يصف البروتوكول الحالي طريقة فعالة للاكتساب الديناميكي في الوقت الفعلي لتيارات قناة البوتاسيوم ذات الجهد الكهربائي (Kv) في خلايا عضلة القلب H9c2 باستخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تسجيل تيار البوتاسيوم المعتمد على الجهد على خلايا عضلة القلب H9c2 عبر تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب قنوات البوتاسيوم على غشاء خلية عضلة القلب دورا مهما في تنظيم الأنشطة الكهربية للخلية. كونها واحدة من القنوات الأيونية الرئيسية ، ترتبط قنوات البوتاسيوم ذات الجهد الكهربائي (Kv) ارتباطا وثيقا ببعض أمراض القلب الخطيرة ، مثل تلف عضلة القلب الناجم عن الأدوية واحتشاء عضلة القلب. في الدراسة الحالية ، تم استخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة لتحديد تأثيرات 1.5 mM 4-aminopyridine (4-AP ، مثبط قناة البوتاسيوم واسع الطيف) والأكونيتين (AC ، 25 μM ، 50 μM ، 100 μM ، و 200 μM) على تيار قناة Kv (IKv) في خلايا عضلة القلب H9c2. وجد أن 4-AP يثبط I Kv بحوالي 54٪ ، بينما أظهر التأثير المثبط للتيار المتردد على IKv اتجاها يعتمد على الجرعة (لا يوجد تأثير ل 25 ميكرومتر ، ومعدل مثبط 30٪ ل 50 ميكرومتر ، ومعدل مثبط 46٪ ل 100 ميكرومتر ومعدل تثبيط 54٪ ل 200 ميكرومتر). نظرا لخصائص الحساسية والدقة العالية ، ستعزز هذه التقنية استكشاف السمية القلبية والتأثيرات الدوائية للطب العرقي الذي يستهدف القنوات الأيونية.
المقدمة
القنوات الأيونية هي بروتينات متكاملة خاصة مضمنة في الطبقة المزدوجة الدهنية لغشاء الخلية. في وجود المنشطات ، تشكل مراكز هذه البروتينات المتكاملة الخاصة مسام انتقائية للغاية محبة للماء ، مما يسمح للأيونات ذات الحجم والشحنة المناسبين بالمرور بطريقة نقل سلبية1. القنوات الأيونية هي أساس استثارة الخلية والكهرباء الحيوية وتلعب دورا رئيسيا في مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية2. يمد القلب الأعضاء الأخرى بالدم من خلال الانقباضات المنتظمة الناتجة عن عملية اقتران الإثارة والانقباض التي بدأتها جهود الفعل3. أكدت الدراسات السابقة أن توليد إمكانات الفعل في خلايا عضلة القلب ناتج عن التغير في تركيز الأيونات داخل الخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تحضين خلايا عضلة القلب للفئران H9c2 التي تم الحصول عليها تجاريا (انظر جدول المواد) في DMEM التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2. ثم تم استخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة للكشف عن التغييرات في IKv في خلايا H9c2 العادية والخلايا المعالجة ب 4-AP أو AC (الشكل 1 والشكل 2).
1. إعداد الحل
- تحضير وسط زراعة الخلايا DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد محلول 1.5 M....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
سمح هذا البروتوكول بتسجيل IKv وفقا للمعايير المحددة في تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة. تم تشغيل IKv بواسطة 150 مللي ثانية من تحفيز النبض غير المستقطب من -40 إلى +60 مللي فولت عند إمكانية الاحتفاظ ب -60 مللي فولت (الشكل 3 أ). ظهر IKv لخلايا عضلة القلب للفئران H9c2 لأول مرة حوالي -20 مللي فولت ، ثم زادت السعة مع مزيد من إزالة الاستقطاب. تم حساب متوسط العلاقة بين IKv وجهد الغشاء من السعات الحالية المقاسة. أظهرت النتائج أنه بالمقارنة مع المجموعة الض.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تستخدم تقنية الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح بشكل أساسي لتسجيل وعكس النشاط الكهربائي والخصائص الوظيفية للقنوات الأيونية على غشاء الخلية25. في الوقت الحاضر ، تشمل طرق التسجيل الرئيسية لتقنية مشبك التصحيح التسجيل أحادي القناة وتسجيل الخلية بأكملها26. بالنسبة لوضع الخلية الكاملة ، يتم استخدام القطب الزجاجي الدقيق والضغط السلبي لتشكيل ختم عالي المقاومة بين مساحة صغيرة من غشاء الخلية وطرف ماصة27. بمجرد أن يتسبب الضغط السلبي المستمر في تمزق طرف الماصة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نحن نقدر الدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82130113) وبرنامج البحث والتطوير والتحول الرئيسي التابع لإدارة العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة تشينغهاي (2020-SF-C33).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
| Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co.، Ltd | DSTDW000602 | |
| مكبر للصوت | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
| الميزان التحليلي | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2< / sub> | Solarbio | 416O022 | |
| زجاج البورسليكات مع خيوط (OD: 1.5 مم ، معرف: 1.10 مم ، طول 10 سم) | أداة سوتر | 163225-5 | |
| طبق ثقافة الخلية (100 مم) | شركة Zhejiang Sorfa Life Science Research Co.، Ltd | 1192022 | |
| طبق ثقافة الخلية (35 مم) | شركة Zhejiang Sorfa Life Science Research Co.، Ltd | 3012022 | |
| Clampex software | Molecular Devices، LLC. | الإصدار 10. 5 | |
| برنامج Clampfit | Molecular Devices، LLC. | الإصدار 10. 6. 0. 13 | برنامج تجميع البيانات |
| D- (+) - الجلوكوز | Rhawn | RH289133 | |
| الكاميرا الرقمية | Hamamatsu | C11440 | |
| محول الأرقام | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co.، Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| مصل الأبقار الجنين | Gibco | 2166090RP | |
| مجتذب الماصات الدقيقة المشتعلة / البني | أداة سوتر | نموذج الصك P-1000 | |
| H9c2 خلايا | هونان فنغوي التكنولوجيا الحيوية المحدودة | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | Sichuan Xilong Scientific Co.، Ltd | 2106081 | |
| HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co.، Ltd | 20210221 | |
| KCl | Chengdu Colon Chemical Co.، Ltd | 2020082501 | |
| KOH Chengdu | Colon Chemical Co.، Ltd | 2020112601 | |
| MgCl2< / sub> | Tianjin Guangfu Fine Chemical | Research Institute 20160408 | |
| MgCl2& middot; 6H2< / sub>O | تشنغدو القولون الكيميائية المحدودة | 2021020101 | |
| Micromanipulator | أداة سوتر | MP-285A | |
| مجهر | أوليمبوس | IX73 | |
| مجهر غطاء زجاجي (20 مرة ؛ 20 مم) | جيانغسو Citotest المعدات التجريبية المحدودة | 80340-0630 | |
| Milli-Q | تشنغدو التكنولوجيا البيولوجية المحدودة | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B قائد | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | برنامج مضخم الإشارة |
| برنامج OriginPro 8 | OriginLab Corporation | v8.0724 (B724) | |
| (100x) | Boster Biological Technology Co.، Ltd | 17C18B16 | |
| PH & nbsp ؛ متر | Mettler Toledo | S201K | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x) | Gibco | 8120485 | |
| Trypsin 0.25٪ (1x) | HyClone | J210045 |
المراجع
- Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
- Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
