يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زرع داخل الصفاق لتوليد سرطان الدم النخاعي الحاد في الفئران

2.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64834

⸱

يناير 6, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Center for Molecular Immunology and Infectious Disease and Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Penn State Cancer Institute, The Pennsylvania State University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، يتم استخدام الحقن داخل الصفاق لخلايا سرطان الدم لإنشاء ونشر سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) في الفئران. هذه الطريقة الجديدة فعالة في الزرع التسلسلي لخلايا AML ويمكن أن تكون بمثابة بديل لأولئك الذين قد يواجهون صعوبات وتناقضات مع الحقن في الوريد في الفئران.

الملخص

هناك حاجة غير ملباة لعلاجات جديدة لعلاج ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) والانتكاس المرتبط به الذي يتضمن الخلايا الجذعية لسرطان الدم المستمر (LSCs). إن نموذج القوارض التجريبي ل AML لاختبار العلاجات القائمة على زرع هذه الخلايا بنجاح عن طريق الحقن المداري الخلفي في الفئران المتلقية محفوف بالتحديات. كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير طريقة سهلة وموثوقة ومتسقة لإنشاء نموذج فأر قوي من AML باستخدام طريق داخل الصفاق. في البروتوكول الحالي ، تم تحويل خلايا نخاع العظم مع فيروس قهقري يعبر عن البروتين الورمي الانصهاري البشري MLL-AF9. تم اختبار كفاءة مجموعات النسب السلبية (Lin-) و Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) كمانحين LSCs في تطوير AML الأولي ، وتم اعتماد الحقن داخل الصفاق كطريقة جديدة لتوليد AML. أجريت مقارنة بين الحقن داخل الصفاق والحقن خلف الحجاج في عمليات زرع متسلسلة لمقارنة وتباين الطريقتين. تم تحويل كل من خلايا Lin- و LSK مع فيروس MLL-AF9 البشري بشكل جيد في نخاع العظام والطحال من المتلقين ، مما أدى إلى ابيضاض الدم النقوي الحاد الكامل. أدى الحقن داخل الصفاق للخلايا المانحة إلى إنشاء AML في المتلقين عند الزرع التسلسلي ، وتم الكشف عن تسلل خلايا AML في الدم ونخاع العظام والطحال والكبد للمتلقين عن طريق قياس التدفق الخلوي و qPCR والتحليلات النسيجية. وبالتالي ، فإن الحقن داخل الصفاق هو وسيلة فعالة لتحريض AML باستخدام الزرع التسلسلي لخلايا اللوكيميا المانحة.

المقدمة

ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) هو نوع من الأورام الخبيثة الدموية من مسببات متنوعة مع سوء التشخيص1. يضع جيل النماذج الحيوانية AML الأساس لفهم الاختلافات المعقدة والبيولوجيا المرضية في محاولة لاكتشاف علاجات جديدة2. يتضمن تكوين اللوكيم في الفئران زرع خلايا مانحة تعبر عن البروتينات السرطانية الانصهارية ، بما في ذلك عمليات الاندماج التي تنطوي على جين سرطان الدم المختلط (MLL) للحث بقوة على AML ، لتقليد المرض في البشر3. تم الإبلاغ عن أصول خلوية مختلفة للخلايا المانحة في زرعAML 4 المرتبط بجين MLL ، مع معرفة القليل جدا عن الخلايا المسؤولة عن أصل المرض.

تم تطوير طرق متعددة للزرع في الفئران. بدلا من الحقن داخل الفخذ ، الذي يدخل مباشرة خلايا مانحة متحولة في نخاع العظم5 ، تم استخدام الحقن الوريدي الذي يستخدم الضفيرة الجيبية الوريدية والوريد الذيل والوريد الوداجي على نطاق واسع لتوليد نماذج AML الفئران6،7،8،9. في حالة الحقن خلف المداري (r.o) ، كانت العديد من العيوب المتأصلة ، مثل الحد من الحجم ، والطلب التقني المرتفع ، وفرص قليلة للمحاولات المتكررة أو الخطأ ، وإصابات العين المحتملة ، عقبات رئيسية مع بدائل محدودة أو معدومة7. يمكن أن يكون لحقن الوريد الذيل مشاكل مماثلة إلى جانب الإصابات المحلية. لتسهيل الإجراء ، غالبا ما تحتاج الفئران إلى التسخين لتوسيع عروق الذيل10. من الصعب أيضا تحديد موقع الوريد الذيل بدون مصدر ضوء إضافي ، خاصة في سلالة الفئران C57BL / 6. بالنسبة لحقن الوريد الوداجي ، يحتاج موظفو البحث إلى تدريب كاف لتحديد موقع الوريد والحد من المضاعفات المحتملة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إجراء كل من حقن الجيوب الأنفية الوريدية والوريد الوداجي تحت التخدير ، مما يضيف مستوى آخر من التعقيد. وبالتالي ، من المغري استكشاف طرق جديدة للزرع لتسهيل إنشاء نماذج الفئران AML.

يستخدم الحقن داخل الصفاق (i.p.) بشكل شائع لإدارة الأدوية والأصباغ والتخدير11،12،13،14،15 ؛ كما تم استخدامه لإدخال الخلايا المكونة للدم لتكوين الدم خارج الرحم16 وزرع الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم في نماذج الفئرانالمختلفة 17،18،19،20،21. ومع ذلك ، فقد تم استخدامه بشكل غير متكرر لإنشاء الأورام الخبيثة المكونة للدم في الفئران ، وخاصة لدراسة تطور مرض AML.

تصف الدراسة الحالية جدوى حقن i.p. في توليد نماذج الفئران AML ، بالإضافة إلى مقارنة كفاءة زرع السكان سلبي النسب (Lin-) و Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) كخلايا مانحة. توفر هذه النتائج طريقة بسيطة وفعالة لإنشاء نماذج تجريبية من ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) وسرطان الدم النخاعي ذي الصلة. مثل هذه الطريقة لديها القدرة على زيادة فهمنا لآليات المرض وكذلك توفير نموذج سهل نسبيا لاختبار العلاجات التجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة المسبقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في جامعة ولاية بنسلفانيا.

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

  1. تحضير الأمبيسلين المكمل (AP) LB لوحات أجار (لوحات معقمة 10 سم). للقيام بذلك ، قم بإذابة 10 غرام من مرق LB مع أجار في 400 مل من الماء المقطر ، وحركه ، وارفع الحجم إلى 500 مل. قم بتعقيم المحلول عن طريق التعقيم ، ثم اترك المحلول يبرد ، وأضف 0.5 مل من الأمبيسلين (المخزون: 150 مجم / مل) في المحلول ، ثم رجه حتى يمتزج. أضف على الفور 18 مل من المحلول إلى طبق معقم مقاس 10 سم بالقرب من مصباح كحولي ، واتركه يتجمد في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخزين الألواح رأسا على عقب عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
  2. تحضير وسائط LB عن طريق إذابة 10 جم من LB بدون أجار في 500 مل من الماء المقطر. تعقيم الحل عن طريق التعقيم ، والسماح للحل لتبرد ، إضافة 0.5 مل من الأمبيسلين (المخزون: 150 ملغ / مل) في الحل ، ورجه لخلط.
  3. قم بإعداد مخزن التدفق عن طريق إضافة 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين و 10 مل من مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (hiFBS) إلى 485 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS).
    ملاحظة: لتعطيل FBS عن طريق التسخين ، ضع زجاجات FBS المذابة في حمام مائي على حرارة 56 درجة مئوية. تأكد من أن الزجاجات لا تنقلب أو تغمرها في حمام مائي. درجة الحرارة أمر بالغ الأهمية للتدهور الكامل. لضمان ذلك ، انتظر حتى تستقر درجة الحرارة عند 56 درجة مئوية بعد وضع الزجاجات في حمام مائي. قم بتدوير الزجاجات برفق كل 10 دقائق ثلاث مرات. لا تسمح للمصل بالاحتضان لأكثر من 30 دقيقة.
  4. قم بإعداد وسائط الصيانة عن طريق إضافة 50 مل من hiFBS و 5 مل من L-glutamine و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين إلى 440 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). تحضير وسائط النقل عن طريق إضافة 50 مل من hiFBS و 5 مل من L-glutamine إلى 445 مل من وسائط DMEM.
  5. قم بإعداد محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) بإضافة 4.145 جم من NH4Cl و 0.504 جم من NaHCO3 و 16.81 مجم من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) إلى 500 مل من الماء المقطر. قم بإعداد وسائط Dulbecco المعدلة (IMDM) غير المكتملة من Iscove عن طريق إضافة 75 مل من hiFBS ، و 5 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، و 0.5 مل من 10 مجم / مل من الأنسولين ، و 2.5 مل من 4 مجم / مل هولو ترانسفيرين ، و 3.5 ميكرولتر من β-ميركابتوإيثانول ، و 5 مل من إل-جلوتامين ، و 0.5 مل من سيبروفلوكساسين إلى 416.5 مل من وسائط IMDM.
  6. تحضير 10 مل من وسائط 2x IMDM ، حيث يكون تركيز السيتوكينات ضعف الكمية في وسائط IMDM 1x ، عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 50 نانوغرام / ميكرولتر mr-SCF ، 20 ميكرولتر من 25 نانوغرام / ميكرولتر mr-Flt3L ، 20 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر mr-IL-6 ، 20 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر mr-IL-3 ، 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل من الأنسولين ، و 50 ميكرولتر من 4 ملغ / مل هولو ترانسفيرين إلى 9.87 مل من وسائط IMDM غير المكتملة.
    ملاحظة: تأكد من تعقيم المخزن المؤقت للتدفق ، والمخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء ، ووسائط الصيانة ، ووسائط النقل ، ووسائط IMDM غير المكتملة قبل الاستخدام.

2. تحويل البلازميد

  1. قم بإذابة 20 ميكرولتر من الخلايا المختصة α-Select على الجليد. أضف 1 ميكرولتر (~ 2 نانوغرام) من MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 البلازميد22 لإذابة الخلايا المختصة واخلطها برفق عن طريق النقر على الأنبوب. احتضان رد الفعل على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  2. صدم الخليط حراريا عن طريق الحضانة لمدة 40 ثانية في كتلة تسخين 42 درجة مئوية. نقل الأنبوب على الفور على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  3. أضف 1 مل من وسائط LB (بدون الأمبيسلين) إلى الأنبوب ورجه عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
  4. قم بطرد الأنبوب في درجة حرارة الغرفة عند 500 × جم لمدة 4 دقائق وتخلص من 0.9 مل من المادة الطافية. أعد تعليق الراسب في 0.1 mL المتبقية من وسائط LB.
  5. انشر الخلايا المختصة المحولة على ألواح أجار AP LB الدافئة مسبقا (37 درجة مئوية). احتضان اللوحة رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  6. اختر مستعمرة واحدة وأنفق الخلايا المحولة في 10 مل من وسائط AP LB طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
  7. أضف 5 مل من الخلايا المختصة المحولة المستهلكة إلى 500 مل من وسائط AP LB في دورق واحتضان القارورة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
  8. استخرج البلازميد باستخدام مجموعة استخراج البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وأعد تعليقه في 0.5 مل من الماء عالي النقاء المعقم. تحديد كمية البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

3. نقل خلايا فينيكس إيكوتروبيك (pECO)

  1. ثقافة 2 × 106 خلايا / لوحة pECO في وسائط الصيانة في ألواح 10 سم في حاضنة CO2 رطبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. تأكد من الحفاظ على خلايا pECO في مرحلة النمو الأسي والانقسام بنشاط قبل المرور.
  2. عندما تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، اغسل الأطباق ب 5 مل من DPBS مرتين ، وأضف 1 مل من التربسين إلى الطبق ، واحتضانها في حاضنة CO2 رطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. احصد الخلايا ب 5 مل من وسائط الصيانة في أنبوب معقم سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و 400 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسائط الصيانة.
  3. امزج 10 ميكرولتر من معلق الخلية و 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق وقم بتحميل 10 ميكرولتر على مقياس الدم لعد الخلايا.
    إجمالي الخلايا / مل = (إجمالي الخلايا المحسوبة × عامل التخفيف × 104 خلايا / مل) / عدد المربعات التي تم عدها)
    بذرة 2 × 10 6 خلايا / طبق في أطباق6 سم باستخدام 5 مل من وسائط الصيانة لنقل وزراعة الخلايا في حاضنة CO2 رطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
  4. استبدل وسائط الصيانة ب 5 مل من وسائط النقل عندما تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 50٪ -60٪ بعد 18 ساعة من الثقافة.
  5. احتفظ بكاشف النقل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل النقل.
  6. أضف 5.5 ميكروغرام من MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 بلازميد22 إلى 0.5 مل من وسائط DMEM العادية في أنبوب معقم سعة 1.5 مل. امزجه برفق عن طريق النقر على الأنبوب واتركه لمدة 10 دقائق.
  7. أضف 14.6 ميكرولتر (3 أضعاف كمية البلازميد ؛ v / w) من كاشف النقل إلى الأنبوب واضغط برفق على الأنبوب كل 10 دقائق ثلاث مرات.
  8. أضف الخليط بشكل موحد بالتنقيط إلى جميع مناطق الأطباق مع خلايا pECO في وسائط النقل. حرك الأطباق برفق للأمام والخلف 10 مرات وجانبية 10 مرات. احتضان الأطباق في حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  9. قم بقياس كفاءة النقل عن طريق الفحص المجهري الفلوري وقياس التدفق الخلوي للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) كما هو موضح في22. يتم إدخال الخلايا أولا على FSC-A / FSC-H و FSC-A و SSC-A للحصول على مفردات. يتم بوابات GFP + على مخطط FL1 من خلال مقارنتها بالخلايا غير المنقولة.
  10. جمع وتصفية المواد الطافية من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر في أنبوب معقم 50 مل. استخدم المواد الطافية على الفور لنقلها أو قم بتجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    ملاحظة: يجب خلط خلايا pECO بشكل صحيح وبذرها في أطباق بشكل موحد. اسمح للخلايا بالانتشار عن طريق تحريك الأطباق للأمام والخلف 10 مرات وجانبية 10 مرات أثناء البذر. قد يختلف رقم الخلية المراد بذرها اعتمادا على الاختلافات في العد. للعثور على رقم خلية البذر الأمثل الذي يمكن أن يحقق التقاء 50٪ -60٪ بعد 18 ساعة من الثقافة ، فإن خلايا البذر ذات التخفيفات التسلسلية مفيدة.

4. نقل العدس الفيروسي

  1. القتل الرحيم CD45.1 إناث الفئران C57BL6 / J البالغة من العمر 8-10 أسابيع (اثنان إلى ثلاثة فئران مانحة لكل فأر مستلم) في غرفة CO2 .
  2. تعقيم الجسم كله من الفئران مع 70 ٪ من الإيثانول. ضع الفئران على وسادة جراحية معقمة على لوح الستايروفوم وقم بتثبيت الساقين من خلال وسادات مخلب الفأر.
  3. قطع الجلد فوق تجويف البطن عند خط الوسط وتوسيع المساحة تحت الجلد نحو الساقين الخلفيتين بمقص معقم حاد.
  4. قم بتمديد الشق من خط الوسط البطني وصولا إلى الكاحلين. قم بتوسيع المساحة تحت الجلد أسفل الأرجل الخلفية باستخدام شفرات المقص المعقم الحاد.
  5. قطع وتر العرقوب بمقص معقم حاد. امسك الوتر باستخدام ملقط مع الأسنان واقطع الطرف الآخر المتصل بعظم الفخذ لإزالة عضلة الساق.
  6. قطع وتر عضلات الفخذ تعلق على الركبة مع مقص معقم حاد. امسك الوتر باستخدام ملقط مع الأسنان واقطع رؤوس العضلات المتصلة بعظم الفخذ لإزالة عضلة الساق.
  7. قطع العضلات الأخرى المحيطة بعظم الفخذ في النهاية متصلة بالساق بمقص معقم حاد.
  8. قطع الكاحل بمقص معقم حاد النهاية ، وضمان بقاء الساق سليمة. امسك الطرف البعيد من عظم الفخذ باستخدام ملقط مع الأسنان وقطع مفصل الورك بمقص معقم حاد النهاية ، مع ضمان بقاء رأس الفخذ سليما.
  9. انقل القصبة وعظم الفخذ إلى مخزن مؤقت للتدفق في أنبوب معقم سعة 15 مل.
  10. افصل بين الساق وعظم الفخذ عن طريق كسر الركبة باليد. قم بإزالة الرضفة والغضاريف واللقمات الفخذية لكشف هضبة الظنبوب وعظم الفخذ البعيد باليد. قم بإزالة العضلات باستخدام شاش معقم ثم انقع العظام في محلول التدفق.
  11. قطع عنق الفخذ وغسل خلايا نخاع العظم مع عازلة التدفق من طرفي عظم الفخذ باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 23 غرام.
  12. قطع malleolus الظنبوب وغسل خلايا نخاع العظم مع عازلة التدفق من طرفي الظنبوب باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 23 غرام.
  13. قم بتفريق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام حقنة سعة 10 مل بإبرة 18 جرام. جهاز طرد مركزي تعليق خلية واحدة عند 4 درجات مئوية و 400 × جم لمدة 3 دقائق.
  14. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء لتحلل كرات الدم الحمراء لمدة 3 دقائق.
  15. أضف 5 مل من محلول التدفق لإيقاف التحلل والطرد المركزي تعليق الخلية عند 4 درجات مئوية و 400 × جم لمدة 3 دقائق.
  16. ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنبوب معقم سعة 50 مل. الحبيبات ب 5 مل من محلول التدفق ، واخلطها ، وقم بتمريرها عبر مصفاة الخلية لجمع الخلايا.
  17. اضبط تركيز الخلية مع المخزن المؤقت للتدفق إلى 1 × 108 / مل في أنابيب البولي بروبلين ذات القاع المستدير.
  18. حدد خلايا Lin باستخدام مجموعة عزل الخلايا المكونة للدم بالماوس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  19. احتفظ جانبا بثلاثة أنابيب من 1 × 104 خلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعنصر تحكم واحد غير ملوث واثنين من عناصر التحكم الفردية الملطخة بالأجسام المضادة ل CD117 (c-Kit) و PE-Cy7 المترافق المضاد للفأر Ly-6A / E (Sca-1). استخدم 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة (من مخزون 0.2 مجم / مل) لكل عنصر من عناصر التحكم الفردية الملطخة بالأجسام المضادة.
  20. قم بتلطيخ بقية الخلايا في أنبوب بكلا الجسمين المضادين (4 ميكرولتر من كل منهما من مخزون 0.2 مجم / مل) في 400 ميكرولتر. احتضان الأنابيب على الجليد في الظلام لمدة 0.5-1 ساعة.
  21. بعد التلوين ، اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من مخزن التدفق وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و 400 × جم لمدة 3 دقائق.
  22. أعد تعليق الخلايا للتحكم غير الملوث وأدوات التحكم الفردية الملطخة بالأجسام المضادة في 100 ميكرولتر من مخزن التدفق. أعد تعليق الخلايا الملطخة بالأجسام المضادة المزدوجة في 1 مل من المخزن المؤقت للتدفق للفرز.
  23. فرز الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) كمجموعة LSK باستخدام فارز الخلايا كما هو موضح في23،24.
  24. أثناء التلوين ، قم بتغطية طبق معقم 6 سم بالريترونيكتين على النحو التالي: قم بإعداد 100 ميكروغرام / مل من مخزون الريترونيكتين في برنامج تلفزيوني وأضف 0.9 مل من برنامج تلفزيوني و 0.1 مل من الريترونيكتين إلى طبق 6 سم. معطف الطبق في غطاء معقم في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. ثم ، قم بإزالة retronectin وسد الطبق مع 0.5 مل من 2 ٪ BSA المصفاة (في PBS) لمدة 30 دقيقة. اغسل الطبق ب 5 مل من برنامج تلفزيوني مرتين ويكون الطبق جاهزا للنقل.
  25. أجهزة الطرد المركزي HSCs المصنفة أو خلايا Lin- غير المصنفة عند 4 °C و 400 × g لمدة 3 دقائق وإعادة التعليق في 3 مل من 2x (من السيتوكينات) وسائط IMDM و 3 مل من الطافات الفيروسية (المتولدة من الخطوة 3.10) في طبق مغلف بالارتجحام. احتضان الطبقفي حاضنة CO 2 رطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 6 أو 24 ساعة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم فرز الخلايا الملينة أو فرزها اعتمادا على التصميم التجريبي.

5. الزرع التسلسلي (الشكل 1)

ملاحظة: كانت الفئران المتلقية الأولية ذكور الفئران C57BL6 / J البالغة من العمر 8-10 أسابيع (CD45.2). تم تزويدهم بالماء الذي يحتوي على مضادات حيوية لمنع التهابات الجهاز الهضمي الانتهازية ، من 3 أيام قبل الزرع إلى 7 أيام بعد الزرع. تم تشعيع الفئران المتلقية الأولية دون المميتة (4.75 غراي) قبل 3 ساعات من الزرع25. لم يتم تطبيق Isoflurane على الفئران مع الحقن داخل الصفاق.

  1. بعد النقل لمدة 6 أو 24 ساعة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة و 400 × جم لمدة 3 دقائق. استخدم التربسين لجمع الخلايا المتصلة بقاع الطبق إذا لزم الأمر. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا. حدد حجم PBS اعتمادا على عدد المتلقين (أي 0.1 مل / فأر و 0.5 مل / فأر للمستلمين الذين لديهم حقن خلف الحجاج وداخل الصفاق ، على التوالي).
  2. ضع الفئران المتلقية شبه المميتة في غرفة إيزوفلوران (يتم ضبط معدل تدفق الأكسجين على 1.0 لتر / دقيقة ويتم تعيين مبخر الأيزوفلوران على 5٪). ضع مرهما رطبا على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير. الفئران جاهزة لمزيد من الإجراءات عندما تنخفض نبضات القلب إلى 60 نبضة في الدقيقة.
  3. حقن الخلايا في الفئران المتلقية الأولية بأثر رجعي (0.1 مل / فأر)7 أو داخل الصفاق (0.5 مل / فأر)26 بإبرة 27 G1 / 2. راقب الفئران باستمرار حتى تكتسب وعيا كافيا للحفاظ على الاستلقاء القصي. راقب الفئران يوميا من أجل رفاهيتها بعد الزرع.
  4. بعد 1 شهر ، جمع الدم أسبوعيا عن طريق نزيف الحجاج الخلفي لمراقبة زيادة عدد الكريات البيضاء عن طريق تقييم تعداد الدم الكامل (CBC) على hemavet كما هو موضح أدناه.
    1. ضع الماوس بشكل جانبي بعد التخدير باستخدام الأيزوفلوران (يتم ضبط معدل تدفق الأكسجين على 1.0 لتر / دقيقة ويتم تعيين مبخر الأيزوفلورانس على 5٪). الفئران جاهزة لمزيد من الإجراءات عندما تنخفض نبضات القلب إلى 60 نبضة في الدقيقة.
    2. قم بتحريك العين بالإبهام والسبابة. اختراق الضفيرة الجيبية الوريدية مع أنبوب شعري هيماكريت نجمي من خلال canthus الداخلية.
    3. اجمع 20-25 ميكرولتر من الدم في أنبوب جمع الدم EDTA وأغلق الجفون لوقف النزيف. ضع قطرة واحدة من محلول جنتاميسين سلفات للعيون على العين.
  5. عند نقطة النهاية ، عندما تصل خلايا الدم البيضاء (WBCs) إلى 4 × 10 4 خلايا / ميكرولتر ، قم بالقتل الرحيم للفأر في غرفة CO2 وعزل خلايا نخاع العظم عن طريق شطف عظم الفخذ والساق بمحلول التدفق ، متبوعا بتحلل كرات الدم الحمراء كما هو مذكور في الخطوة4.
  6. عند نقطة النهاية ، احصد الخلايا الطحالية كما هو مذكور أدناه.
    1. القتل الرحيم للماوس في غرفة CO2 . ضع الفئران على وسادة جراحية معقمة على لوح الستايروفوم وقم بتثبيت الساقين من خلال وسادات مخلب الفأر. تعقيم الجسم كله من الفئران مع 70 ٪ من الإيثانول.
    2. قطع الجلد والعضلات في خط الوسط لفضح تجويف البطن بمقص معقم حاد. عزل الطحال بمقص معقم حاد النهاية ووضعه في مخزن مؤقت للتدفق في أنبوب معقم سعة 15 مل.
    3. قم بربط الطحال من خلال مصفاة معقمة 70 ميكرومتر في طبق 6 سم مع 3 مل من محلول التدفق. نقل الخلايا من الطبق إلى أنبوب معقم 15 مل وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية واحدة عند 4 درجات مئوية و 400 × غرام لمدة 3 دقائق.
    4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء لتحلل كرات الدم الحمراء لمدة 3 دقائق. أضف 5 مل من محلول التدفق لإيقاف التحلل والطرد المركزي تعليق الخلية عند 4 درجات مئوية و 400 × جم لمدة 3 دقائق.
    5. ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنبوب معقم سعة 50 مل. الحبيبات ب 5 مل من المخزن المؤقت للتدفق ، واخلطها ، ومررها عبر مصفاة الخلية لجمع الخلايا.
  7. حدد خلايا AML الأولية (1 درجة) عن طريق تلطيخ الخلايا الطحالية وخلايا نخاع العظم باستخدام الجسم المضاد CD45.1 المضاد للفأر المترافق FITC والكشف عن مقياس التدفق الخلوي. يتم إدخال الخلايا أولا على FSC-A / FSC-H و FSC-A و SSC-A للحصول على مفردات. يتم بوابات CD45.1 + على مخطط FL1 من خلال مقارنتها بالخلايا غير الملوثة.
  8. بالنسبة للزرع الثانوي (2 درجة) ، أعد تعليق خلايا الطحال CD45.1 AML من متلقي 1 درجة r.o. في PBS (0.1 مل / فأر) وحقنها بأثر رجعي في ذكور الفئران C57BL6 / J CD45.2. بالتوازي مع ذلك ، أعد تعليق خلايا الطحال AML من 1 درجة i.p. المتلقين في PBS (0.5 مل / فأر) وحقنها داخل الصفاق في بروتين مضان أحمر عمره 8-12 أسبوعا (RFP) يعبر عن Ai14TdTomato ذكور الفئران27.
  9. بالنسبة للزرع الثلاثي (3 درجات) ، أعد تعليق خلايا AML المعزولة من نخاع العظم أو التجويف البريتوني لمتلقي 2 درجة i.p. وحقنها داخل الصفاق في الفئران Ai14TdTomato (RFP +) أو CD45.2 ، على التوالي. إعادة تعليق خلايا AML المعزولة من التجويف البريتوني لمتلقي 2 درجة r.o. وزرعها عن طريق حقن r.o. في فئران Ai14TdTomato (RFP +).
    ملاحظة: بالنسبة لزراعة 2 ° ، حددنا تطور المرض في متلقي 2 ° من خلال مراقبة CBC في الدم المحيطي. لمزيد من التأكيد على إنشاء AML ، قمنا بجمع الدم المحيطي الكامل عن طريق ثقب القلب وكذلك نخاع العظام والطحال والكبد. علاوة على ذلك ، قمنا بإجراء غسل i.p. لجمع خلايا i.p. تم الحصول على معلقات خلية واحدة من نخاع العظام والطحال وغسل i.p. كما هو موضح أعلاه. تم تحليل الخلايا من هذه المواقع على مقياس التدفق الخلوي بعد تحلل كرات الدم الحمراء. تم التعرف على خلايا AML كخلايا RFP سلبية (RFP-). بالنسبة لزرع 3 درجات ، قمنا بأخذ عينات من الدم ونخاع العظام والطحال والكبد وخلايا i.p. في نقطة النهاية. تم تحديد خلايا RFP أو CD45.1 + على أنها خلايا AML وفحصها بواسطة قياس التدفق الخلوي. لم يتم إعطاء أي ماء تشعيع أو مضاد حيوي للفئران المتلقية 2 درجة و 3 درجات.

figure-protocol-1
الشكل 1: رسم تخطيطي للتحويل الفيروسي MLL-AF9 في HSCs نخاع العظم والزرع التسلسلي (1 درجة و 2 درجة و 3 درجات). يعتبر فرز السكان الموجبة المزدوجة Sca-1 و c-Kit باستخدام فارز الخلايا الموضح في مربع الظل المنقط اختياريا ، إذا سمحت الموارد بذلك. تم إنشاء الشكل باستخدام BioRender (https://biorender.com/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. غسل داخل الصفاق

  1. حقن 5 مل من وسائط IMDM غير المكتملة في التجويف البريتوني مرتين لجمع الخلايا في أنبوب معقم سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة و 400 × غرام لمدة 3 دقائق. زرع خلايا AML (4 × 105 خلايا / فأر) من التجويف البريتوني لمتلقي 2 درجة عن طريق حقن i.p. في الفئران المتلقية 3 ° CD45.2 (ن = 3).

7. التحليل النسيجي 28

  1. عزل الطحال والكبد وعظم الفخذ عن الفئران عند القتل الرحيم. قم بإصلاحها في 5 مل من 10٪ (v / v) من الفورمالين المخزن مؤقتا. أخذ عينات من الطحال والكبد من نظرائهم الأصحاء للمقارنة.
  2. قم بتضمين الأنسجة الثابتة في البارافين وقطعها إلى أقسام. تلطيخ المقاطع بأصباغ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E).
  3. احصل على الصور تحت المجهر عند تكبير 20x مثبتا مع برنامج متوافق للتحليل النسيجي.

8. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي (qPCR)

  1. تحضير الحمض النووي الريبي في كاشف الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. استخدم 0.5-1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لتجميع cDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. استخدم cDNA لإجراء qPCR باستخدام مجموعة qPCR وتشغيل العينات في نظام qPCR. استخدم مجسات TaqMan التالية التي تم التحقق من صحتها مسبقا: KMT2A (MLL; المرجع التسلسل: NM_001197104(2) ، IDT) 29 و 18S الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (Hs99999901_s1).
  4. قم بتحميل مضخمات KMT2A و 18S على هلام أغاروز 2٪ لتصور التعبير. احصل على صور في جهاز تصوير مثبت مع البرنامج المتوافق.

9. معالجة البيانات

  1. تحليل النتائج باستخدام برنامج التحليل الإحصائي وتقديم النتائج كمتوسط ± التسويق عبر محرك البحث. قم بإنشاء أرقام باستخدام أداة الرسام التجاري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مقارنة كفاءة زرع خلايا AML الفئران باستخدام طرق زرع r.o. و i.p.
في السابق ، تم الإبلاغ عن إنشاء 1 ° AML في الفئران المتلقية المزروعة بأثر رجعي مع خلايا LSK المنقولة MLL-AF9 ، وتم إثبات قابلية زرع خلايا AML 1 ° من خلال الزرع التسلسلي30. الدراسة الحالية هي الأولى التي تقيم إمكانية استخدام خلايا لين نخاع العظم لإجراء عملية الزرع. إن وجود زيادة عدد الكريات البيضاء الشاذة (الشكل 2 أ) وزيادة تسلل خلايا اللوكيميا (CD45.1+) في نخاع العظم والطحال (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تقدم هذه الدراسات الموصوفة أعلاه أدلة داعمة على أن زرع الخلايا اللينية يمكن مقارنته بخلايا LSK في توليد 1 درجة من AML الفأر. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر البيانات الحالية أيضا أن حقن i.p. هو وسيلة فعالة ومريحة لإنشاء AML الفئران مقارنة بالحقن في الوريد (أو r.o).

بالإضافة إلى خلايا LSK ، تم الإبلاغ عن مجموعات سكانية أخرى مثل السلف المحبب وحيد الخلايا (GMP) ، والسلف اللمفاوي المشترك (CLP) ، والسلف النخاعي المشترك (CMP) كخلايا مانحة في توليد 1 ° MLL-AF9 الناجم عن AML مع فترات حضانة مختلفة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي التابع لمعهد هاك والمرفق الأساسي لعلم الأنسجة المرضي لمختبر تشخيص الحيوانات ، قسم العلوم البيطرية والطبية الحيوية ، جامعة ولاية بنسلفانيا ، على تقديم الدعم الفني في الوقت المناسب. تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الأمريكي لأبحاث السرطان (KSP) ، وكلية ولاية بنسلفانيا للعلوم الزراعية ، ومعهد ولاية بنسلفانيا للسرطان ، ومشروع USDA-NIFA 4771 ، ورقم الانضمام 00000005 إلى K.S.P. و R.F.P.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أ- اختيار الخلايا المختصة BiolineBIO-85027
كلوريد الأمونيوم (NH4< / sub>Cl)Sigma AldrichCat # A-9434
AmpicillinSigma AldrichCat # A0797
ألبومين مصل الأمونيوم البقري (BSA) ، الكسر V & [مدش] ؛ منخفضة السموم الداخلية الصفالجوزاء المنتجات الحيويةCat # 700-102P
Ciprofloxacin HClGoldBio.comCat # C-861-100
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، لا جلوتامينGibcoCat # 11960-044
Dulbecco ' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) CorningCat # 21-031-CV
EDTA ، ملح ثنائي الصوديوم (EDTA-2Na) ، ثنائي الهيدرات ، البيولوجيا الجزيئية الصفCalbiochemCat # 324503
مصل الأبقار الجنيني - Premium SelectAtlanta BiologicalsCat # S11550
Holo-transferrin ، البقرSigma AldrichCat # T1283
محلول الأنسولين البشريSigmaCat # I-9278
Iscove's Dulbecco's Medium المعدل (IMDM)GibcoCat # 12440-053
L-glutamine 200 mM (100 مرة;) محلولHyClone ، GelifesciencesCat # SH30034.01
رطل مرق ، LennoxNEOGENCat #: 7290A
LB مرق مع أجار (ميلر)Sigma AldrichCat # L-3147
Mouse مضاد للفأر CD45.1 (FITC)Miltenyi BiotecCat # 130-124-211
ماوس Interleukin-3 (IL-3)Gemini bio-productsCat # 300-324P
Mouse Interleukin-6 (IL-6)Gemini bio-productsCat # 300-327P
عامل الخلايا الجذعية للفأر (SCF)Gemini Bio-ProductsCat # 300-348P
Penicillin-Streptomycin Solution ، 100xCorningخلايا Cat # 30-002-CI
Phenix-Eco (pECO)ATCCCRL-3214
بيكربونات البوتاسيوم (KHCO3< / sub>) ، حبيباتJT. بيكركات # 2940-01
الفئران المضادة للفأر CD117 (c-kit) (APC) BioLegend  ؛Cat # 105812
الفئران المضادة للفأر Ly-6A / E (SCA-1) (PE-Cy7) BDPharmingenCat # 558162
المؤتلف الفئران FLT3-LigandPepro Tech، INC.Cat # 250-31L
RetroNectin مؤتلف فيبرونيكتين بشري جزءTaKaRaCat # T100A
Trans< / em>IT-293 كاشفMirusBioCat # MIR 2705
TRI ReagentSigma AldrichCat # T9424
محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪GibcoCat # 15250061
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، أحمرالفينولGibcoCat # 25200-056
& -Mercaptoethanol (BME)Sigma AldrichCat # M3148
< قوي > فحوصات تجارية   ; < / قوي>
EasySep ماوس المكونة للدم طقم عزل الخلايا السلفية تقنيات الخلايا الجذعيةCat # 19856A
النسخ العكسي عالية السعة cDNA   ;ثيرمو فيشر Cat # 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMixQuanta BioCat # 95051-500
Plasmid Maxi Kit (25)QiagenCat #: 12163
Animals < / strong>
Ai14TdTomato< / sup> < / em> الفئرانجاكسون مختبرسلالة # 007914
CD45.1 C57BL6 / J الفئران& نب سب.مختبر جاكسون# 002014
CD45.2 C57BL6 / J الفئران جاكسون مختبرسلالة # 000664
الأدوات والبرمجيات
أدوبي المصور الإصدار 25.2.3
BD accuri C6 مقياس التدفقBD Biosciences
FlowJo 10.8.0BD
برنامج GeneSys الإصدار 1.5.7.0
GraphPad Prism الإصدار 6  GraphPad
Hemavet 950FS درو ساينتفيك
7300 نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقيالأنظمة الحيوية
التطبيقية Syngene G: BOX Chemi XR5 التصوير الفلوريالكيميائي G: Box Chemi
مجموعة سلالة الخلوي

المراجع

  1. Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
  3. Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
  4. Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152(2019).
  5. Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
  6. Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
  7. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  8. Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
  9. Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
  10. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
  11. Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
  12. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
  13. Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
  14. Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
  15. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  16. Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
  17. Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048(2012).
  18. Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
  19. Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
  20. Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360(2012).
  21. Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27(2016).
  22. Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361(2016).
  23. Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
  24. Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
  25. Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572(2020).
  26. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  27. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  28. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  29. Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
  30. Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328(2022).
  31. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  32. Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
  33. Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

MLL AF9
زرع داخل الصفاق لتوليد سرطان الدم النخاعي الحاد في الفئران
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.