يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات الجزر المنتجة للأنسولين

5.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64840

⸱

يونيو 23, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوفر تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا جزرية حلا بديلا لعلاج مرض السكري التقليدي ونمذجة الأمراض. وصفنا بروتوكولا مفصلا لزراعة الخلايا الجذعية يجمع بين مجموعة تمايز تجارية وطريقة تم التحقق من صحتها مسبقا للمساعدة في إنتاج الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية التي تفرز الأنسولين في طبق.

الملخص

يوفر تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى خلايا بيتا التي تفرز الأنسولين مادة للتحقيق في وظيفة خلايا بيتا وعلاج مرض السكري. ومع ذلك ، لا تزال هناك تحديات في الحصول على خلايا بيتا المشتقة من الخلايا الجذعية التي تحاكي بشكل كاف خلايا بيتا البشرية الأصلية. بناء على الدراسات السابقة ، تم إنشاء خلايا جزرية مشتقة من hPSC لإنشاء بروتوكول مع تحسين نتائج التمايز والاتساق. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا مجموعة سلفية للبنكرياس خلال المراحل 1-4 ، متبوعا ببروتوكول معدل من ورقة نشرت سابقا في عام 2014 (تسمى "بروتوكول R" فيما بعد) خلال المراحل 5-7. يتم تضمين الإجراءات التفصيلية لاستخدام مجموعة السلف البنكرياسي وألواح microwell بقطر 400 ميكرومتر لتوليد مجموعات السلف البنكرياسي ، وبروتوكول R لتمايز الغدد الصماء في شكل تعليق ثابت 96 بئرا ، والتوصيف في المختبر والتقييم الوظيفي للجزر المشتقة من hPSC. يستغرق البروتوكول الكامل 1 أسبوع لتوسيع hPSC الأولي متبوعا ب ~ 5 أسابيع للحصول على جزر hPSC المنتجة للأنسولين. يمكن للأفراد الذين لديهم تقنيات زراعة الخلايا الجذعية الأساسية والتدريب على المقايسات البيولوجية إعادة إنتاج هذا البروتوكول.

المقدمة

تفرز خلايا بيتا البنكرياسية الإنسولين استجابة لارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم. عادة ما يتم علاج المرضى الذين يفتقرون إلى إنتاج الأنسولين الكافي بسبب تدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا في مرض السكري من النوع الأول (T1D) 1 ، أو بسبب خلل خلايا بيتا في مرض السكري من النوع 2 (T2D) 2 ، بإعطاء الأنسولين الخارجي. على الرغم من هذا العلاج المنقذ للحياة ، فإنه لا يمكن أن يتطابق بدقة مع التحكم الرائع في نسبة الجلوكوز في الدم كما يتحقق من خلال إفراز الأنسولين الديناميكي من خلايا بيتا حسنة النية. على هذا النحو ، غالبا ما يعاني المرضى من عواقب نوبات نقص السكر في الدم التي تهدد الحياة والمضاعفات الأخرى الناتجة عن رحلات ارتفاع السكر في الدم المزمنة. ينجح زرع الجزر البشرية في استعادة السيطرة الصارمة على نسبة السكر في الدم لدى مرضى T1D ولكنه محدود بسبب توفر المتبرعين بالجزر والصعوبات في تنقية الجزر الصحية للزرع 3,4. يمكن حل هذا التحدي ، من حيث المبدأ ، باستخدام hPSCs كمواد انطلاق بديلة.

غالبا ما تهدف الاستراتيجيات الحالية لتوليد الجزر التي تفرز الأنسولين من hPSCs في المختبر إلى محاكاة عملية تطور البنكرياس الجنيني في الجسم الحي 5,6. وهذا يتطلب معرفة مسارات الإشارات المسؤولة والإضافة الموقوتة للعوامل القابلة للذوبان المقابلة لمحاكاة المراحل الحرجة من البنكرياس الجنيني النامي. يبدأ برنامج البنكرياس بالالتزام في الأديم الباطن النهائي ، والذي يتميز بعوامل النسخ صندوق شوكة A2 (FOXA2) ومنطقة تحديد الجنس Y-box 17 (SOX17) 7. يتضمن التمايز المتتالي للأديم الباطن النهائي تكوين أنبوب أمعاء بدائي ، ونمط في الأمعاء الأمامية الخلفية التي تعبر عن الصندوق المثلي للبنكرياس والاثني عشر 1 (PDX1) 7،8،9 ، والتوسع الظهاري في أسلاف البنكرياس التي تعبر عن PDX1 و NK6 homeobox 1 (NKX6.1) 10,11.

يرافق المزيد من الالتزام بخلايا جزيرة الغدد الصماء التعبير العابر للمنظم الرئيسي المؤيد للغدد الصماء neurogenin-3 (NGN3) 12 والحث المستقر لعوامل النسخ الرئيسية التمايز العصبي 1 (NEUROD1) و NK2 homeobox 2 (NKX2.2) 13. تتم برمجة الخلايا الرئيسية المعبرة عن الهرمونات ، مثل خلايا بيتا المنتجة للأنسولين ، وخلايا ألفا المنتجة للجلوكاجون ، وخلايا دلتا المنتجة للسوماتوستاتين ، وخلايا PPY المنتجة للببتيد البنكرياس. مع هذه المعرفة ، بالإضافة إلى الاكتشافات من دراسات فحص الأدوية المكثفة وعالية الإنتاجية ، مكنت التطورات الحديثة من توليد جزر hPSC بخلايا تشبه خلايا بيتا قادرة على إفراز الأنسولين14،15،16،17،18،19.

تم الإبلاغ عن بروتوكولات تدريجية لتوليد خلايا بيتا المستجيبة للجلوكوز6،14،18،19. بناء على هذه الدراسات ، يتضمن البروتوكول الحالي استخدام مجموعة سلفية للبنكرياس لتوليد خلايا سلف البنكرياس PDX1 + / NKX6.1 + في ثقافة مستوية ، متبوعة بتجميع صفائح microwell في مجموعات موحدة الحجم والمزيد من التمايز نحو جزر hPSC التي تفرز الأنسولين مع بروتوكول R في ثقافة تعليق 3D ثابتة. يتم إجراء تحليلات مراقبة الجودة ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي ، والتلطيخ المناعي ، والتقييم الوظيفي ، من أجل التوصيف الدقيق للخلايا المميزة. تقدم هذه الورقة وصفا تفصيليا لكل خطوة من خطوات التمايز الموجه وتحدد مناهج التوصيف في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يعتمد هذا البروتوكول على العمل مع خطوط hPSC ، بما في ذلك H1 و HUES4 PDXeG و Mel1 INSGFP / W ، في ظروف خالية من وحدة التغذية. يتم تفصيل إجراء خطوة بخطوة في هذا القسم ، مع بيانات داعمة من تمايز Mel1 INSGFP / W في قسم النتائج التمثيلية. نوصي بالحاجة إلى مزيد من التحسين عند العمل مع خطوط hPSC الأخرى غير المذكورة هنا. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع الكواشف والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد وسائط التمايز والحلول

ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على جميع الحلول التي يتعين إعدادها والجدول 2 للاطلاع على وسائط التمايز.

  1. تحضير جميع الوسائط والكواشف لزراعة الخلايا في خزانة معقمة للسلامة البيولوجية. قم بتسخين المحاليل المتعلقة بزراعة الخلايا والوسائط القاعدية لفترة وجيزة إلى 37 درجة مئوية في الحمام قبل الاستخدام.
    ملاحظة: كما هو موضح أدناه ، اصنع وسائط تمايز جديدة يوميا عن طريق إضافة المكملات الغذائية واستخدامها في نفس اليوم. بدلا من ذلك ، توفر مجموعة السلف البنكرياس خيار تحضير حجم أكبر مسبقا يمكن استخدامه على مدار عدة أيام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. كلتا الطريقتين لإعداد وسائل الإعلام تثبت أنها تعمل بشكل جيد. لاحظ أنه لا ينصح بترك الوسائط لفترة طويلة في الحمام المائي. عند تحضير الوسائط الطازجة كل يوم ، يوصى بتناول مكملات القسمة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.

2. تمايز hPSCs إلى خلايا سلف البنكرياس

  1. حافظ على hPSCs غير المتمايزة على الأوعية المطلية ب Matrigel في mTeSR1 وسط كامل وقم بإجراء تغييرات متوسطة يوميا. أثناء ثقافة الصيانة ، تمر hPSCs كل 3-4 أيام عندما تصل الخلايا إلى التقاء ~ 70٪ باستخدام كاشف تفكك الخلايا باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. لبدء التمايز ، قم بفصل الخلايا إلى خلايا مفردة وزرعها على ألواح معالجة بزراعة الأنسجة من 6 آبار أو 12 بئرا (بأحجام وسائط تبلغ 2 مل أو 1 مل لكل بئر ، على التوالي).
    ملاحظة: انظر الجدول 1 للحصول على التعليمات المتعلقة بتخزين الوسط القاعدي للأديم الباطن وقساماته.
  2. قم بطلاء آبار الاستزراع باستخدام Matrigel المؤهل من hESC (المخفف في DMEM / F12 المثلج البارد على النحو الموصى به من قبل بروتوكول الشركة المصنعة) ووضع اللوحة في حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
  3. انقل اللوحة المطلية ب Matrigel إلى درجة حرارة الغرفة (استخدمها في غضون 3 ساعات).
  4. نضح الوسيط المستهلك من ثقافة hPSC واشطفه مرة واحدة باستخدام DPBS. فصل ثقافة hPSC إلى خلايا مفردة مع إنزيم تفكك الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. اشطف الخلايا بإضافة وسط DMEM / F12 دافئ ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل أو 50 مل ، ثم قم بتدويرها على × 300 جم لمدة 5 دقائق.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية بوسط كامل للخلايا الجذعية بالإضافة إلى 10 ميكرومتر Y-27632 وقم بإجراء عد الخلايا الحية (التريبان الأزرق السلبي) باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي. نضح Matrigel المخفف وزرع الخلايا الحية على الفور بكثافة 1.60-1.80 × 105 / سم 2 على آبار مغطاة ب Matrigel واحتضانهافي حاضنة CO2 رطبة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. انتقل إلى المرحلة 1.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى ~ 95٪ بدء التقاء لبدء التمايز. وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، يوصى بكثافة بذر تبلغ 2.6 × 105 / سم2 . يوصى باختبار كثافات البذر المختلفة لتحديد القيمة المثلى لخط الخلية والتحقق من صلاحية الخلية. إذا كانت الجدوى أقل من 80٪ ، فلا تتابع التمايز. يمكن أن يكون انخفاض صلاحية الخلية نتيجة لفرط الهضم أو الإفراط في الحفر أثناء الحصاد أو ترك الخلايا لفترة طويلة في وسط DMEM / F12 قبل البذر.
  6. في المرحلة 1 اليوم الأول ، قم بتدفئة الأديم الباطن القاعدي لفترة وجيزة إلى 37 درجة مئوية في الحمام وإذابة مكمل MR و CJ. تحضير المرحلة 1A المتوسطة عن طريق إضافة ملحق MR و CJ إلى الوسط القاعدي الأديم الباطن. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  7. نضح الوسط المستهلك من الآبار ، وأضف وسط المرحلة 1A واحتضانه في حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: خطوات الغسيل غير ضرورية. قم بإزالة أي خلايا غير متصلة من المزرعة عن طريق هز لوحة الثقافة برفق قبل التبادل المتوسط. تجنب تعطيل الطبقة الأحادية عن طريق عدم لمس طرف الماصة إلى أسفل البئر أثناء الإزالة المتوسطة ومن خلال الإضافة المتوسطة اللطيفة.
  8. في المرحلة 1 اليوم 2 ، قم بتسخين الوسط القاعدي للأديم الباطن لفترة وجيزة في حمام 37 درجة مئوية وإذابة مكمل CJ. تحضير المرحلة 1B المتوسطة عن طريق إضافة الملحق CJ إلى الوسط القاعدي الأديم الباطن. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  9. استنشاق الوسط المستهلك من الآبار ، وإضافة وسط المرحلة 1B ، واحتضانفي حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ لمدة 24 ساعة.
  10. في المرحلة 1 اليوم 3 ، كرر الخطوات 2.8-2.9. انتقل إلى المرحلة 2.
  11. في المرحلة 2 اليوم الأول ، دافئ البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية المتوسطة في حمام 37 درجة مئوية وذوبان الجليد الملحق 2A و 2B. تحضير المرحلة 2A المتوسطة عن طريق إضافة الملحق 2A و 2B إلى البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية الوسطى. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  12. نضح الوسط المستهلك من الآبار ، وأضف وسط المرحلة 2A ، واحتضانه في حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  13. في المرحلة 2 اليوم الثاني ، دافئ البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية المتوسطة في حمام 37 درجة مئوية وذوبان الجليد الملحق 2B. تحضير المرحلة 2B المتوسطة عن طريق إضافة الملحق 2B إلى البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية المتوسطة. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  14. نضح الوسط المستهلك من الآبار ، وأضف وسط المرحلة 2B ، واحتضن في حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  15. في المرحلة 2 اليوم 3، كرر الخطوات 2.13-2.14. انتقل إلى المرحلة 3.
  16. في المرحلة 3 اليوم 1 ، دافئ البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية المتوسطة في حمام 37 درجة مئوية وذوبان الجليد الملحق 3. قم بإعداد المرحلة 3 المتوسطة عن طريق إضافة الملحق 3 إلى المرحلة البنكرياسية 2-4 الوسط القاعدي. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  17. نضح الوسط المستهلك من الآبار ، وأضف وسط المرحلة 3 ، واحتضانهفي حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ لمدة 24 ساعة.
  18. في المرحلة 3 اليوم 2 واليوم 3 ، كرر الخطوات 2.16-2.17. انتقل إلى المرحلة 4.
  19. في المرحلة 4 اليوم 1 ، دافئ البنكرياس المرحلة 2-4 القاعدية المتوسطة في حمام 37 درجة مئوية وذوبان الجليد الملحق 4. قم بإعداد المرحلة 4 المتوسطة عن طريق إضافة الملحق 4 إلى المرحلة 2-4 من البنكرياس القاعدية. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  20. نضح الوسط المستهلك من الآبار ، وأضف وسط المرحلة 4 ، واحتضن في حاضنة CO2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ لمدة 24 ساعة.
  21. في المرحلة 4 من اليوم الثاني إلى اليوم 4 ، كرر الخطوات 2.19-2.20. انتقل إلى خطوات التجميع.

3. التجميع في مجموعات السلف البنكرياس باستخدام ألواح ميكروويل قطرها 400 ميكرومتر

  1. في المرحلة 4 ، اليوم 5 ، قم بمعالجة الآبار الدقيقة (على سبيل المثال ، شكل لوحة 24 بئرا) ب 500 ميكرولتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق لكل بئر.
  2. قم بإعداد لوحة التوازن وأجهزة الطرد المركزي للوحة microwell عند 1300 × جم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: افحص اللوحة تحت المجهر للتأكد من عدم ترك فقاعات في الآبار الدقيقة. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق أخرى إذا ظلت الفقاعات محاصرة في أي آبار صغيرة.
  3. نضح محلول الشطف المضاد للالتصاق من الآبار واشطفه مرة واحدة باستخدام 1 مل من DPBS. نضح DPBS من الآبار وإضافة 1 مل من وسط التجميع إلى كل بئر.
  4. قم بإزالة الوسط المستهلك من مزارع سلف البنكرياس واغسله مرة واحدة باستخدام DPBS. فصل الثقافات إلى خلايا مفردة مع كاشف التفكك عند 37 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة. اشطف الخلايا باستخدام DMEM / F12 الدافئ ، وانقلها إلى أنبوب ، ثم قم بتدويرها بمعدل 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط التجميع وقم بإجراء عد الخلايا الحية. قم بزراعة 2.4-3.6 مليون خلية إجمالية لكل بئر (أي 2000-3000 خلية لكل ميكروويل) وإضافة وسط تجميع لكل بئر لتحقيق حجم نهائي قدره 2 مل لكل بئر.
  6. ماصة بلطف الخلايا صعودا وهبوطا عدة مرات مع طرف ماصة P1000 لضمان التوزيع المتساوي للخلايا في جميع أنحاء البئر. لا تدخل الفقاعات في الآبار الصغيرة. أجهزة الطرد المركزي لوحة microwell في 300 × غرام لمدة 5 دقائق لالتقاط الخلايا في microwells. احتضان صفيحة microwellفي حاضنة CO 2 رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ لتجميع 24 ساعة وانتقل إلى المراحل 5-7 التمايز.
    ملاحظة: احرص على عدم إزعاج اللوحة أثناء وقت التجميع. قد تكون هناك حاجة إلى ما يصل إلى 48 ساعة من وقت الحضانة لتشكيل الركام الأمثل.

4. تمايز مجموعات السلف البنكرياس المشتقة من المجموعة إلى جزر hPSC

  1. في المرحلة 5 اليوم الأول ، قم بتسخين المرحلة 5-7 من الوسط القاعدي في حمام 37 درجة مئوية ومكملات الذوبان (انظر الجدول 1 والجدول 2). قم بإعداد المرحلة 5 المتوسطة عن طريق إضافة المكملات الغذائية (إلى تركيزات العمل النهائية) إلى المرحلة 5-7 الوسط القاعدي. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  2. بعد تكوين الركام ، قم بسحب الركام برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام طرف ماصة P1000 لتعويم أي خلايا غير مجمعة. اسمح للمجاميع بالاستقرار عن طريق الجاذبية (انتظر ~ 1 دقيقة). قم بإزالة الوسط المستهلك برفق (الذي يحتوي على الخلايا العائمة غير المجمعة) من البئر قدر الإمكان مع تجنب استنشاق الركام.
  3. قم بتوزيع المرحلة 5 المتوسطة الطازجة بقوة على سطح لوحة البئر الدقيقة لإزاحة الركام من الآبار الدقيقة. نقل الركام إلى مرفق منخفض للغاية (ULA) 6 آبار. اشطفها مرة واحدة باستخدام وسيط المرحلة 5 لاسترداد الركام بالكامل من الآبار الدقيقة.
  4. اجمع كل الركام في آبار ULA 6 ، وأعد تعليق الركام في وسط المرحلة 5 ، واضبط الكثافة إلى 20 مجموعة لكل 100 ميكرولتر (على سبيل المثال ، من المتوقع استرداد ~ 1200 مجموعة من كل بئر. إعادة تعليق 1200 مجموعة في 6 مل من وسط المرحلة 5). استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 50 ميكرولتر من وسط المرحلة 5 في كل بئر من لوحة ULA ذات القاع المسطح 96 بئرا. املأ آبار الزاوية والحافة ب 200 ميكرولتر من DPBS.
    ملاحظة: تجنب استخدام الآبار الطرفية لزراعة الركام لأنها عرضة لمزيد من التبخر ؛ بخلاف ذلك ، استخدم صفيحة 96 بئرا مصممة لتقليل التبخر على طول الحواف (على سبيل المثال ، ألواح 96 بئرا مع خنادق مدمجة) أو ضع لوحة الاستزراع في حاضنة زراعة خلايا مناخية عالية الرطوبة.
  5. أضف 100 ميكرولتر من إعادة التعليق العنقودي إلى كل بئر من صفيحة ULA ذات القاع المسطح 96 بئرا ، مما ينتج عنه إجمالي 150 ميكرولتر وسط استزراع يحتوي على متوسط 20 مجموعة لكل بئر.
    ملاحظة: امزج إعادة تعليق الكتلة برفق في كل مرة قبل الاستغناء عنها في 96 بئرا.
  6. ضع ألواح الاستزراع على سطح مستوفي حاضنة CO 2 مرطبة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  7. في المرحلة 5 اليوم 2 ، قم بإعداد المرحلة 5 المتوسطة باتباع الخطوة 4.1.
  8. استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة ~ 90 ميكرولتر من الوسط المستهلك من كل بئر ، وقم بالتحديث باستخدام 100 ميكرولتر من وسيط المرحلة 5.
  9. في المرحلة 5 اليوم 3 ، كرر الخطوات 4.7-4.8. انتقل إلى المرحلة 6.
  10. في المرحلة 6 اليوم الأول ، قم بتسخين المرحلة 5-7 من الوسط القاعدي في حمام 37 درجة مئوية ومكملات الذوبان (انظر الجدول 1 والجدول 2). قم بإعداد المرحلة 6 المتوسطة عن طريق إضافة المكملات الغذائية (إلى تركيزات العمل النهائية) إلى المرحلة 5-7 الوسط القاعدي. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  11. استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة ~ 90 ميكرولتر من الوسط المستهلك والتحديث ب 100 ميكرولتر من وسيط المرحلة 6 لكل بئر.
  12. في المرحلة 6 من اليوم 2 إلى اليوم 8 ، كرر الخطوات 4.10-4.11. انتقل إلى المرحلة 7.
  13. في المرحلة 7 اليوم الأول ، يسخن الوسط القاعدي للمرحلة 5-7 في حمام 37 درجة مئوية ومكملات الذوبان (انظر الجدول 1 والجدول 2). قم بإعداد وسط المرحلة 7 عن طريق إضافة مكملات (إلى تركيزات العمل النهائية) إلى الوسط القاعدي للمرحلة 5-7. تخلط جيدا وتستخدم على الفور.
  14. استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة ~ 90 ميكرولتر من الوسط المستهلك والتحديث ب 100 ميكرولتر من وسط المرحلة 7 لكل بئر.
  15. في المرحلة 7 من اليوم 2 إلى اليوم 12 ، كرر الخطوات 4.13-4.14. انتقل إلى التوصيف في المختبر .

5. تحليل التدفق الخلوي

  1. قم بإزالة وسائط الثقافة واغسلها مرة واحدة باستخدام DPBS. فصل الثقافات (الخلايا السلفية المستوية أو المجموعات المتمايزة) إلى خلايا مفردة مع كاشف التفكك عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة. يشطف بمحلول FACS ويعصر على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  2. أعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت FACS وقم بإجراء عد الخلايا. تدور الخلايا على 300 × غرام لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا المفردة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت Fix / Perm لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: أحضر المخزن المؤقت Fix / Perm إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. يحتوي المخزن المؤقت Fix / Perm على بارافورمالدهيد (PFA). تعامل بعناية مع PFA في غطاء دخان وتخلص منه وفقا للإرشادات المؤسسية.
  3. قم بالدوران عند 500 × جم لمدة 3 دقائق ، واغسله مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من 1x Perm / Wash buffer ، ثم أعد التعليق في 300 ميكرولتر من 1x Perm / Wash buffer. نقل 100 ميكرولتر من إعادة التعليق أحادي الخلية (يحتوي كل منها على 2.5-3 × 105 خلايا) إلى ثلاثة أنابيب ميكروفوج للتحكم غير الملوث ، والتحكم في النمط المتماثل ، وتلطيخ الأجسام المضادة (انظر جدول المواد للحصول على عينة من الأجسام المضادة ومعلومات التخفيف). احتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتغطي مع احباط.
  4. تدور في 500 × غرام لمدة 3 دقائق. يغسل مرتين مع 500 ميكرولتر من 1x بيرم / غسل العازلة. إعادة تعليق العينات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وتحليل الخلايا الملطخة (انظر جدول المواد لتلطيخ العلامات داخل الخلايا في مراحل محددة) باستخدام مقياس التدفق الخلوي والبرنامج (على سبيل المثال ، FlowJo).
    ملاحظة: إذا لم يتم فحص العينات على الفور ، فقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية محمية من الضوء. بالنسبة لاستراتيجية البوابات ، يتم أولا بوابات بيانات التدفق بواسطة خصائص التشتت (FSC-A و SSC-A) لإزالة الحطام الخلوي الصغير متبوعا بخصائص عرض FSC-A و FSC لتحديد المفردات. يتم تحديد البوابات الإيجابية والسلبية من خلال ضوابط الخلايا الجذعية و / أو ضوابط النمط المتماثل غير الملوثة.

6. كامل جبل المناعي

  1. جمع العناقيد في أنبوب microfuge. تسوية المجموعات عن طريق الجاذبية. نضح الوسط المستهلك وشطف مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم). ثبت المجموعات ب 1 مل من 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  2. شطف مرة واحدة مع PBST وتخلل 20-30 مجموعة مع 500 ميكرولتر من 0.3٪ TritonX-100 في أنبوب microfuge في درجة حرارة محيطة لمدة 6 ساعات على الأقل على شاكر مائل.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى وقت نفاذية أطول (حتى 24 ساعة) للمجموعات الكبيرة.
  3. احتضان المجموعات في 100 ميكرولتر من العازلة المانعة في درجة الحرارة المحيطة لمدة 1 ساعة على شاكر مائل. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع واحتضان المجموعات ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول تخفيف الأجسام المضادة في درجة الحرارة المحيطة طوال الليل على شاكر مائل.
    ملاحظة: إذا كانت الخلفية قوية أثناء التصوير ، فقم باحتضانها بالأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل 3 × 30 دقيقة باستخدام 500 ميكرولتر من PBST جيدا على شاكر إمالة (زاوية الميل مضبوطة على 8 ، السرعة مضبوطة على 20).
  5. احتضان المجموعات ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في مخزن تخفيف الأجسام المضادة في درجة الحرارة المحيطة طوال الليل على شاكر مائل. تغطية الأنابيب مع احباط.
    ملاحظة: إذا كانت الخلفية قوية أثناء التصوير ، احتضان الأجسام المضادة الثانوية عند 4 درجات مئوية.
  6. شطف مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من PBST. أضف 100 ميكرولتر من محلول 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) (10 ميكروغرام / مل في PBST) وصمة عار في درجة الحرارة المحيطة لمدة 10-15 دقيقة. مع تغطية احباط وحماية من الضوء.
  7. اغسل 3 × 30 دقيقة باستخدام 500 ميكرولتر من PBST جيدا على شاكر قابل للإمالة. قم بتغطية الأنابيب بورق أثناء خطوة الغسيل.
  8. قم بتوصيل المجموعات بشرائح غرفة التصوير (انظر جدول المواد) المطلية مسبقا بمادة لاصقة للأنسجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والبروتوكولات المنشورة20,21.
  9. جبل مع وسط تطهير الأنسجة (80 ٪ الجلسرين في محلول PBS) وتغطي مع أغطية زجاجية. يحفظ بعيدا عن الضوء حتى التصوير متحد البؤر.
    ملاحظة: إذا لم يتم تصوير العينات على الفور ، فقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

7. مقايسة GSIS الثابتة

  1. عازلة كريب رينجر (3.3 جيجا KRB) العازلة الدافئة منخفضة الجلوكوز (16.7 جم) ، وعازلة KRB عالية الجلوكوز (16.7 جم) ، وعازلة 30 مللي متر KCl KRB في حمام 37 درجة مئوية.
  2. اختر يدويا المجموعات المتطابقة الحجم واشطفها ب 2 مل من المخزن المؤقت الدافئ KRB سعة 3.3 جرام. انقل المجموعات إلى صفيحة 6 آبار غير معالجة بزراعة الأنسجة وقم بموازنتها في 2 مل أو مخزن مؤقت دافئ 3.3 جرام KRB لمدة 1 ساعةفي حاضنة CO 2 مرطبة 37 درجة مئوية ، 5٪.
  3. بعد التوازن ، املأ غرفة الفحص (انظر جدول المواد) ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ 3.3G KRB. اختر يدويا خمس مجموعات وانقلها إلى مركز غرفة الفحص. احتضان لمدة 30 دقيقةفي حاضنة CO 2 مرطبة 37 درجة مئوية ، 5٪.
    ملاحظة: استخدم أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر لنقل المجموعات ذات الحجم المتوسط الأدنى.
  4. اجمع بعناية ~ 100 ميكرولتر من المادة الطافية وقم بتخزينها في -30 درجة مئوية حتى قياس إفراز الأنسولين الأساسي (انظر الخطوة 7.9). لا تجف أو تفقد أي مجموعات في هذه الخطوة. أضف على الفور 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ 16.7G KRB إلى غرفة الفحص واحتضان نفس المجموعات لمدة 30 دقيقةفي حاضنة CO 2 مرطبة 37 درجة مئوية ، 5٪.
  5. اجمع بعناية ~ 100 ميكرولتر من المادة الطافية وقم بتخزينها عند -30 درجة مئوية حتى قياس إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (انظر الخطوة 7.9). أضف على الفور 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ 30 mM KCl KRB إلى غرفة الفحص واحتضان نفس المجموعات لمدة 30 دقيقةفي حاضنة CO 2 مرطبة 37 درجة مئوية ، 5٪.
  6. اجمع بعناية ~ 100 ميكرولتر من المادة الطافية واحفظها عند -30 درجة مئوية حتى قياس إفراز الأنسولين المحفز ب KCl (انظر الخطوة 7.9). أضف على الفور 100 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA إلى غرفة الفحص وانقل المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على جميع المجموعات الخمس إلى أنبوب microfuge.
  7. اختياري) قم بكسر المجموعات يدويا عن طريق التثليج القوي باستخدام طرف ماصة P200. دوامة لمدة 30 ثانية واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة تليها 30 ثانية أخرى من الدوامة.
    ملاحظة: تأكد من التحلل الكامل عن طريق الدوامة والوقت الكافي للحضانة على الجليد.
  8. تدور في 8000 × غرام لمدة 1 دقيقة. اجمع المادة الطافية واحفظها في درجة حرارة -30 درجة مئوية حتى قياس إجمالي محتوى الأنسولين (انظر الخطوة 7.9).
  9. قم بقياس الأنسولين البشري في العينات الطافية باستخدام مجموعة الأنسولين البشري ELISA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والبروتوكولات المنشورة20,22.
    ملاحظة: تجنب التجميد والذوبان المتكرر للعينات الطافية. لا ينبغي فحص العينات التي تحتوي على أكثر من ثلاث دورات تجميد وذوبان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لقد طورنا استراتيجية هجينة لتمييز الخلايا الجذعية إلى جزر hPSC التي تفرز الأنسولين في سبع خطوات ، والتي تستخدم مجموعة سلفية للبنكرياس للمراحل الأربع الأولى في الثقافة المستوية ، متبوعة ببروتوكول معدل مبني على الطريقة6 المبلغ عنها سابقا في ثقافة تعليق ثابتة للمراحل الثلاث الأخيرة (الشكل 1). باستخدام هذا البروتوكول ، يعد ضمان وجود ثقافة قريبة من الالتقاء (90٪ -100٪) عند 24 ساعة بعد بذر الخلية (المرحلة 0) أمرا بالغ الأهمية لبدء تمايز فعال لمعظم خطوط hPSC (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تصف هذه الورقة بروتوكولا هجينا من سبع مراحل يسمح بتوليد جزر hPSC قادرة على إفراز الأنسولين عند تحدي الجلوكوز في غضون 40 يوما من الثقافة في المختبر. من بين هذه الخطوات المتعددة ، يعتقد أن الحث الفعال للأديم الباطن النهائي يضع نقطة انطلاق مهمة لنتائج التمايز النهائية18،27،28. في بروتوكول الشركة المصنعة ، يوصى بكثافة البذر عند 2.6 × 105 / سم2 لبدء التمايز ، وتتعرض الخلايا لوسائط المرحلة 1 لمدة يومين. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

كان تيموثي جيه كيفر موظفا في ViaCyte أثناء إعداد هذه المخطوطة. يعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

نحن نقدر بامتنان الدعم المقدم من STEMCELL Technologies و Michael Smith Health Research BC و Stem Cell Network و JDRF والمعاهد الكندية للبحوث الصحية. حصل جيا تشاو وشينغهوي ليانغ على جائزة مايكل سميث للبحوث الصحية في كولومبيا البريطانية للمتدربين. ميتشل ج. س. برام حاصل على زمالة Mitacs Accelerate. حصلت Diepiriye G. Iworima على منحة ألكسندر جراهام بيل الكندية للدراسات العليا وجائزة CFUW 1989 Ecole Polytechnique التذكارية. نشكر بصدق الدكتور إدوارد ج. ستانلي من MCRI وجامعة موناش لمشاركة خط Mel1 INS GFP / W ومعهد ألبرتا للسكري Islet Core لعزل وتوزيع الجزر البشرية. كما نعترف بالدعم المقدم من مرافق التصوير وقياس التدفق الخلوي التابعة لمعهد علوم الحياة في جامعة كولومبيا البريطانية. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3،3 '، 5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397هرمون الغدة الدرقية
4٪ محلول PFAسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-281692يجب التعامل معها في غطاء الدخان
96-Well ، مرفق منخفض للغاية ، قاع مسطحCorning Costar (VWR)CLS3474قاع مسطح ؛ لثقافة التعليق الثابت في المراحل الثلاث الأخيرة
AccutaseSTEMCELL Technologies07920كاشف التفكك لخلايا المرحلة 4
Aggrewell400 لوحاتSTEMCELL Technologies34415400 & micro ؛ لوحات ميكروويل بقطر متر
لوحات Aggrewell800 STEMCELLTechnologies34815800 & micro ؛ أطباق ميكروويل بقطر م
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Human FOXA2 (الماعز IgG)R & D SystemsIC2400G1: 100 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 1
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR & D SystemsIC108G1: 100 في قياس التدفق
Alexa Fluor 488 Mouse Anti-Human SST (الماوس IgG2B)BD Sciences5660321: 250 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 7
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B التحكم في النمط النظيريR & D SystemsIC0041G1: 500 في قياس التدفق الخلوي
Alexa Fluor 647 الفأر المضاد للإنسان C-الببتيد (الماوس IgG1 & kappa ;)BD Pharmingen5658311: 2,000 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 7
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (الفأر IgG1 & kappa;)BD Sciences5656891: 2,000 في قياس التدفق
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-Human NKX6.1 (الماوس IgG1 & kappa ؛)Sciences5633381:33 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 4
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (الفأر IgG1 & kappa ؛)BD 5625941:50 في قياس التدفق الخلوي. تستخدم لفحص خلايا المرحلة 1
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1 & kappa; التحكم في النمط المتماثلBDSciences 5577141:50 في قياس التدفق الخلوي
ALK5i IIكايمان للكيماويات14794TGF-beta مثبط الإشارات
المضاد للالتصاق محلول الشطف   ؛STEMCELL Technologies7010فحص محلول شطف Microwell
CellvisD35-10-1-Nلأغراض GSIS الثابتة والتصوير متحد البؤر
ألبومين مصل البقر (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100لإجراء التلوين المناعي
الجسم المضاد CK19DAKOM08881:50 في التألق المناعي
الكامل D-glucoseSigmaG8769مكمل متوسط
DAPISigmaD9542لمضاد البقع النووية
DMEM / F12 ، محلولتخفيف مصفوفة11330032Thermo Fisher
مضادا للماعز Alexa Fluor 555Life TechnologiesA214321: 500 في التألق المناعي كامل
الحمار المضاد للماعز Alexa Fluor 647Life تقنياتA214471: 500 في كامل الجبل المناعي التألق
الحمار المضاد للفأر Alexa Fluor 555تقنيات الحياةA315701: 500 في التألق المناعي كامل
حمار مضاد للفأر Alexa Fluor 647تقنيات الحياةA315711: 500 في التألق المناعي كامل
حمار مضاد للأرانب Alexa Fluor 555تقنيات الحياةA315721: 500 في التألق المناعي كامل
الحمار المضاد للأرانب Alexa Fluor 647Life technologiesA315731: 500 في التألق المناعي
الحمار المضاد للأغنام Alexa Fluor 647Life technologiesA214481: 500 في التألق المناعي
DPBSSigmaD8537بدون Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup>
ELISA ، الأنسولين ، Alpco البشري80-INSHU-E01.1لقياس الأنسولين البشري
المكملاتالخالية من الأحماض الدهنية BSAProliant68700
Sciences 554714Fix / Perm و 10x Perm / Wash متضمنة
كاشف تفكك الخلايا اللطيفSTEMCELL Technologies7174لمرور التكتلات hPSCs أثناء ثقافة الصيانة
الجسم المضاد للجلوكاجونSigmaG26541: 400 في الجسم المضاد للتألق المناعي
GLUT1كامل الجبل Thermo Fisher ScientificPA1-377821: 200 في التألق المناعي
الجبل GlutaMAX-I (100x)مكمل Gibco35050061L-glutamine
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4لتنظيف الأنسجة وتركيبها
GSi XXSigma Milliporeمثبط 565789Notch
HeparinSigmaH3149مكمل غذائي متوسط
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - الإيثانول أمين ؛ مكمل غذائي
متوسط LDN193189   ؛STEMCELL Technologies72147المضاد
MAFA المضادAbcamab264051: 200 في التألق المناعي
الجبل Matrigel ، المؤهل من hESCThermo Fisher Scientific08-774-552مصفوفة خارج الخلية لطلاء سطح الوعاء
MCDB131 تقنيات الحياة المتوسطة10372019مجموعة كاملة من القاعدة المتوسطة
mTeSR1STEMCELL تقنيات85850وسيط الخلايا الجذعية ومكملات 5x وشملت
N-Cys (N-acetyl cysteine)SigmaA9165Antioxidant
NaHCO3< / sub>SigmaS6297مكمل غذائي
متوسط NEUROD1 الأجسام المضادةR & D SystemsAF27461:20 في الجسم المضاد للتألق المناعي
NKX6.1كامل الجبل DSHBF55A12-c1:50 في
الأجسام المضادة للجسم المضاد للبنكرياس البولي ببتيد& D SystemsAF62971: 200 في كامل جبل التألق المناعي
PBSSigmaD8662مع Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup>
PDX1 الجسم المضادAbcamab472671: 200 في كامل جبل التألق
المناعي PE ماوس مضاد للإنسان GCG (الماوس IgG1 & kappa;)علوم BD5658601: 2,000 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 7
PE Mouse المضادة للإنسان NKX6.1 (الفأر IgG1k) BDSciences5630231: 250 في قياس التدفق الخلوي
PE Mouse المضاد للإنسان PDX1 (الفأر IgG1k) BDSciences5621611: 200 في قياس التدفق الخلوي ؛ تستخدم لفحص خلايا المرحلة 4
Mouse IgG1 & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثلBD Sciences5546801: 2,000 في قياس التدفق الخلوي
PE الفأر - الكروموجرانين البشري A (CHGA ، الفأر IgG1k) BDSciences5645631: 200 في قياس التدفق الخلوي
R428   ؛كايمان كيماويات21523AXL مثبط التيروزين كيناز
حمض الريتينويد ،الحساسة للضوء
10xSigma20-188لاستخراج الهرمونات
SANT-1SigmaS4572SHH
مثبط SLC18A1 الجسم المضادSigmaHPA0637971: 200 في التألق المناعي الكامل
الأجسام المضادة للسوماتوستاتينسيجماHPA0194721:100 في التألق المناعي
الجبل STEMdiff طقم سلف البنكرياسSTEMCELL Technologies05120تضمنت الوسائط القاعدية والمكملات
الجسم المضاد SynaptophysinNovusNB120-166591:25 في التألق المناعي بالكامل
Triton X-100SigmaX100للنفاذية
Trolox تقنيات Sigma Millipore648471فيتامين E التناظرية
TrypLE Enzyme ExpressLife12604-021كاشف إنزيم تفكك الخلية لخلية واحدة عابرة hPSCs
Trypsin1/2/3 الجسم المضادR & D SystemsAF35861:25 في التألق المناعي كامل
Y-27632STEMCELL Technologies72304مثبط الصخور
كبريتات الزنكSigmaZ0251مكمل متوسط
الخلوي الخلوي BD علوم غرفة العلمي HEPES حمارا كامل كامل مجموعة حلول تثبيت ونفاذية الغذائية BD كامل BMP كامل R PE عازلة تحلل RIPA ، كامل

المراجع

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278(2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046(2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540(2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245(2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

PDX1 NKX6 1
تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات الجزر المنتجة للأنسولين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.