مقالة منهجية

تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات الجزر المنتجة للأنسولين

DOI:

10.3791/64840

⸱

يونيو 23, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا جزرية حلا بديلا لعلاج مرض السكري التقليدي ونمذجة الأمراض. وصفنا بروتوكولا مفصلا لزراعة الخلايا الجذعية يجمع بين مجموعة تمايز تجارية وطريقة تم التحقق من صحتها مسبقا للمساعدة في إنتاج الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية التي تفرز الأنسولين في طبق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى خلايا بيتا التي تفرز الأنسولين مادة للتحقيق في وظيفة خلايا بيتا وعلاج مرض السكري. ومع ذلك ، لا تزال هناك تحديات في الحصول على خلايا بيتا المشتقة من الخلايا الجذعية التي تحاكي بشكل كاف خلايا بيتا البشرية الأصلية. بناء على الدراسات السابقة ، تم إنشاء خلايا جزرية مشتقة من hPSC لإنشاء بروتوكول مع تحسين نتائج التمايز والاتساق. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا مجموعة سلفية للبنكرياس خلال المراحل 1-4 ، متبوعا ببروتوكول معدل من ورقة نشرت سابقا في عام 2014 (تسمى "بروتوكول R" فيما بعد) خلال المراحل 5-7. يتم تضمين الإجراءات التفصيلية لاستخدام مجموعة السلف البنكرياسي وألواح microwell بقطر 400 ميكرومتر لتوليد مجموعات السلف البنكرياسي ، وبروتوكول R لتمايز الغدد الصماء في شكل تعليق ثابت 96 بئرا ، والتوصيف في المختبر والتقييم الوظيفي للجزر المشتقة من hPSC. يستغرق البروتوكول الكامل 1 أسبوع لتوسيع hPSC الأولي متبوعا ب ~ 5 أسابيع للحصول على جزر hPSC المنتجة للأنسولين. يمكن للأفراد الذين لديهم تقنيات زراعة الخلايا الجذعية الأساسية والتدريب على المقايسات البيولوجية إعادة إنتاج هذا البروتوكول.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفرز خلايا بيتا البنكرياسية الإنسولين استجابة لارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم. عادة ما يتم علاج المرضى الذين يفتقرون إلى إنتاج الأنسولين الكافي بسبب تدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا في مرض السكري من النوع الأول (T1D) 1 ، أو بسبب خلل خلايا بيتا في مرض السكري من النوع 2 (T2D) 2 ، بإعطاء الأنسولين الخارجي. على الرغم من هذا العلاج المنقذ للحياة ، فإنه لا يمكن أن يتطابق بدقة مع التحكم الرائع في نسبة الجلوكوز في الدم كما يتحقق من خلال إفراز الأنسولين الديناميكي من خلايا بيتا حسنة النية. على هذا النحو ، غالبا ما يعاني المرضى من عواقب نوبات نقص السكر في الدم التي تهدد الحياة والمضاعفات الأخرى الناتجة عن رحلات ارتفاع السكر في ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد هذا البروتوكول على العمل مع خطوط hPSC ، بما في ذلك H1 و HUES4 PDXeG و Mel1 INSGFP / W ، في ظروف خالية من وحدة التغذية. يتم تفصيل إجراء خطوة بخطوة في هذا القسم ، مع بيانات داعمة من تمايز Mel1 INSGFP / W في قسم النتائج التمثيلية. نوصي بالحاجة إلى مزيد من التحسين عند العمل مع خطوط hPSC الأخرى غير المذكورة هنا. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع الكواشف والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد وسائط التمايز والحلول

ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على جميع الحلول التي يتعين إعدادها والجدول 2 للاطلاع على وس....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد طورنا استراتيجية هجينة لتمييز الخلايا الجذعية إلى جزر hPSC التي تفرز الأنسولين في سبع خطوات ، والتي تستخدم مجموعة سلفية للبنكرياس للمراحل الأربع الأولى في الثقافة المستوية ، متبوعة ببروتوكول معدل مبني على الطريقة6 المبلغ عنها سابقا في ثقافة تعليق ثابتة للمراحل الثلاث الأخيرة (الشكل 1). باستخدام هذا البروتوكول ، يعد ضمان وجود ثقافة قريبة من الالتقاء (90٪ -100٪) عند 24 ساعة بعد بذر الخلية (المرحلة 0) أمرا بالغ الأهمية لبدء تمايز فعال لمعظم خطوط hPSC (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الورقة بروتوكولا هجينا من سبع مراحل يسمح بتوليد جزر hPSC قادرة على إفراز الأنسولين عند تحدي الجلوكوز في غضون 40 يوما من الثقافة في المختبر. من بين هذه الخطوات المتعددة ، يعتقد أن الحث الفعال للأديم الباطن النهائي يضع نقطة انطلاق مهمة لنتائج التمايز النهائية18،27،28. في بروتوكول الشركة المصنعة ، يوصى بكثافة البذر عند 2.6 × 105 / سم2 لبدء التمايز ، وتتعرض الخلايا لوسائط المرحلة 1 لمدة يومين. .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان تيموثي جيه كيفر موظفا في ViaCyte أثناء إعداد هذه المخطوطة. يعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدر بامتنان الدعم المقدم من STEMCELL Technologies و Michael Smith Health Research BC و Stem Cell Network و JDRF والمعاهد الكندية للبحوث الصحية. حصل جيا تشاو وشينغهوي ليانغ على جائزة مايكل سميث للبحوث الصحية في كولومبيا البريطانية للمتدربين. ميتشل ج. س. برام حاصل على زمالة Mitacs Accelerate. حصلت Diepiriye G. Iworima على منحة ألكسندر جراهام بيل الكندية للدراسات العليا وجائزة CFUW 1989 Ecole Polytechnique التذكارية. نشكر بصدق الدكتور إدوارد ج. ستانلي من MCRI وجامعة موناش لمشاركة خط Mel1 INS GFP / W ومعهد ألبرتا للسكري Islet Core لعزل وتوزيع الجزر البشرية. كما نعترف بالدعم المقدم من مرافق التصوير وقياس التدفق الخلوي التابعة لمعهد علوم الحياة في جامعة كولو....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3،3 '، 5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397هرمون الغدة الدرقية
4٪ محلول PFAسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-281692يجب التعامل معها في غطاء الدخان
96-Well ، مرفق منخفض للغاية ، قاع مسطحCorning Costar (VWR)CLS3474قاع مسطح ؛ لثقافة التعليق الثابت في المراحل الثلاث الأخيرة
AccutaseSTEMCELL Technologies07920كاشف التفكك لخلايا المرحلة 4
Aggrewell400 لوحاتSTEMCELL Technologies34415400 & micro ؛ لوحات ميكروويل بقطر متر
لوحات Aggrewell800 STEMCELLTechnologies34815800 & micro ؛ أطباق ميكروويل بقطر م
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Human FOXA2 (الماعز IgG)R & D SystemsIC2400G1: 100 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 1
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR & D SystemsIC108G1: 100 في قياس التدفق
Alexa Fluor 488 Mouse Anti-Human SST (الماوس IgG2B)BD Sciences5660321: 250 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 7
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B التحكم في النمط النظيريR & D SystemsIC0041G1: 500 في قياس التدفق الخلوي
Alexa Fluor 647 الفأر المضاد للإنسان C-الببتيد (الماوس IgG1 & kappa ;)BD Pharmingen5658311: 2,000 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 7
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (الفأر IgG1 & kappa;)BD Sciences5656891: 2,000 في قياس التدفق
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-Human NKX6.1 (الماوس IgG1 & kappa ؛)Sciences5633381:33 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 4
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (الفأر IgG1 & kappa ؛)BD 5625941:50 في قياس التدفق الخلوي. تستخدم لفحص خلايا المرحلة 1
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1 & kappa; التحكم في النمط المتماثلBDSciences 5577141:50 في قياس التدفق الخلوي
ALK5i IIكايمان للكيماويات14794TGF-beta مثبط الإشارات
المضاد للالتصاق محلول الشطف   ؛STEMCELL Technologies7010فحص محلول شطف Microwell
CellvisD35-10-1-Nلأغراض GSIS الثابتة والتصوير متحد البؤر
ألبومين مصل البقر (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100لإجراء التلوين المناعي
الجسم المضاد CK19DAKOM08881:50 في التألق المناعي
الكامل D-glucoseSigmaG8769مكمل متوسط
DAPISigmaD9542لمضاد البقع النووية
DMEM / F12 ، محلولتخفيف مصفوفة11330032Thermo Fisher
مضادا للماعز Alexa Fluor 555Life TechnologiesA214321: 500 في التألق المناعي كامل
الحمار المضاد للماعز Alexa Fluor 647Life تقنياتA214471: 500 في كامل الجبل المناعي التألق
الحمار المضاد للفأر Alexa Fluor 555تقنيات الحياةA315701: 500 في التألق المناعي كامل
حمار مضاد للفأر Alexa Fluor 647تقنيات الحياةA315711: 500 في التألق المناعي كامل
حمار مضاد للأرانب Alexa Fluor 555تقنيات الحياةA315721: 500 في التألق المناعي كامل
الحمار المضاد للأرانب Alexa Fluor 647Life technologiesA315731: 500 في التألق المناعي
الحمار المضاد للأغنام Alexa Fluor 647Life technologiesA214481: 500 في التألق المناعي
DPBSSigmaD8537بدون Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup>
ELISA ، الأنسولين ، Alpco البشري80-INSHU-E01.1لقياس الأنسولين البشري
المكملاتالخالية من الأحماض الدهنية BSAProliant68700
Sciences 554714Fix / Perm و 10x Perm / Wash متضمنة
كاشف تفكك الخلايا اللطيفSTEMCELL Technologies7174لمرور التكتلات hPSCs أثناء ثقافة الصيانة
الجسم المضاد للجلوكاجونSigmaG26541: 400 في الجسم المضاد للتألق المناعي
GLUT1كامل الجبل Thermo Fisher ScientificPA1-377821: 200 في التألق المناعي
الجبل GlutaMAX-I (100x)مكمل Gibco35050061L-glutamine
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4لتنظيف الأنسجة وتركيبها
GSi XXSigma Milliporeمثبط 565789Notch
HeparinSigmaH3149مكمل غذائي متوسط
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - الإيثانول أمين ؛ مكمل غذائي
متوسط LDN193189   ؛STEMCELL Technologies72147المضاد
MAFA المضادAbcamab264051: 200 في التألق المناعي
الجبل Matrigel ، المؤهل من hESCThermo Fisher Scientific08-774-552مصفوفة خارج الخلية لطلاء سطح الوعاء
MCDB131 تقنيات الحياة المتوسطة10372019مجموعة كاملة من القاعدة المتوسطة
mTeSR1STEMCELL تقنيات85850وسيط الخلايا الجذعية ومكملات 5x وشملت
N-Cys (N-acetyl cysteine)SigmaA9165Antioxidant
NaHCO3< / sub>SigmaS6297مكمل غذائي
متوسط NEUROD1 الأجسام المضادةR & D SystemsAF27461:20 في الجسم المضاد للتألق المناعي
NKX6.1كامل الجبل DSHBF55A12-c1:50 في
الأجسام المضادة للجسم المضاد للبنكرياس البولي ببتيد& D SystemsAF62971: 200 في كامل جبل التألق المناعي
PBSSigmaD8662مع Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup>
PDX1 الجسم المضادAbcamab472671: 200 في كامل جبل التألق
المناعي PE ماوس مضاد للإنسان GCG (الماوس IgG1 & kappa;)علوم BD5658601: 2,000 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 7
PE Mouse المضادة للإنسان NKX6.1 (الفأر IgG1k) BDSciences5630231: 250 في قياس التدفق الخلوي
PE Mouse المضاد للإنسان PDX1 (الفأر IgG1k) BDSciences5621611: 200 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 4
Mouse IgG1 & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثلBD Sciences5546801: 2,000 في قياس التدفق الخلوي
PE الفأر - الكروموجرانين البشري A (CHGA ، الفأر IgG1k) BDSciences5645631: 200 في قياس التدفق الخلوي
R428   ؛كايمان كيماويات21523AXL مثبط التيروزين كيناز
حمض الريتينويد ،الحساسة للضوء
10xSigma20-188لاستخراج الهرمونات
SANT-1SigmaS4572SHH
مثبط SLC18A1 الجسم المضادSigmaHPA0637971: 200 في التألق المناعي الكامل
الأجسام المضادة للسوماتوستاتينسيجماHPA0194721:100 في التألق المناعي
الجبل STEMdiff طقم سلف البنكرياسSTEMCELL Technologies05120تضمنت الوسائط القاعدية والمكملات
الجسم المضاد SynaptophysinNovusNB120-166591:25 في التألق المناعي بالكامل
Triton X-100SigmaX100للنفاذية
Trolox تقنيات Sigma Millipore648471فيتامين E التناظرية
TrypLE Enzyme ExpressLife12604-021كاشف إنزيم تفكك الخلية لخلية واحدة عابرة hPSCs
Trypsin1/2/3 الجسم المضادR & D SystemsAF35861:25 في التألق المناعي كامل
Y-27632STEMCELL Technologies72304مثبط الصخور
كبريتات الزنكSigmaZ0251مكمل متوسط
الخلوي الخلوي BD علوم غرفة العلمي HEPES حمارا كامل كامل مجموعة حلول تثبيت ونفاذية الغذائية BD كامل BMP كامل R PE عازلة تحلل RIPA ، كامل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDX1 NKX6 1

مقالات ذات صلة