مقالة منهجية

تحليلات التعبير الجيني في البصيلات البشرية

DOI:

10.3791/64807

⸱

فبراير 17, 2023

 ,  , 
1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف بروتوكولا يحدد كيفية عزل بصيلات المبيض البشرية عن الأنسجة القشرية المذابة المجمدة لإجراء تحليلات التعبير الجيني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المبيض هو عضو غير متجانس يتكون من أنواع مختلفة من الخلايا. لدراسة الآليات الجزيئية التي تحدث أثناء تكوين الجريب ، يمكن إجراء توطين البروتينات والتعبير الجيني على الأنسجة الثابتة. ومع ذلك ، لتقييم مستويات التعبير الجيني بشكل صحيح في جريب بشري ، يجب عزل هذا الهيكل المعقد والدقيق. ومن ثم ، تم تطوير بروتوكول معدل سبق وصفه من قبل مختبر وودروف لفصل البصيلات (البويضة والخلايا الحبيبية) عن البيئة المحيطة بها. تتم معالجة الأنسجة القشرية المبيضية يدويا أولا للحصول على شظايا صغيرة باستخدام أداتين: قطاعة الأنسجة ومفرمة الأنسجة. ثم يتم هضم الأنسجة إنزيميا مع 0.2 ٪ كولاجيناز و 0.02 ٪ DNase لمدة 40 دقيقة على الأقل. يتم تنفيذ خطوة الهضم هذه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ويرافقها ماصة ميكانيكية للوسط كل 10 دقائق. بعد الحضانة ، يتم جمع البصيلات المعزولة يدويا باستخدام ماصة شعرية دقيقة معايرة تحت تكبير المجهر. إذا كانت البصيلات لا تزال موجودة في قطع الأنسجة ، يتم الانتهاء من الإجراء بالتشريح المجهري اليدوي. يتم جمع البصيلات على الجليد في وسط استزراع ويتم شطفها مرتين في قطرات من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يجب التحكم في عملية الهضم هذه بعناية لتجنب تدهور الجريب. بمجرد أن يبدو أن بنية البصيلات معرضة للخطر أو بعد 90 دقيقة كحد أقصى ، يتم إيقاف التفاعل بمحلول مانع 4 درجات مئوية يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. يجب جمع ما لا يقل عن 20 جريبا معزولا (بحجم أقل من 75 ميكرومتر) للحصول على كمية كافية من إجمالي الحمض النووي الريبي بعد استخراج الحمض النووي الريبي لتفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-qPCR). بعد الاستخراج ، يصل القياس الكمي للحمض النووي الريبي الكلي من 20 بصيلة إلى قيمة متوسطة تبلغ 5 نانوغرام / ميكرولتر. ثم يتم نسخ الحمض النووي الريبي الكلي إلى cDNA ، ويتم تحليل الجينات ذات الأهمية باستخدام RT-qPCR.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المبيض هو عضو معقد يتكون من وحدات وظيفية وهيكلية ، بما في ذلك البصيلات داخل القشرة والسدى. تمت دراسة الجريب ، وهي عملية تنشيط الجريب والنمو والنضج من حالة هادئة بدائية إلى جريب ناضج قادر على الإخصاب ودعم التطور الجنيني المبكر ، على نطاق واسع في البحث1. يمكن أن يؤدي كشف الآليات التي تقود هذه الظاهرة إلى تحسين رعاية الخصوبة للنساء2. تسمح التحليلات على الأنسجة البشرية الثابتة بتقييم التعبير البروتيني وتوطين الجينات داخل الوحدات الوظيفية للمبيض 3,4. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تقنيات محددة لفصل البصيلات عن القشرة المحيطة لتقييم مستويات التعبير الجيني بدقة داخل بصيلات المبيض. ومن ثم ، في دراسة سابقة ، تم تطوير تقنية عزل الجريب للسماح بتحليل التعبير الجيني مباشرة من الوحدة الوظيفية للمبيض5. تم تطوير طرق مختلفة ، مثل الهضم الأنزيمي و / أو العزل الميكانيكي ، بالإضافة إلى التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، والذي يسمح بعزل الجريب داخل قطعة من الأنسجة6،7،8،9. يستخدم عزل الجريب على نطاق واسع ، إما مع أنسجة المبيض البشرية أو الحيوانية ، لتقييم ملامح التعبير الجيني للجريبات في جميع مراحل التطور10،11،12. ومع ذلك ، يجب أن يأخذ إجراء العزل الأمثل في الاعتبار البنية الهشة للجريب داخل القشرة الكثيفة ، وبالتالي ، يجب إجراؤه بعناية لتجنب أي ضرر7. تصف هذه المخطوطة إجراء، مقتبسا من بروتوكول وصفه مختبر وودروف، لعزل البصيلات البشرية عن قشرة المبيض المذابة المجمدة من أجل إجراء تحليلات التعبير الجيني13.

الخطوة الأولى لعزل جريب المبيض من الأنسجة البشرية المجمدة هي إجراء الذوبان. يتم تنفيذ هذه العملية بناء على البروتوكول السريري المستخدم لتطعيم أنسجة المبيض المحفوظة بالتبريد ، كما هو موضح سابقا14،15. تهدف العملية إلى إزالة العوامل الواقية من البرودة عن طريق شطف قشرة المبيض بتركيزات متناقصة من الوسط. ثم يتم تفتيت الأنسجة قبل العزل الأنزيمي والميكانيكي لاسترداد البصيلات. يمكن تمييز البصيلات في مراحل مختلفة باستخدام مجهر مجسم ذو تكبير عالي وبصريات عالية الجودة من أجل عزل تلك ذات الأهمية. يتم قياس كل جريب معزول باستخدام مسطرة مدمجة في المجهر ، ويمكن تجميع البصيلات وفقا لمرحلة نموها: بصيلات بدائية (30 ميكرومتر) ، بصيلات أولية (60 ميكرومتر) ، بصيلات ثانوية (120-200 ميكرومتر) ، وجريبات غارية (>200 ميكرومتر) 16. يمكن إجراء مزيد من التصنيف وفقا لمورفولوجيا البصيلات: تحتوي البصيلات البدائية على طبقة واحدة من الخلايا الحبيبية المسطحة (GCs) ، وتحتوي البصيلات الأولية على طبقة واحدة من GCs المكعبة ، وتحتوي البصيلات الثانوية على طبقتين على الأقل من GCs المكعبة ، ووجود تجويف بين GCs يميز المرحلة الغارية. عندما يتم اختيار بصيلات الاهتمام ، يتم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي. يتم تقييم كمية وجودة الحمض النووي الريبي قبل تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-qPCR) (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذا المشروع من قبل اللجنة الأخلاقية لمستشفى Erasme (بروكسل ، بلجيكا). خضعت المريضة المشمولة بهذا البروتوكول لحفظ أنسجة المبيض بالتبريد (OTC) للحفاظ على الخصوبة قبل التعرض للعلاج الكيميائي في عام 2000. وقعت المريضة موافقة خطية مستنيرة للتبرع بأنسجتها المجمدة المتبقية للبحث في نهاية فترة التخزين.

1. ذوبان أنسجة المبيض المحفوظة بالتبريد

  1. تحضير لوحة 6 آبار تحتوي على خمسة حلول ذوبان. يحتوي البئر الأول على 5 مل من محلول الحماية من التبريد يتكون من وسط Leibovitz-15 ، و 0.1 مول / لتر سكروز ، و 1.5 مول / لتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، و 1٪ ألبومين مصل بشري (HSA). تحتوي الآبار التالية على 5 مل من وسط Leibovitz-15 مع تركيزات متناقصة من المواد الواقية من التبريد: 1 مول / لتر ، 0.5 مول / لتر ، و 2 × 0 مول / لتر DMSO.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف محلول الحماية من التبريد وفقا للبروتوكول المستخدم في عيادة الخصوبة.
  2. قم بإزالة قارورة تحتوي على جزء قشري مبيض من النيتروجين السائل وفقا لقواعد السلامة (القفازات المبردة والنظارات الواقية والأحذية المغلقة) ، واحتفظ بالأنبوب في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 ثانية.
  3. نقع القارورة في الماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة في RT مع تحريض لطيف قبل فتح القارورة تحت غطاء عمودي ونقلها مباشرة إلى البئر الأول من لوحة 6 آبار (على الجليد).
  4. نقل الشظية على التوالي إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار ، حيث يحتوي كل منها على تركيزات متناقصة من المواد الواقية من التبريد في 5 مل من وسط Leibovitz-15. حرك الأنسجة برفق في كل وسط لمدة 5 دقائق (على الثلج).

2. عزل الجريب

ملاحظة: يتم إجراء جميع التجارب باستخدام مواد خالية من RNase وتحت غطاء رأسي.

  1. انقل الأنسجة المذابة إلى طبق بتري شبكي 2 مم مملوء ب 10 مل من وسط التشريح (وسط ليبوفيتز -15 ، بيروفات الصوديوم [2 مليمول / لتر] ، إل-جلوتامين [2 مليمول / لتر] ، HSA [0.3٪] ، بنسلين G [30 ميكروغرام / مل] ، وستربتومايسين [50 ميكروغرام / مل]). اضبط حجم الأنسجة بمشرط إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: اعتمادا على البروتوكول السريري ، يمكن أن يختلف حجم الأنسجة المجمدة من 8 مم × 4 مم × 1 مم إلى 4 مم × 2 مم × 1 مم. لهذا البروتوكول ، تم استخدام شريطين من 4 مم × 2 مم × 1 مم.
  2. قم بتكديس القطع الثلاث من قطاعة الأنسجة ، وضع الجزء بين الكتلتين ، وقطع الجزء إلى نصفين باستخدام شفرة ، وانزلق عبر الكتل للحصول على شظيتين بسمك 0.5 مم.
  3. استخدم مفرمة الأنسجة لقطع الجزء والحصول على قطع أصغر. إذا لزم الأمر ، قم بقص القطع المتبقية يدويا بمشرط حتى يتم تحطيم الأنسجة تماما.
  4. انقل الأنسجة المجزأة إلى طبق بتري شبكي مملوء ب 7 مل من وسط الهضم (وسط استزراع [وسط McCoy's 5A ، 3 مليمول / لتر جلوتامين ، 0.1٪ HSA ، 30 ميكروغرام / مل بنسلين G ، 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 2.5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين ، 4 نانوغرام / مل سيلينيوم ، و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك] مكمل ب 0.2٪ كولاجيناز و 0.02٪ DNase).
  5. ضع الطبق في الحاضنة عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية. كل 10 دقائق ، أخرج طبق بتري من الحاضنة ، واغسل الأنسجة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1 مل.
  6. بعد 45 دقيقة من الحضانة في وسط الهضم ، ضع الطبق تحت مجهر مجسم مع نطاق تكبير من 5x-6.3x ، واسترجاع البصيلات باستخدام ماصة شعرية دقيقة. حدد بصيلات الاهتمام ، واعزلها عن طريق امتصاصها باستخدام ماصة الفم.
    ملاحظة: يجب إجراء سحب الفم بعناية لتجنب فقدان المواد في الأنبوب والتلوث.
  7. إذا ظلت البصيلات عالقة في قطعة من القشرة ، فقم بعزلها ميكانيكيا باستخدام حقنتين 27 جم عن طريق تمزيق القشرة بطرف المحاقن لتحرير البصيلات من السدى.
    ملاحظة: لا تلمس البصيلات مع المحاقن لتجنب إتلافها.
  8. نقل البصيلات مع الشعيرات الدموية الدقيقة في لوحة 4 آبار تحتوي على قطرات من 15 ميكرولتر من وسط الاستزراع المعاير المغطى ب 500 ميكرولتر من ثقافة الزيت (1 إلى 10 بصيلات لكل قطرة). تحافظ هذه الخطوة على صلاحية الجريب أثناء عملية التجميع. في نهاية الإجراء ، شطف البصيلات مرتين لمدة 5 ثوان في كل مرة في قطرتين من 15 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مغطى ب 500 ميكرولتر من ثقافة الزيت (على الجليد).
  9. اجمع 20 بصيلة بأقل كمية من PBS باستخدام ماصة الفم (بحد أقصى 10 ميكرولتر) في أنبوب فارغ ، واحتفظ بالأنبوب على الجليد.
    ملاحظة: من أجل استقرار الحمض النووي الريبي ، من الضروري تنفيذ الخطوة 2.8 والخطوة 2.9 على الجليد. هناك حاجة إلى حوالي 20 جريبا (<75 ميكرومتر) للحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي ل RT-qPCR القياسي (SYBR Green).
  10. بعد 90 دقيقة كحد أقصى من الحضانة في وسط الهضم ، أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق إضافة فائض من محلول مانع بارد (4 درجات مئوية) (7.5 مل) إلى طبق بتري يتكون من وسط مزرعة مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS).
    ملاحظة: يمكن إضافة محلول الحجب بمجرد أن يلاحظ المجرب وجود بصيلات ملتصقة على اللوحة أو بصيلات تالفة (شكل غير متماثل أو بصيلات داكنة اللون). ينصح بإجراء عزل البصيلات خلال فترة أقصاها 2.5 ساعة لتجنب تلف البصيلات وإجراء استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة بعد العزل.

3. استخراج الحمض النووي الريبي

ملاحظة: يتم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي باتباع الإرشادات المرفقة مع مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي عن طريق تكييف أحجام الشطف.

  1. قم بتعليق البصيلات المعزولة عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول التحلل المزود مع مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي إلى الأنبوب الذي يحتوي على البصيلات تحت غطاء كيميائي ، ودوامة بسرعة عالية (2500 دورة في الدقيقة / دقيقة) لكسر بنية البصيلات. أضف 50 ميكرولتر من الإيثانول (100٪) إلى الأنبوب ، ودوامة لفترة وجيزة بسرعة عالية.
    ملاحظة: نظرا لأن محلول التحلل يحتوي على 2-mercaptoethanol وحمض الثيوسيانيك ، يجب تنفيذ هذه الخطوة بحذر تحت غطاء كيميائي.
  2. نقل الحجم الكلي للأنبوب (حوالي 160 ميكرولتر) إلى مجموعة خرطوشة ميكروفلتر تتكون من عمود وأنبوب تجميع ، وطرده لمدة 10 ثوان عند 16363 × جم عند 4 درجات مئوية. اغسل العمود ب 180 ميكرولتر من محلول الغسيل 1 ، المزود بالمجموعة ، وطرد مركزي الأنبوب لمدة 10 ثوان عند 16363 × جم عند 4 درجات مئوية.
  3. أضف 180 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 ، المرفق مع المجموعة ، إلى العمود ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثوان عند 16363 × جم عند 4 درجات مئوية. نفذ هذه الخطوة مرتين. جهاز طرد مركزي الأنبوب مرة أخيرة لمدة 1 دقيقة لتجفيف الفلتر ، ووضع أنبوب تجميع جديد تحت الخرطوشة.
  4. قم بإجراء شطف الأحماض النووية في خطوتين:
    1. أولا ، أضف 8 ميكرولتر من محلول الشطف الدافئ (75 درجة مئوية) إلى المرشح ، وانتظر لمدة 1 دقيقة في RT ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 16363 × جم عند 4 درجات مئوية.
    2. كرر هذه الخطوة مع 7 ميكرولتر من محلول الشطف.
      ملاحظة: يجب أن يبقى الأنبوب الذي يحتوي على الأحماض النووية المستخلصة على الجليد. لتجنب تلوث الحمض النووي ، يوصى بشدة بخطوة تكميلية لتدهور الحمض النووي - الخطوة 3.5.
  5. احتضان الأنبوب مع 2 وحدة دولية DNase و 1x DNase عازلة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. منع النشاط الأنزيمي مع كاشف تعطيل 1/10 DNase لمدة 2 دقيقة في RT.
  6. جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 1.5 دقيقة عند 16363 × جم عند 4 درجات مئوية. أخيرا ، اجمع التعليق الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي ، وانقله إلى أنبوب جديد.
  7. تقييم كمية الحمض النووي الريبي الموجودة في العينة باستخدام مقياس الطيف الضوئي (برنامج NanoDrop 2000 > الحمض النووي > RNA). استخدم 1 ميكرولتر من محلول الشطف كفراغ ، وقم بقياس كمية الحمض النووي الريبي المستخرجة من البصيلات المعزولة باستخدام 1 ميكرولتر من المحلول.
  8. تحقق من نسبة 260/280 لنقاء الحمض النووي الريبي (حوالي 2.0). قم بتخزين العينة في درجة حرارة -80 درجة مئوية، أو قم بنسخها مباشرة لإجراء RT-qPCR.
    ملاحظة: لتقييم سلامة الحمض النووي الريبي ، يمكن معالجة العينة باستخدام نظام كهربائي آلي عالي الدقة قبل أو بعد التجميد عند -80 درجة مئوية. في هذا العمل ، بعد النسخ العكسي ، تم إجراء RT-qPCR بالدورة التالية:
    عقد المرحلة مع 20 ثانية عند 50 درجة مئوية و 10 دقائق عند 95 درجة مئوية
    40 دورة PCR مع 15 ثانية عند 95 درجة مئوية و 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية
    مرحلة منحنى الذوبان مع 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ، 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 95 درجة مئوية ، و 15 ثانية عند 60 درجة مئوية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام إجراء العزل هذا ، يمكن للمجرب استرداد البصيلات من البيئة اللحمية لإجراء تحليلات محددة للتعبير الجيني. بناء على حجم ومورفولوجيا البصيلات ، من الممكن التمييز بين المراحل المختلفة لتكوين الجريبات. يمكن للمجرب اختيار بصيلات ذات أهمية وفقا لحجمها باستخدام ماصة شعرية دقيقة مكيفة. باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة بحد أقصى 75 ميكرومتر ، من الممكن التمييز بين البصيلات البدائية والأولية من البصيلات الثانوية والغارية والناضجة. علاوة على ذلك ، يمكن للمجرب تأكيد مرحلة الجريب وفقا لمورفولوجيا الجريب. عند دراسة تنشيط الجريب ،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الحفظ بالتبريد لأنسجة المبيض نهجا واعدا للحفاظ على خصوبة مرضى السرطان. في العيادة ، يتم تطعيم الأنسجة القشرية المذابة مرة أخرى في المريض بعد مغفرة ، مما يسمح باستئناف وظيفة المبيض والخصوبة19,20. إلى جانب الاستخدام السريري ، يمكن أيضا التبرع بشظايا المبيض المتبقية للبحث في نهاية فترة التخزين لدراسة الآليات التي تنظم تكوين الجريبات. علاوة على ذلك ، فإن هذا النسيج مفيد بشكل خاص لتطوير بدائل للتطعيم عندما لا يكون ذلك ممكنا ، مثل أنظمة الزراعة في المختبر ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة التميز العلمي (EOS) (ID: 30443682). دكتوراه باحثة مشاركة في الصندوق الوطني للبحوث العلمية البلجيكية (FNRS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق بتري شبكي 2 ممCorning430196
2100 أداة BioanalyzerAgilentG2939BA
2100 برنامج خبيرالإصدار AgilentB.02.08.SI648
لوحة 4 آبارSigma AldrichD6789
لوحة 6 آبارCarl Roth& nbsp ؛ EKX5.1
مجموعة بيكو Agilent Total RNA 6000Agilent5067-1513
حمض الأسكوربيكSigma AldrichA4403
أنابيب الشفاط للماصات الشعرية الدقيقةSigma AldrichA5177
جهاز طرد مركزيEppendorf5424R
Collagenase IVLifeTechnologies17104-019
DMSOسيجما ألدريتشD2650
DNaseسيجما ألدريتشD4527-10kU
FBSGibco10270-106
GoScript عكس النسخPromegaA5003
HSACAF DCF LC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-GlutamineSigma AldrichG7513
McCoy ' s 5A + بيكربونات + HepesLifeTechnologies12330-031
ماكلوين مفرمة المناديلStoelting51350
الشعيرات الدموية الدقيقة RI EZ-Tips 200 & micro ؛ مCooperSurgical7-72-2200 / 1
الشعيرات الدموية الدقيقة RI EZ-Tips 75 & micro ؛ مCooperSurgical7-72-2075 / 1
NanoDrop 2000 / 2000c برنامج التشغيلThermoFisherالإصدار 1.6
مقياس الطيفNanoDrop ThermoFisher2000 / 2000c
البنسلين GSigma AldrichP3032
PowerTrack SYBR مزيج رئيسي أخضرThermoFisherA46109
الاشعال: GDF9< / em>F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
الاشعال: HPRT< / em>F: CCTGGCGTCGTGGATGATGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
الاشعال: Kit Ligand< / em>F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGGT R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
QPCR Quantstudio 3ThermoFisherA33779
RNAطقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي المائي الصغيرThermoFisherAM1931
السيلينيومسيجما ألدريتشS9133
بيروفات الصوديومسيجما ألدريتشS8636
مجهر مجسمنيكونSMZ800
كبريتات الستربتومايسينسيجما ألدريتشS1277
السكروزسيجما ألدريتشS1888
Thermo Scientific Forma Series II  CO2  حاضناتThermoFisher3110
توماس ستادي ريجز قطاعة الأنسجةتوماس Scientific6727C10
TransferrinRoche 10652202001
مجموعات الضوئي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
  3. Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
  4. Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31(2015).
  5. Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
  6. Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417(2011).
  7. Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71(2017).
  8. Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
  9. Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
  10. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
  11. McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423(2022).
  12. Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
  13. Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
  14. Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
  15. Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
  16. Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
  17. Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
  18. Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
  19. Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
  20. Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
  21. Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
  22. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
  23. Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
  24. Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
  25. Dong, F. -L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
  26. Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
  27. Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
  28. Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
  29. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  30. Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
  31. Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
  32. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA RT qPCR

مقالات ذات صلة