوسطاء الالتهابيين الذين عادة ما يكونون مرتفعين أثناء مرض التهاب الأمعاء. في حين يمكن تطبيق هذا النظام في كل مكان على ظروف الثقافة المختلفة ، فإن هذا البروتوكول يؤكد على العلاج على كل من القولون المتمايز والطبقات أحادية الأبعاد 2 المشتقة من القولون الثابت. في بيئة الثقافة التقليدية ، يتم إثراء القولون بالخلايا الجذعية المعوية ، مما يوفر بيئة مثالية لدراسة مكانة الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، لا يسمح هذا النظام بتحليل ميزات فسيولوجيا الأمعاء ، مثل وظيفة الحاجز. علاوة على ذلك ، لا توفر القولونات التقليدية الفرصة لدراسة الاستجابة الخلوية للخلايا الظهارية المتمايزة نهائيا للمنبهات الالتهابية. توفر الطرق المعروضة هنا إطارا تجريبيا بديلا لمعالجة هذه القيود. يوفر نظام الثقافة أحادية الطبقة 2 الأبعاد أيضا فرصة لفحص الأدوية العلاجية خارج الجسم الحي. يمكن علاج هذه الطبقة المستقطبة من الخلايا بوسطاء التهابيين على الجانب القاعدي من الخلية وبالتزامن مع العلاجات المفترضة قميا لتحديد فائدتها في علاج مرض التهاب الأمعاء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو مرض مزمن وتحويل وانتكاس يتميز بنوبات من الالتهاب والسكون السريري. مسببات مرض التهاب الأمعاء متعددة العوامل ، ولكن السمات المميزة الرئيسية للمرض تشمل وظيفة الحاجز المعيب وزيادة نفاذية ظهارة الأمعاء ، بالإضافة إلى شلالات الإشارات الالتهابية التي يتم تنشيطها داخل المقصورة الظهارية 1,2. تم استخدام العديد من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي لتلخيص الاستجابة الظهارية أثناء مرض التهاب الأمعاء ، بما في ذلك زراعة الخلايا ونماذج الفئران للالتهاب3. ومع ذلك ، فإن كل هذه الأنظمة لديها أوجه قصور مهمة تحد من قدرتها على تلخيص التغيرات الظهارية خلال IBD4. يتم تحويل معظم خطوط الخلايا المستخدمة لدراسة مرض التهاب الأمعاء ، ولديها القدرة على تكوين طبقة أحادية ، ويمكن أن تفرق3 ولكنها تنتشر جوهريا بشكل مختلف عن الخلايا الظهارية المعوية غير المحولة في المضيف. يتم استخدام العديد من نماذج الفئران المختلفة للالتهاب لدراسة مرض التهاب الأمعاء ، وبعضها يشمل نماذج خروج المغلوب ، والنماذج المعدية ، والنماذج الالتهابية الكيميائية ، ونماذج نقل الخلايا التائية5،6،7،8. في حين أن كل منها يمكنه دراسة بعض الجوانب المسببة لمرض التهاب الأمعاء ، مثل الاستعدادات الوراثية ، واختلال الحاجز ، وإلغاء التنظيم المناعي ، والميكروبيوم ، إلا أنها محدودة في قدرتها على دراسة الطبيعة متعددة العوامل للمرض.

تم إنشاء الكائنات العضوية المعوية ، بما في ذلك الأمعاء والقولون ، على مدار العقد الماضي كنموذج مفيد في المختبر لدراسة ليس فقط ديناميات الخلايا الجذعية المعوية ولكن أيضا دورها في سلامة الحاجز ووظيفة ظهارة الأمعاء في التوازن المعوي والمرض. ساهمت هذه الكيانات بشكل كبير في فهمنا للتسبب في مرض التهاب الأمعاء9 وفتحت فرصا جديدة للطب الشخصي. تم تطوير القولون ، أو مزارع الأنسجة ذاتية التنظيم المشتقة من الخلايا الجذعية من القولون ، من كل من الفئران والأنسجة البشرية في عملية تسمح للخلايا الجذعية الموجودة داخل الخبايا المعوية بالتكاثر والحفاظ عليها إلى أجل غير مسمى10. يعتمد تخصص الخلايا الجذعية في الجسم الحي على عوامل خارج الخلية لدعم نموه ، ولا سيما إشارات Wnt المتعارف عليها ومسارات إشارات البروتين المورفوجيني للعظام11. إن إضافة هذه العوامل تعزز صحة وطول عمر القولون ولكنها تدفع أيضا الثقافة نحو حالة تشبه الخلايا الجذعية لا تعكس البنية الخلوية الظهارية في الجسم الحي ، والتي تتكون من خلايا ذاتية التجديد ومتمايزة نهائيا12,13. في حين أن وظيفة ظهارة الأمعاء تعتمد على الحديث المتبادل المستمر بين حجرة الخلايا الجذعية والخلايا المتمايزة ، فإن القدرة على الحصول على كليهما في نظام زراعة القولون محدودة إلى حد ما. على الرغم من هذه القيود ، يظل نظام الاستزراع العضوي هو المعيار الذهبي لدراسة الخصائص الجوهرية للظهارة خارج الجسم الحي. ومع ذلك ، قد يلزم النظر في استراتيجيات الثقافة البديلة للإجابة على السؤال العلمي المطروح.

لقد ثبت أن الفئران التي تتبع نظاما مستمرا لمدة 7 أيام من كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) تصاب بالتهاب ظهاري وخلل في الحاجز14. علاوة على ذلك ، تم أيضا التقاط فشل التكوين الحيوي للميتوكوندريا وإعادة البرمجة الأيضية داخل ظهارة الأمعاء ، والتي ثبت أنها واضحة في مرض التهاب الأمعاء البشري ، في نموذج DSS هذا لالتهاب القولون15. ومع ذلك ، توضح بياناتنا الأولية أن خصائص فشل التكوين الحيوي للميتوكوندريا لا يتم الاحتفاظ بها في القولون المشتق من خبايا الحيوانات المعالجة ب DSS (الشكل التكميلي 1). وبالتالي ، يجب استخدام طرق الثقافة البديلة عند فحص كيفية دفع الالتهاب للتغيرات الظهارية أثناء التهاب الأمعاء الفئران. هنا ، نحدد بروتوكولا قمنا بتطويره يصف 1) كيفية عزل الخبايا من أنسجة القولون الكاملة لإنشاء قولون الفئران ، 2) كيفية التمييز النهائي بين هذه الخلايا لتعكس عدد الخلايا كما هو الحال في الجسم الحي ، و 3) كيفية إحداث التهاب في هذا النموذج في المختبر . لدراسة التفاعلات الدوائية داخل الظهارة الملتهبة ، قمنا بتطوير بروتوكول لإنشاء طبقات أحادية 2-dimensonal (2D) من قولون الفئران التي يمكن علاجها بشكل أساسي باستخدام وسطاء التهابيين ومعالجتها قميا بالعلاجات الدوائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب باستخدام أنسجة الفئران الموصوفة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة بيتسبرغ وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة البحوث والرعاية الحيوانية في جامعة بيتسبرغ و UPMC.

1. التحضير للثقافة

ملاحظة: يتم سرد جميع الكواشف في قسم جدول المواد ويمكن العثور على جميع تركيبات المحلول في جدول تكوين المحلول (الجدول 1).

  1. تحضير وسط غسل الماوس كما هو موضح في الجدول 1. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  2. قم بإعداد المخزن المؤقت لعزل التشفير 1 (CIB1) كما هو موضح في الجدول 1. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
    تنبيه: يعتبر Dithiothreitol (DTT) خطيرا وفقا لمعيار اتصالات المخاطر OSHA بسبب السمية الحادة المحتملة إذا تم تناوله وتلف الجلد والعين إذا تعرضت تلك المناطق له. يجب استخدام القفازات الواقية وحماية العين وحماية الوجه عند التعامل مع هذه المادة الكيميائية.
  3. قم بإعداد المخزن المؤقت لعزل التشفير 2 (CIB2) كما هو موضح في الجدول 1. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  4. قم بإعداد وسيط مكيف L-WRN وفقا للبروتوكول16 المنشور مسبقا.
  5. تحضير وسط القولون الكامل كما هو موضح في الجدول 1. يمكن تخزين وسط نمو القولون الكامل لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.
  6. تحضير وسط التمايز كما هو موضح في الجدول 1. تم تعديل هذا البروتوكول من ورقة نشرت سابقا17. يمكن تخزين وسيط التمايز لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.
  7. تحضير وسيط الالتهاب كما هو موضح في الجدول 1. تم تعديل هذا البروتوكول من ورقة نشرت سابقا18. يمكن تخزين وسيط الالتهاب لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.
  8. تحضير وسط طبقة الفئران أحادي الطبقة. احذف Y-27632 عند تحدي الطبقات الأحادية بالعوامل الالتهابية و / أو الدواء (الأدوية). يمكن تخزين وسط الفئران أحادي الطبقة لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.
  9. تحضير وسيط الالتهاب أحادي الطبقة المتوسطة. يمكن تخزين وسيط الالتهاب أحادي الطبقة لمدة تصل إلى 5 أيام عند 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.

2. سرداب العزلة من أنسجة القولون الفئران

ملاحظة: نقل الأنسجة على الجليد. خذ الكمية المناسبة من مصفوفة الغشاء القاعدي من التخزين -20 درجة مئوية ، وقم بإذابة الجليد. كل 24 بئر مطلية ب 15 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي. قم بإعداد CIB1 و CIB2 ووسط نمو القولون الكامل كما هو موضح في القسم 1.

  1. القتل الرحيم للفأر C57BL / 6J (6-8 أسابيع) وفقا للبروتوكول المعتمد من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي ، واستخراج الطرف البعيد (حوالي 5-7 سم) من القولون باستخدام ملاقط ومقص نظيف.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم القتل الرحيم للأشخاص باستخدام حضانة غرفة ثاني أكسيد الكربون لمدة 2-3 دقائق متبوعة بخلع عنق الرحم.
    1. لهذا ، ضع الماوس على ظهره ، وقم بعمل شق أفقي أسفل القفص الصدري مباشرة ثم شق عمودي من منتصف الشق الأفقي باتجاه قاعدة الذيل لفضح تجويف البطن.
    2. باستخدام الملقط ، انقل الأمعاء الدقيقة خارج الحقل ، وحدد القولون ، واتبعه وصولا إلى قاعدة الذيل. كسر الحوض بالمقص لكشف القولون البعيد بالكامل إذا لزم الأمر. استخدم المقص لقطع أبعد 5-7 سم من القولون.
  2. ضع أنسجة القولون على سطح نظيف. إزالة الدهون المصلية الزائدة التي تحيط بالقولون. قم بإزالة البراز عن طريق شطف محتويات القولون اللمعية باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) باستخدام حقنة متصلة بإبرة 18 G 1 1/2. ثم ضع القولون في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من DPBS المثلج ، وضعه على الثلج.
    ملاحظة: في حالة عزل القولون عن أكثر من واحد ، ضع المنديل على الثلج قبل المتابعة إلى الحيوان التالي.
  3. انقل أنسجة القولون إلى طبق بتري مع 10 مل من DPBS المثلج ، وقم بري التجويف مرتين باستخدام DPBS باستخدام ماصة P1,000.
  4. افتح القولون طوليا باستخدام المقص ، ورجه برفق باستخدام ملاقط لمدة ~ 30 ثانية في DPBS لإزالة أي محتويات برازية متبقية.
  5. انقل المنديل إلى طبق بتري جديد مع 10 مل من DPBS المثلج البارد ، ثم رجه برفق مرة أخرى باستخدام ملاقط قبل تقطيع القولون إلى قطع 2 سم باستخدام المقص ووضعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 7 مل من CIB1 المثلج البارد. احتضان الأنسجة في CIB1 على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات المتبقية داخل خزانة السلامة البيولوجية.
  6. انقل المنديل باستخدام الملقط إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل تم تسخينه مسبقا يحتوي على 7 مل من CIB2 ، واحتضانه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. قم بإزالة CIB2 من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل عن طريق ترك الأنسجة تستقر في قاع الأنبوب المخروطي ثم سحب CIB2. ثم أضف 10 مل من وسط غسيل الماوس المثلج البارد إلى نفس الأنبوب المخروطي.
  8. احصل على أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل ، وضع مرشحا 70 ميكرومتر أعلى الأنبوب المفتوح.
  9. أثناء إمساك الأنبوب بمحتويات القولون ، قم بتدوير اليد حوالي 45 درجة. هز الأنبوب بطريقة هزازة وقوية لمدة 45 ثانية لتحرير الخبايا. بعد ذلك ، صب تعليق القبو من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
  10. باستخدام الملقط ، ضع أنسجة القولون مرة أخرى في أنبوب مخروطي فارغ سعة 50 مل ، وأضف 10 مل من وسط غسيل الفئران المثلج. احصل على مصفاة خلية جديدة 70 ميكرومتر ، وضعها فوق الأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على المحلول المصفى السابق.
  11. مرة أخرى ، التقط الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على شظايا القبو ، وقم بهرجه بطريقة مماثلة كما في الخطوة 2.9. قم بتصفية الوسط من خلال مصفاة الخلايا 70 ميكرومتر في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل لتتحد مع الخبايا التي تمت تصفيتها مسبقا.
    ملاحظة: إذا كان عائد القبو منخفضا ، هز أنسجة القولون مرة إضافية عن طريق وضع الأنسجة في أنبوب مخروطي فارغ سعة 50 مل مع 10 مل من وسط غسل الماوس. هز المنديل لمدة 45-50 ثانية لتحرير الخبايا. أيضا ، إذا كان عائد القبو منخفضا ، فقم بزيادة قوة الاهتزاز. أخيرا ، إذا كان العائد الإجمالي للسرداب منخفضا ، فيمكن طلاء كل من الماصات والأنابيب بمصل الجنين البقري (FBS) لمنع التصاق الأنسجة بالبلاستيك.
  12. جهاز طرد مركزي أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على أقبية مفلترة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب ملاحظة وجود حبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
  13. صب الوسط عن طريق السحب ، وأعد تعليق الخبايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام 10 مل من وسط غسل الماوس المثلج ، ونقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  14. للحصول على مستحضر أنظف ، اغسل الخبايا ب 10 مل إضافية من وسط غسل الماوس. صب الوسط السابق ، وأعد تعليق الخبايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل في 10 مل من وسط غسل الماوس. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    ملاحظة: يجب توخي الحذر عند سحب الوسط لأنه في بعض الأحيان لا يتم طرد الحبيبات بإحكام. إذا لم تكن الحبيبات ضيقة ، فقم بسحب معظم الوسط ، تاركا 500 ميكرولتر إلى 1 مل. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب 10 مل من وسط غسل الماوس ، وانقل المحلول إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يمكن أن يؤدي الطرد المركزي في أنبوب مخروطي أصغر إلى تحسين ضيق الحبيبات.
  15. صب الوسط ، وأعد تعليق الخبايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام 10 مل من وسط غسيل الماوس المثلج. بمجرد إعادة الشفط ، عد الخبايا تحت مجهر المجال الساطع عن طريق سحب 10 ميكرولتر من الوسط على الفور على شريحة زجاجية.
    1. ضع قطرتين 10 ميكرولتر على طرفي منفصل من الشريحة ، واحسب عدد الخبايا في كل قطرة. متوسط الأرقام بين القططتين لتحديد عدد الخبايا لكل 10 ميكرولتر. اضرب هذا الرقم في 100 لتحصل على عدد الخبايا في 1 مل.
      ملاحظة: للعد الدقيق ، يجب إزالة 10 ميكرولتر من تعليق القبو على الفور بعد التعليق. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فسوف تسقط الخبايا في قاع الأنبوب ، مما سيؤدي إلى عدد غير دقيق.
  16. بهدف طلاء 300-500 سرداب لكل بئر ، قم بنقل الحجم المناسب من الخبايا المعاد تعليقها في وسط غسل الماوس إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وإحضاره إلى 10 مل باستخدام وسيط غسيل الماوس البارد المثلج. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. يجب أن تكون الحبيبات الصغيرة مرئية في أسفل الأنبوب.
  17. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة الطاقة. استخدم ماصة P200 لإزالة أي وسيط متبقي بعناية ، مع ترك الحبيبات فقط.
  18. أعد تعليق الحبيبات بالكمية المناسبة من مصفوفة الغشاء القاعدي البارد عن طريق السحب ببطء لأعلى ولأسفل. احرص على عدم إدخال فقاعات عند تعليق حبيبات القبو. لوحة 300-500 سرداب / 15 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في كل بئر من الصفيحة. بعد الطلاء ، اقلب لوحة زراعة الأنسجة ، وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة.
  19. أعد اللوحة ، وأضف 500 ميكرولتر من وسط القولون الكامل للفأر إلى كل بئر. قم بتغيير الوسيط كل يوم حتى يصبح جاهزا للمرور. مرور القولون كل 3-5 أيام.

3. تمرير القولون

ملاحظة: يمكن تمرير كل بئر بشكل عام من 1: 4 إلى 1: 6 وفقا لكثافة البئر الأصلي. خذ الكمية المناسبة من مصفوفة الغشاء القاعدي من -20 درجة مئوية ، وضعها على الثلج لتذوب. يمكن استخدام القولون للتجارب بعد مقطعين. عند تمرير القولون ، يتم تنفيذ الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية لمنع التلوث.

  1. قم بإزالة الوسط من الآبار المراد مرورها.
    1. إذا كان هناك حطام داخل مصفوفة الغشاء القاعدي ، والذي يمكن أن يحدث أثناء العزل الأولي ، يمكن استخدام البروتوكول التالي لتنظيف الحطام:
      1. أضف 1 مل من ألبومين مصل الأبقار المثلج 0.1٪ (BSA) في DPBS بدون Ca 2+ أو Mg2+ إلى كل بئر. اتركه لمدة 5 دقائق في خزانة السلامة البيولوجية.
      2. ماصة صعودا وهبوطا ثلاث إلى سبع مرات باستخدام ماصة P1000 لتعطيل مصفوفة الغشاء القاعدي ، وجمع محتويات الآبار في أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي القولون في ما مجموعه 5-10 مل من 0.1 ٪ BSA في DPBS دون Ca 2+ أو Mg2+. تشكل ما يصل إلى الحجم المناسب مع 0.1 ٪ BSA.
      3. جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكوير القولون ولكن ليس الحطام.
      4. صب DPBS عن طريق السحب ، وترك الحبيبات. أضف 1 مل من كاشف التفكك الأنزيمي بدرجة حرارة الغرفة (RT) ، والماصة ثلاث إلى خمس مرات.
      5. ضع الأنبوب المخروطي سعة 15 مل مع كاشف التفكك الأنزيمي والقولون المعطل في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3-4 دقائق.
      6. أخرج الأنبوب من الحمام المائي ، ماصة 3-5 مرات ، ثم احضره إلى 10 مل باستخدام وسيط غسل الماوس. انتقل إلى الخطوة 3.6.
  2. ضع 500 ميكرولتر من كاشف التفكك الأنزيمي RT في كل بئر ، واتركه لمدة 1 دقيقة تقريبا قبل السحب لأعلى ولأسفل ثلاث إلى سبع مرات لتعطيل مصفوفة الغشاء القاعدي.
  3. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3-4 دقائق.
  4. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ، وماصة لأعلى ولأسفل ثلاث إلى سبع مرات باستخدام ماصة P1000 لفصل القولون.
  5. انقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل واصنع ما يصل إلى 10 مل باستخدام وسط غسيل الماوس المثلج.
  6. أجهزة الطرد المركزي العينة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بإزالة الوسيط باستخدام ماصة طاقة وماصة P200 حسب الحاجة بحيث يتم ترك حبيبات فقط في الأنبوب المخروطي.
  8. أعد التعليق بكمية مناسبة من مصفوفة غشاء القاع البارد عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل وفقا لعدد الآبار التي سيتم طلائها. لا تدخل فقاعات عند الماصة. ضع شظايا القولون في 15 ميكرولتر من قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر.
  9. قم بلوحة الخبايا ، واقلب لوحة زراعة الأنسجة ، ثم ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة.
  10. أخيرا ، أعد اللوحة ، وأضف 500 ميكرولتر من وسط القولون الكامل للفأر إلى كل بئر. قم بتغيير الوسط كل يوم حتى ينمو بشكل كبير بما يكفي ليتم تمريره مرة أخرى في حوالي 3-5 أيام.

4. التفريق النهائي بين خلايا القولون

  1. قم بتمرير القولون على النحو الوارد أعلاه ، وأضف 500 ميكرولتر من وسط القولون الكامل للفأر إلى كل بئر.
  2. بعد 48 ساعة على الأقل من المرور ، قم بإزالة وسط القولون الكامل للفأر ، وأضف 500 ميكرولتر من الوسط المتمايز إلى كل بئر (انظر القسم 1).
  3. احتضان القولون مع وسائط التمايز لمدة 48 ساعة ، وبعد ذلك يمكن استخدامها في التجارب ، بما في ذلك جمع الحمض النووي الريبي والبروتين.
    ملاحظة: يمكن تقييم القولون للتمايز عن طريق جمع الحمض النووي الريبي وتقييم التعبير عن Lgr5 و Ki67 ، علامة الخلايا الجذعية وعلامة تكاثر الخلايا ، على التوالي ، عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qPCR). يجب أن يكون للخلايا المتمايزة نهائيا تعبير منخفض نسبيا عن Lgr5 و Ki67 مقارنة بالقولون المزروع في وسط القولون التقليدي ، حيث تكون الخلايا أكثر شبها بالساق. قد تحتاج المدة الزمنية التي تحتاجها القولون إلى الاحتضان في وسط التمايز إلى تحسينها لكل مختبر على حدة. ارجع إلى الجدول التكميلي 1 للحصول على قائمة الاشعال .

5. إحداث التهاب في القولون المتمايز مع وسطاء التهابيين

  1. بعد تحضين القولون لمدة 2-3 أيام باستخدام وسيط التمايز ، قم بإزالة الوسط الموجود ، وأضف 500 ميكرولتر من وسيط الالتهاب إلى كل بئر.
  2. اسمح للآبار بالاحتضان لمدة 24-72 ساعة قبل جمع الحمض النووي الريبي والبروتين (أو تقييم معلمات المصب الأخرى). تغيير الوسيط كل يوم.

6. أحاديات الطبقة الظهارية المعوية المشتقة من القولون الفئران المعمول بها

ملاحظة: تستمد الطبقات الظهارية المعوية للفئران من قولون الفئران التي تم تمريرها مرتين على الأقل. للسماح بتكوين أحادي الطبقة بنجاح في 3-5 أيام ، من الضروري عدم فصل القولون إلى خلايا مفردة. تعتبر المواد العضوية المجزأة التي تم فصلها إنزيميا إلى مجموعات خلوية مثالية للنمو.

  1. تحضير جميع الكواشف قبل بدء التجربة. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. تحضير وسط طبقة الفئران الأحادي كما هو موضح في القسم 1. تمييع الغشاء القاعدي المذاب 1:20 مع وسط أحادي الطبقة الفئران الباردة. ابق على الجليد.
  2. استخدم ملقط معقم لوضع إدخال مزرعة خلية شفافة 0.4 ميكرومتر في بئر واحدة من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا (جدول المواد). أمسك بشق زاوية من الملحق ، وانقله إلى البئر. كرر حتى يتوفر العدد المناسب من إدخالات زراعة الخلايا للثقافة.
    ملاحظة: تأكد من طلاء بئر تحكم إضافي بمصفوفة الغشاء القاعدي فقط. سيتم استخدام ملحق زراعة الخلية هذا لقياس مقاومة الخلفية لإدراج زراعة الخلية بدون وجود خلايا ، كما هو موضح في الخطوة التالية (الخطوة 6.3).
  3. باستخدام ماصة P200 ، قم بتغطية السطح القمي (العلوي) لكل ملحق مزرعة خلية ب 150 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف. ضع طرف الماصة في وسط الملحق دون لمس غشاء الملحق ، واطرد المحلول برفق. ضع اللوحة في حاضنة معقمة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة على الأقل.
  4. قم بإزالة مصفوفة الغشاء القاعدي برفق قبل الاستخدام ، واترك إدخالات زراعة الخلايا تجف في خزانة أمان بيولوجي لمدة لا تقل عن 10 دقائق.
    1. لإزالة مصفوفة الغشاء القاعدي ، قم بتدوير لوحة 24 بئرا بزاوية 45 درجة. ضع إصبعا واحدا على زاوية الشق لتثبيت الإدخال ، وباستخدام ماصة P200 ، ضع طرف الماصة برفق على طول الجانب السفلي من الملحق وقم بإزالة المصفوفة.
    2. قم بإزالة أي بقايا زائدة عن طريق غسل كل ملحق مزرعة خلية ب 150 ميكرولتر من DPBS المعقم بدون Ca 2+ أو Mg2+.
  5. بعد 10 دقائق من التجفيف ، أضف 400 ميكرولتر من وسط طبقة الفئران الأحادية إلى أسفل ملحق زراعة الخلية و 75 ميكرولتر في الأعلى. كرر حتى يتم غمر جميع إدراج ثقافة الخلية. اترك اللوحة في خزانة السلامة البيولوجية ، أو ضعها مرة أخرى في الحاضنة لحين الحاجة.
  6. قم بإزالة الصفيحة المكونة من 24 بئرا من القولون المعوي الناضج (العضويات في اليوم 3-5 من النمو) من حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، وضعها تحت خزانة السلامة البيولوجية. قم بإزالة الوسط باستخدام أطراف معقمة ، واغسل كل بئر ب 1 مل من RT DPBS المعقم (بدون Ca 2+ أو Mg2+).
    ملاحظة: يتم تقسيم بئر فردي من 75-125 القولون الناضج بنسبة 1: 4.
  7. قم بإزالة DPBS بدون Ca 2+ أو Mg2+ باستخدام أطراف معقمة ، وقم بهضم كل سدادة من مصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق وضع 500 ميكرولتر من كاشف التفكك الأنزيمي RT في كل بئر يتم مروره.
  8. ماصة كل بئر صعودا وهبوطا حوالي 6-10 مرات لتفتيت القابس. لا تخدش الجزء السفلي من اللوحة لإزالة القابس. بدلا من ذلك ، قم بتدوير اللوحة المكونة من 24 بئرا بزاوية 45 درجة ، ضع طرف الماصة على حافة القابس ، وقم بإزاحتها برفق.
  9. ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا مرة أخرى في حاضنة معقمة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 3-4 دقائق.
  10. قم بإزالة اللوحة ، وقم بسحب كاشف التفكك الأنزيمي لأعلى ولأسفل من خمس إلى سبع مرات لكل بئر تحت خزانة السلامة البيولوجية. انقل القولون المنفصل من كل بئر إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل. أحضر ما يصل إلى 10 مل مع وسط غسيل الماوس البارد المثلج.
  11. أجهزة الطرد المركزي القولون المهضومة جزئيا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح.
  12. تحت خزانة السلامة البيولوجية ، قم بإزالة المادة الطافية من الحبيبات باستخدام ماصة سعة 10 مل. قم بإزالة أي وسيط متبقي باستخدام ماصة P200. أعد تعليق حبيبات القولون في وسط أحادي الطبقة للفئران. أضف 75 ميكرولتر من الوسط لكل إدراج مزرعة خلية من القولون المجزأ المراد طلائه.
  13. أضف 75 ميكرولتر من معلق القولون إلى مركز كل إدراج لمزرعة الخلية. قبل إضافة تعليق القولون إلى كل بئر ، قم بالسحب برفق لأعلى ولأسفل مرة أو مرتين قبل إزالة 75 ميكرولتر ، مما يسمح بطلاء أكثر اتساقا.
  14. ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا مع إدخالات زراعة الخلايا على منصة دوارة لمدة 10 دقائق للسماح بمزيد من التشتت المنتظم عبر إدخال زراعة الخلية.
  15. ضع اللوحة في حاضنة معقمة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
  16. في اليوم التالي (اليوم 1) ، قم بإزاحة شظايا القولون غير المرفقة عن طريق سحب الوسط لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات باستخدام ماصة P200. ضع الطرف برفق بجانب الجزء الداخلي من ملحق زراعة الخلايا حتى لا يعطل الخلايا المعوية المرفقة. لا تدخل فقاعات في الوسط ، لأن هذا يمنع إزالة جميع الأجزاء غير المرفقة.
  17. قم بإزالة الخليط المتوسط والقولون على الفور. كرر حتى يتم تنظيف جميع إدخالات زراعة الخلايا.
  18. أضف برفق 150 ميكرولتر من وسط أحادي الطبقة المريء المسخن مسبقا إلى الجانب القمي لكل ملحق لزراعة الخلايا. أضف 400 ميكرولتر من وسط أحادي الطبقة الدافئ للفأر إلى كل بئر من صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا. انقل ملحق زراعة الخلايا إلى اللوحة الجديدة عن طريق الإمساك بالشق باستخدام ملقط معقم. قم بتغيير الوسيط كل يوم حتى التقاء.
    ملاحظة: يجب أن تشكل شظايا القولون طبقة أحادية متقاربة بعد 3-5 أيام من الطلاء.

7. قياس المقاومة الصافية للطبقات الأحادية الظهارية باستخدام مقياس الفولتوم في الأيام 3 - 5 من الاستزراع أحادي الطبقة

ملاحظة: تشبه أقطاب عيدان تناول الطعام الملقط وهي غير متماثلة في الطول. الذراع الأطول للمسبار هو القطب القاعدي ، والذراع الأقصر هو القطب القمي. قد يكون من الصعب إدخال المسبار بين الجزء الداخلي والخارجي من ملحق زراعة الخلية. إن وضع المسبار بزاوية طفيفة عند الإدخال ، متبوعا بالاستقامة الرأسية للمسبار ، سيمنع المسبار من التعثر. تأكد من قراءة المقاومة الصافية لكل إدراج مزرعة خلية بزاوية مماثلة ، حيث يمكن أن يؤثر ذلك على القيم.

  1. ضع مقياس الفولتومتر وجميع الكواشف داخل خزانة السلامة البيولوجية.
    1. قم بتوصيل مقياس الفولتومتر بأقرب منفذ تيار متردد ، وقم بتوصيل الموصل المعياري البلاستيكي لمسبار القطب بمقبس INPUT على الشاشة الأمامية.
    2. لوضع مقياس الفولتوم بزاوية 45 درجة ، قم بتدوير الذراع المعدني على الجانب الخلفي من الجهاز للخارج حتى يستقر في مكانه.
    3. الآن ، قم بتشغيل مقياس الفولتوم عن طريق قلب مفتاح الطاقة لأعلى على الشاشة الأمامية. أخيرا ، اقلب المفتاح لأعلى باتجاه OHMS لعرض القراءة في هذا المقياس.
  2. قم بإزالة لوحة 24 بئرا من حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، ووضع اللوحة بشكل مسطح في خزانة السلامة البيولوجية. المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) حساسة لدرجة الحرارة. قم بإزالة اللوحة فقط قبل قراءة TEER مباشرة.
  3. تعقيم مسبار القطب في الإيثانول المسخن مسبقا بنسبة 70٪ لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة. قم بإزالة المسبار ، واقلبه ، ونفضه مرة إلى مرتين لإزالة الإيثانول الزائد. اترك المسبار يجف في الهواء لمدة 30 ثانية تقريبا.
  4. اغسل أي إيثانول متبقي على المسبار باستخدام وسيط غسيل الماوس المسخن مسبقا.
    تنبيه: لا تدع أيا من قطرات الإيثانول المتبقية أعلى المسبار تسقط في ملحق مزرعة الخلية. عند غسل الإيثانول بوسط ، لا تدع الوسط يتجاوز حقل الإيثانول المعقم. قد يتسبب ذلك في دخول الوسط الملوث إلى إدخال مزرعة الخلية.
  5. امسك المسبار بشكل عمودي على إدراج ثقافة الخلية. أدخل القطب القاعدي الجانبي (الطرف الأطول من المسبار) على السطح الخارجي لمزرعة الخلية حتى يلامس قاعدة لوحة 24 بئرا. حرك القطب القمي (الطرف الأقصر للمسبار) في ملحق زراعة الخلية. لا تغير مسافة القطبين من بئر إلى بئر. سيؤثر هذا على قياس TEER.
  6. تحقق من أن القطب القمي لا يلامس قاعدة ملحق زراعة الخلية قبل قراءة TEER. ابدأ بإدراج ثقافة خلية التحكم في الخلفية ، وقم بتسجيل القيمة. سيتم عرض القيمة تلقائيا رقميا في مقدمة مقياس الفولتومتر.
  7. كرر الخطوات من 7.5 إلى 7.6 لكل إدراج لمزرعة خلية.
    ملاحظة: في حالة وجود ظروف تجريبية مختلفة بين إدخالات زراعة الخلايا ، قم بتعقيم المسبار بين كل حالة جديدة. ابدأ في الخطوة 7.1 ، وتابع عدديا خلال الخطوات.
  8. ضع لوحة 24 بئرا مرة أخرى في الحاضنة بمجرد تسجيل جميع قياسات TEER.
  9. تشير القيم الصافية عند 350 Ω أو أكثر إلى تكوين طبقة واحدة. كرر مرة أخرى في الأيام اللاحقة حتى يتم تحقيق تكوين أحادي الطبقة.
    ملاحظة: بشكل عام ، يمكن التقاط قيم 1000 Ω أو أكثر في اليوم 3 ، ولكن بمرور الوقت ، سوف تتقارب جميعها على رقم أقل حوالي 350 Ω.

8. حساب TEER باستخدام قياسات المقاومة الصافية من مقياس الفولتومتر

ملاحظة: سيعطي التكوين الناجح أحادي الطبقة للقولونويدات قياسات TEER أكبر من 115 Ω سم2.

  1. خذ قيم المقاومة الصافية الفردية ، واطرح صافي المقاومة من الخلفية جيدا. ستعطي إدخالات زراعة الخلايا المطلية بغشاء مصفوفة القاعدية قراءة صافية تبلغ حوالي 100 Ω.
  2. خذ قياسات المقاومة الصافية المطروحة في الخلفية ، واضربها في مساحة سطح ملحق زراعة الخلية. تبلغ مساحة سطح ملحق زراعة الخلايا المكون من 24 بئرا 0.33 سم2.
  3. إذا كانت القيم 115 Ω سم2 أو أكبر ، فانتقل إلى المقايسات التجريبية النهائية.

9. إحداث التهاب في أحاديات الظهارة مع وسطاء التهابيين

  1. بمجرد تشكيل أحاديات الطبقة الناجحة ، أضف وسطاء التهابيين إلى الثقافة على الجانب القاعدي من الثقافة. قم بإعداد وسط أحادي الطبقة لوسيط الالتهاب ، كما هو موضح في الخطوة 1.9 ، وأضف 400 ميكرولتر إلى كل بئر في لوحة جديدة مكونة من 24 بئرا.
  2. قم بإزالة الوسط من الجانب القمي لإدخال زراعة الخلية ، وأضف 150 ميكرولتر من وسط طبقة الفئران الأحادية بدون Y-27632. لا تكمل هذا الجانب مع وسطاء التهابية. ومع ذلك ، إذا كان موت الخلية يبدو مفرطا ، فاترك Y-27632 في وسائل الإعلام. يجب تحديد ذلك من قبل المستخدم النهائي.
  3. انقل إدخالات زراعة الخلايا إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا ، وضعها في الآبار المكملة بوسط أحادي الطبقة وسيط الالتهاب.
  4. تحفيز أحادي الطبقات مع وسطاء التهابية لمدة 24-72 ساعة ، وهذا يتوقف على التجربة.
  5. لاختبار الاستجابات الدوائية باستخدام هذا النموذج الالتهابي ، استكمل الوسط أحادي الطبقة على الجانب القمي من إدراج مزرعة الخلية بالدواء المفضل. يمكن إضافة الدواء في أي مرحلة من التجربة ، اعتمادا على آلية عمل الدواء والمعلمات النهائية المراد تقييمها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام ثقافة القولون المعوي 3D هو أداة لا تقدر بثمن لدراسة المساهمة الجوهرية للظهارة في توازن الغشاء المخاطي في الأمعاء. يوفر البروتوكول الموصوف تعليمات مفصلة حول كيفية عزل الخبايا من الفئران C57BL / 6J (WT) في عمر 8 أسابيع وإنشاء نظام زراعة القولون طويل الأجل يمكن معالجته لتطبيقات متعددة في المصب. عند عزل وطلاء الخبايا في مصفوفة الغشاء القاعدي ، تظهر الخبايا كثيفة ومتعددة الخلايا في الهيكل عند تصورها بواسطة المجهر مشرق المجال. يمكن أن تكون كروية الشكل أو ممدودة وأسطوانية ، تشبه البنية المفردة التي تشبه القبو والتي يتم ملا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحدث تطور المواد العضوية ثورة في الطريقة التي يدرس بها المجتمع العلمي أنظمة الأعضاء في المختبر مع القدرة على تلخيص البنية الخلوية والوظيفة جزئيا من أو إنسان في طبق. علاوة على ذلك ، توفر الأنظمة العضوية المشتقة من البشر المصابين بأمراض أداة واعدة للطب الشخصي الذي يمكن أن يوجه عملية صنع القرار العلاجي. هنا ، نصف بروتوكول عزل القبو الذي يعمل بشكل جيد ويقدم خطوات رئيسية تسمح بتنظيف الحطام الزائد في العزل قبل الطلاء. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح التفاصيل الرئيسية التي غالبا ما يتم تجاهلها في العملية - القدرة على حساب الخب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون المساهمون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R01DK120986 (إلى K.P.M.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.4-& مو M شفاف transwell ، 24 بئرGreiner Bio-one662-641
15 مل أنابيب مخروطيةThermo Fisher   ؛12-565-269
50 مل أنابيب مخروطيةThermo Fisher & nbsp ؛12-565-271
70-& مو ؛ مصفاة الخلايا MVWR76327-100
Advanced DMEM / F12Invitrogen12634-010تركيز المخزون (1x) ؛ التركيز النهائي (1x) مكمل
B-27   ؛Invitrogen12587-010تركيز المخزون (50x) ؛ التركيز النهائي (1x)
مجموعة قطب عيدان تناول الطعام ل EVOWorld Precision InstrumentsSTX2
Corning Matrigel GFR Membrane MixCorning354-230تركيز المخزون (100٪) ؛ التركيز النهائي (100٪)
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-5Gتركيز المخزون (1 م) ؛ التركيز النهائي (1.5 مل); مذيب (ماء فائق النقاء)
DMEM ارتفاع الجلوكوزثيرمو فيشر11960-069تركيز المخزون (1x) ؛ التركيز النهائي (1x)
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco بدون الكالسيوم والمغنيسيومGibco   ؛14190-144تركيز المخزون (1x) ؛ التركيز النهائي (1x) حمض
الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (ETDA)سيجما ألدريتشE7889تركيز المخزون (0.5 م) ؛ التركيز النهائي (30 ملم)
تركيز مخزون مصل الأبقار الجنينيBio-TechneS11150H(100٪) ؛ التركيز النهائي (1٪)
مجهر Fisherbrand Superfrost Plus ، أبيض ، 25 × 75 ممThermo Fisher   ؛12-550-15
G418InvivoGenant-ga-1التركيز النهائي (400 & micro; ز /& مايكرو ؛ ل)
كاشف الجنتاميسينجيبكو / فيشر15750-060تركيز المخزون (50 مجم / مل) ؛ التركيز النهائي (250 مو ؛ جم / مل)
تركيز المخزون GlutaMAX-1Fisher Scientific35050-061(100x) ؛ التركيز النهائي (1x)
HEPES 1 MGibco15630-080تركيز المخزون (1 م) ؛ التركيز النهائي (10 ملم)
hIFN & جاما ؛R & D Systems285-IFتركيز المخزون (1000 نانوغرام/&ميكرو ؛ L); التركيز النهائي (10 نانوغرام / مل); المذيبات (ماء عالي النقاء)
hIL-1 & بيتا ؛R & D Systems201-LBتركيز المخزون (10 نانوغرام /& ميكرو ؛ L); التركيز النهائي (20 نانوغرام / مل) ؛ المذيب (ماء عالي النقاء)
hTNF & alpha ؛R & D Systems210-TAتركيز المخزون (10 نانوغرام /&ميكرو ؛ L); التركيز النهائي (40 نانوغرام / مل); مذيب (ماء عالي النقاء)
بيروكسيد الهيدروجين   ؛سيجماH1009(30٪) ؛ التركيز النهائي (0.003٪) ؛ المذيبات (وسائط غسيل الماوس)
Hygromycin B GoldInvivoGenant-hg-1التركيز النهائي (400 & micro; ز /& مايكرو ؛ L)
L-WRN Cell LineATCCCRL-3276
mEGFNovusNBP2-35176تركيز المخزون (0.5 وميكرو ؛ ز /& مايكرو ؛ L); التركيز النهائي (50 نانوغرام/مل); مذيب (D-PBS + 1٪ BSA)
N-2 مكملInvitrogen17502-048تركيز المخزون (100x) ؛ التركيز النهائي (1x)
N-Acetyl-L-cysteineSigma تركيز مخزون A9165-5G(500 ملم) ؛ التركيز النهائي (1 مليمتر) ؛ مذيب (ماء فائق النقاء)
NogginPeprotech250-38تركيز المخزون (0.1 نانوغرام /& ميكرو ؛ L); التركيز النهائي (100 نانوغرام / مل) ؛ مذيب (ماء فائق النقاء + 0.1٪ BSA)
بنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)ثيرمو فيشر15140-122تركيز المخزون (100x) ؛ التركيز النهائي (1x)
أطباق بتري (معقمة ؛ 100 مم × 15 مم) البوليسترين القابل للتصرفVWR25384-342
ألواح دقيقة من البوليسترين ، 24 زراعة أنسجة جيدة معالجة ، معقمةGreiner Bio-one5666-2160
R-SpondinR & D Systems3474-RS-050تركيز المخزون (0.25 وميكرو ؛ ز /& مايكرو ؛ L); التركيز النهائي (500 نانوغرام / مل); مذيب (D-PBS + 1٪ BSA)
Tryp LE ExpressThermo Fisher12604-013تركيز المخزون (10x) ؛ التركيز النهائي (1x) ؛ مذيب (1 ملي مولار EDTA)
ماء فائق النقاء   ؛Invitrogen10977-023تركيز المخزون (1x) ؛ التركيز النهائي (1x)
Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد   ؛Abcamab120129تركيز المخزون (10 ملم) ؛ التركيز النهائي (10 وميكرو ؛ M); مذيب (ماء فائق النقاء)
شرائح تركيز مخزون

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
  3. Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
  4. Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222(2013).
  7. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
  8. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  9. Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
  12. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  13. Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102(2021).
  14. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678(2012).
  15. Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
  16. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
  19. Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38(2019).
  20. Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
  21. Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202(2017).
  22. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
  23. Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054(2020).
  24. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  25. Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
  26. Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة