مقالة منهجية

استراتيجيات فحص الجزيئات الصغيرة من تحديد الرصاص إلى التحقق من الصحة

923 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64811

⸱

يناير 20, 2023

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

في هذه المقالة

الملخص

المقالات التي تمت مناقشتها: < p class = "jove_content" > Festa ، F. ، Labaer ، J. فحص مثبطات Kinase في المصفوفات الدقيقة للبروتين البشري المجمعة ذاتيا. مجلة التجارب المتصورة. 152 ، e59886 (2019).

Stockman، B. J. et al. فحوصات النشاط القائمة على الرنين المغناطيسي النووي لتحديد تثبيط المركب ، وقيم IC50 ، والنشاط الاصطناعي ، ونشاط الخلية الكاملة لنيوكليوزيد ريبوهيدرولاز. مجلة التجارب المتصورة. 148 ، e59928 (2019).

Gao, S. et al. اختبار عالي الإنتاجية للتنبؤ بالسمية الكيميائية عن طريق التنميط الظاهري الآلي ل Caenorhabditis elegans. مجلة التجارب المتصورة. 145 ، e59082 (2019). < p class = "jove_content" >Axelsson ، H. ، Almqvist ، H. ، Seashore-Ludlow ، B. استخدام التصوير عالي المحتوى لتحديد الاشتباك المستهدف في الخلايا الملتصقة. مجلة التجارب المتصورة. 141 ، e58670 (2018). < p class = "jove_content" >Chorba ، J. S. ، Galvan ، A. M. ، Shokat ، K. M. اختبار لوسيفيراز عالي الإنتاجية لتقييم تحلل البروتين للبروتياز أحادي الدوران PCSK9. مجلة التجارب المتصورة. 138 ، e58265 (2018).

Sullivan ، C. et al. استخدام نماذج أسماك الزرد لعدوى فيروس الأنفلونزا البشرية A لفحص الأدوية المضادة للفيروسات وتوصيف استجابات الخلايا المناعية المضيفة. مجلة التجارب المتصورة. 119 ، e55235 (2017). < p class = "jove_content" >Tiemann، K.، Garri، C.، Wang، J.، Clarke، L.، Kani، K. تقييم مقاومة مثبطات التيروزين كيناز عن طريق استجواب مسارات نقل الإشارة بواسطة مصفوفات الأجسام المضادة. مجلة التجارب المتصورة. 139 ، e57779 (2018). < p class = "jove_content" >Radnai ، L. ، Stremel ، R. F. ، Sellers ، JR ، Rumbaugh ، G. ، Miller ، C. A. تكيف شبه عالي الإنتاجية لمقايسة ATPase المقترنة ب NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة. مجلة التجارب المتصورة. 150 ، e60017 (2019). < p class = "jove_content" >Nandha Premnath ، P. ، Craig ، S. ، McInnes ، C. تطوير مثبطات تفاعلات البروتين والبروتين من خلال REPLACE: تطبيق على تصميم وتطوير مثبطات CDK التنافسية غير ATP. مجلة التجارب المتصورة. 104, e52441 (2015). فئة

Chen ، E. W. ، Ke ، C. Y. ، Brzostek ، J. ، Gascoigne ، N.R.J. ، Rybakin ، V. تحديد وسطاء إشارات مستقبلات الخلايا التائية عبر فحص مكتبات المثبطات الكيميائية. مجلة التجارب المتصورة. 143 ، e58946 (2019).

Takakusagi ، Y. استراتيجية تحليل المعلومات الحيوية والمعلوماتية الحيوية القائمة على المستشعر الحيوي للتحقق العالمي من تفاعلات البروتين الدوائي مجلة التجارب المتصورة. 166 ، e61873 (2020).

Riching ، K. M. ، Mahan ، S. D. ، Urh ، M. ، Daniels ، DL التنميط الخلوي عالي الإنتاجية لمركبات تحلل البروتين المستهدفة باستخدام خطوط خلايا HiBiT CRISPR. مجلة التجارب المتصورة. 165, e61787 (2020).

افتتاحية

أدت ثورة علم الجينوم إلى قدر هائل من المعرفة حول العلاقة بين الاضطراب الجيني والأنماط الظاهرية المختلفة للأمراض1. وقد أدى ذلك إلى التعليق التوضيحي للعديد من البروتينات كأهداف دوائية محتملة وحفز الاهتمام باكتشاف وتطوير المركبات التي تمنع هذه الأهداف2. في هذا السياق ، ظهرت استراتيجيات فحص مختلفة كأساليب مهمة لاكتشاف مركب الضرب ، والتحقق من صحة الهدف ، وقياس صلات الربط ، والانتقائية ، والسمية ، والمشاركة المستهدفة داخل الخلية ، بالإضافة إلى التفاعل المركب والاستقرار وخصائص الحرائك الدوائية. تلتقط هذه المجموعة بعض التطورات المنهجية في هذا المجال بهدف عرض العديد من الاستراتيجيات التي يمكن استخدامها لفحص وتقييم النشاط الكيميائي الحيوي و / أو البيولوجي للجزيئات الصغيرة.

تمثل كينازات البروتين عائلة إنزيم كبيرة تضم أكثر من 500 عضو. هذه الإنزيمات هي المنظمين الرئيسيين لجميع العمليات الخلوية ، وقد تم ربط عطلها بالعديد من الأمراض3. لذلك ، فقد كانوا محور اهتمام شديد باكتشاف الأدوية ، وبالتالي تطوير المنهجية. وهكذا ، فإن أربع مقالات في هذه المجموعة تشير إلى التقدم في هذا المجال. Festa et al. يصف منصة فحص لاكتشاف مثبطات كيناز تستخدم مصفوفات البروتين القابلة للبرمجة ذاتية التجميع (NAPPA) 4. تعرض هذه المصفوفات كيناز بشري كامل الطول وتسمح بفحص متعدد الإرسال للمركبات عبر مجموعة كبيرة من كيناز ، مما يسمح ليس فقط بتحديد الضربات ولكن أيضا بتحديد الانتقائية. Tieman et al. يصف طريقة قائمة على المصفوفة الدقيقة للأجسام المضادة للفوسفو تم تطويرها للكشف عن التغيرات على مستوى الخلية في حالة الفسفرة كقراءة لنشاط مثبط كيناز5. يمكن أن يؤدي هذا إلى رؤى حول طبيعة المسارات التي أصبحت مقاومة للتثبيط ، وهي معلمة مهمة ذات صلة بفهم استجابة الدواء وفعاليتها. تشين وآخرون يصف مقايسة قياس التدفق الخلوي لفحص مجموعات مثبطات كيناز لتحديد المركبات التي تؤثر على إشارات مستقبلات الخلايا التائية (TCR)6. أدت هذه الاستراتيجية إلى التحديد السريع للكينازات المشاركة في إشارات TCR ، مما يشير إلى إمكاناتها كأهداف لتطوير أدوية العلاج المناعي. أخيرا ، يتم تنظيم نشاط العديد من الكينازات من خلال تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) ، مما يشير إلى أن المركبات التي تستهدف PPIs هذه يمكن أن تكون ذات أهمية. Nandha Premnath et al. يصف طريقة تسمى REPLACE (الاستبدال ببدائل الترابط الجزئي باستخدام التخصيب الحسابي) والتي يمكن استخدامها لتطوير PPIs تنافسية غير ATP من الكينازات عن طريق تحويل ميزات روابط الببتيد إلى جزيئات صغيرة تشرك نفس سطح الربط7.

بالإضافة إلى الكينازات ، تلعب العديد من الإنزيمات الأخرى أدوارا في المرض وقد تمت متابعتها في اكتشاف الأدوية. لذلك ، فإن الطرق المحسنة للإنزيمات بخلاف الكينازات هي أيضا ذات أهمية. على سبيل المثال ، ستوكمان وآخرون يصف فحوصات النشاط القائمة على التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) لاكتشاف وتقييم مثبطات الريبوهيدرولازات النيوكليوسيدية من الطفيلي Trichomonas vaginalis8. يمكن أيضا استخدام هذه المقايسات لتحديد قيم IC50 . للفحص عن مثبطات ATPase ، Radnai et al. طور طريقة فحص شبه عالية الإنتاجية تستخدم تنسيق فحص إنزيم مقترن يتضمن إنزيمين (بيروفات كيناز ونازعة هيدروجين اللاكتات) يترجم في النهاية نشاط ATPase إلى مضان جوهري لنيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) كقراءة9. على عكس جميع الإنزيمات الموصوفة حتى الآن والتي يتم معالجتها وتحفز خطوات متعددة ، فإن بروتين محول سوبتيليسين / كيكسين من النوع 9 (PCSK9) هو بروتياز أحادي الدوران يتم تثبيته ذاتيا بواسطة ركيزته. هذا يجعل فحص مثبطات PCSK9 أمرا صعبا ، و Chorba et al. يصف طريقة قائمة على الخلايا عالية الإنتاجية تربط نشاط انقسام PCSK9 بنشاط لوسيفيراز المفرز كقراءة ، وبالتالي تمكين فحص المثبطات10.

بالإضافة إلى العثور على المركبات التي تمنع نشاط الأهداف المختلفة ، فإن المقايسات التي تؤكد أن المركب يشرك هدفه المقصود في الخلايا هي أيضا ذات أهمية كبيرة. Axelsson et al. يصف استراتيجية للتحقق من صحة المشاركة المستهدفة في الخلايا الملتصقة بناء على الجمع بين التصوير عالي المحتوى بواسطة الأجسام المضادة المناعية الفلورية ومقايسة التحول الحراري الخلوي (CETSA) 11. يستخدم هذا الفحص تحديا حراريا متساوي الحرارة للخلايا المعالجة بمجموعة مركبة كبيرة لتحديد المركبات المستقرة. تستخدم الطريقة التي يمكنها تقييم المشاركة المستهدفة ونشاط الجزيئات المتحللة ، التي طورها Riching et al. ، تقنية وضع العلامات HiBiT / LgBiT لإنتاج بروتين مضيء ومراقبة معلمات التحلل عن طريق انخفاض في اللمعان12. أخيرا ، Takakusagi et al. يصف طريقة للتحقق من صحة تفاعلات البروتين والدواء التي تعتمد على استخدام شاشات الببتيد القائمة على العاثية لفحص الارتباط بين أشكال الببتيد المرتبطة بالأدوية والجزيئات الصغيرة13. يتم دمج شاشة عرض الببتيد مع تحليل المعلوماتية الحيوية للتحقق من صحة الارتباط المستهدف.

طبقة أخرى من التحقق من صحة الجزيئات الصغيرة هي توصيف آثارها في النماذج الحيوانية. تتضمن هذه المجموعة طريقتين من هذا القبيل ، إحداهما تستخدم نماذج أسماك الزرد (Danio rerio) لعدوى فيروس الإنفلونزا البشرية A لتقييم فعالية المركبات ذات النشاط المضاد للفيروسات ، بالإضافة إلى الاستجابة المناعية للمضيف14 ، والأخرى تستخدم Caenorhabditis elegans كنموذج لتنميط سمية المركب15. تسلط كلتا الدراستين الضوء على الحاجة إلى طرق محسنة يمكنها تقييم الفعالية والسمية في الجسم الحي.

في الختام ، يعد اكتشاف الأدوية وتطويرها عمليات هائلة مع العديد من الاختناقات والتحديات واحتمال كبير للفشل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استمرار عبء المرض، سواء كان ذلك في مجال الأمراض المعدية حيث يتزايد عدد مسببات الأمراض المقاومة للأدوية بمعدل ينذر بالخطر أو في المناطق التي يزداد فيها انتشار الأمراض المزمنة والأمراض المرتبطة بشيخوخة السكان، يتطلب تركيزنا اهتمامنا وعملنا. تسلط هذه المجموعة الضوء على العديد من الطرق التي تهدف إلى تسريع اكتشاف الأدوية والتحقق من صحتها وتوصيفها. من الآن فصاعدا ، نتوقع أن نرى المزيد من الابتكار في هذا المجال ، لا سيما تلك التي تهدف إلى تحسين إنتاجية الفحص ، وزيادة تنوع المكتبات الكيميائية ، وتطوير نماذج في الجسم الحي متوافقة مع الفحص عالي الإنتاجية (HTS). علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون مهام سير العمل التي توفر رؤية شاملة للفاعلية والانتقائية والخصوصية والفعالية والسمية على نطاق أسرع وأصغر قابلة للتمكين بشكل خاص.

الإفصاحات

M.K. هو مستشار مدفوع الأجر لمحرري علوم الحياة.

شكر وتقدير

M.K. مدعوم جزئيا من قبل NCI T32 CA236754.

المراجع

  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Validation StrategiesKinase Inhibitor ScreeningNMR based Activity AssaysChemical Toxicity PredictionAutomated Phenotypic ProfilingHigh Content ImagingLuciferase AssayAntiviral Drug ScreeningProtein protein Interaction InhibitorsChemical Inhibitor LibrariesDrug protein InteractionsT cell Receptor Signaling

مقالات ذات صلة