إنشاء نموذج شفاء تجويف استخراج ضرس الفك السفلي

يعد التئام التجويف بعد قلع الأسنان سيناريو سريريا شائعا ، والذي يمكن أن يؤدي إلى مضاعفات غير لائقة مثل نزيف التجويف أو السنخ الجاف أو حتى التهاب العظم والنقي في الفك تحت الشفاء غير المرغوب فيه¹،^2،3. قد تضعف هذه الأمراض المصاحبة نوعية حياة المرضى ، والأسوأ من ذلك ، أنها تتحدى بشكل حيوي إعادة التأهيل الاصطناعي بسبب فقدان العظام الهائل⁴. على الرغم من توضيح مراحل شفاء التجويف ، إلا أنها غير كافية لتوجيه الرعاية السريرية بعد جراحة قلع الأسنان عند مواجهة تحديات التشخيص المختلفة⁴.

تم إجراء دراسات متعددة تستند إلى نماذج حيوانية لاكتساب فهم أفضل للآليات الأساسية في عملية شفاء التجويف وتجنب المواقف المذكورة أعلاه. Sp7 هو منظم رئيسي في تمايز بانيات العظم ، ويلعب دورا حيويا في نمو الهيكل العظمي ، وإرقاء العظام ، وتجديد العظام ^5,6. يمكن أن تعرض نماذج الشفاء العقلاني التجويف تكرار Sp7 بعد الصدمة في تجديد العظام. بالإضافة إلى ذلك ، بخلاف التئام كسور العظام الطويلة ، فإن عملية عظمية واحدة فقط ، التعظم داخل الغشاء ، تتضمن عملية الشفاء من مقبس الاستخراج⁷. هذا يجعل نموذج قلع الأسنان الحيوانية مثاليا لدراسة العلاجات القائمة على الزرع ، حيث أن الاندماج العظمي للزرع يطيع نفس القاعدة^{العظمية 8}.

لعقود من الزمان ، تم إجراء نموذج قلع الأسنان في الفئران والأرانب والكلاب ، لأن هذه الأنواع لها أسنان كبيرة ملائمة للعمل على⁹،^10،11. ومع ذلك ، نظرا للمطالب المزدهرة للتعديل الوراثي وكخلفية وراثية أكثر تكيفا مع البشر ، يتم استخدام الفئران بشكل متزايد لإنشاء نموذج قلع الأسنان. من الآن فصاعدا ، يمكن للباحثين الكشف عن دور مجموعة خلايا معينة في عملية شفاء المقبس باستخدام الفئران المعدلة بالجينوم بدلا من مراقبة الأنماط الظاهرية¹² فقط. من بين نماذج مقبس قلع أسنان الفئران ، أظهرت الدراسات السابقة عملية إنشاء وشفاء أسنان الفئران الفكية ومآخذ قلع القواطع^{القاطعة 13}،¹⁴،^15،16. ومع ذلك ، قد يختلف نمط الشفاء من التشخيص ، والنقاط الزمنية المخبرية والملاحظة ، عبر البروتوكولات. هذا يناشد معيارا عالميا للعلماء لإنشاء نموذج شفاء تجويف الفئران.

تهدف هذه الدراسة إلى تشكيل نموذج عملي لشفاء تجويف الفئران للقضايا المذكورة أعلاه. تتميز أضراس الفك السفلي في الفئران بسمات مورفولوجية مميزة مقارنة بأضراس الفك العلوي والقواطع ، مما يجلب مزايا وعيوب فريدة. نظرا لأن النماذج التي تركز على الفك السفلي للفأر تعتمد حاليا على الفراغ ، فقد حاول هذا البروتوكول توفير طريقة بارعة لاستخراج الضرس الأول للفك السفلي في الفئران. نأمل أن ينير هذا البروتوكول الباحثين الأساسيين بأفكار جديدة للكشف عن الآليات الأساسية لشفاء المقبس والإشارة إلى الرعاية السريرية.

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لمدرسة غرب الصين لطب الأسنان ، جامعة سيتشوان (WCHSIRB-D-2017-041). تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6 ، التي تم الحصول عليها من مصدر تجاري (انظر جدول المواد) ، في هذه الدراسة.

1. التحضير قبل الجراحة

1. إعداد الصك
   1. قم بإعداد إبر مختلفة من المحاقن التي تستخدم لمرة واحدة (26G ، 25G ، 23G ؛ انظر جدول المواد) لاستخدامها كمصاعد. قم بتحويل رأس الإبرة حوالي 20 درجة -40 درجة ، كما هو موضح في الشكل 1.
   2. تحضير ملاقط العيون المسننة كملقط. تأكد من أنه يناسب حجم أضراس الفئران ويمكنه الإمساك بالأضراس بإحكام. يظهر حجم الملقط المثالي في الشكل 1A ، B3.
   3. احصل على شريط مطاطي (يمكن تمزيقه من قفاز اللاتكس الطبي) لاستخدامه كفتاحة فم ، ولوح رغوة أو لوح فلين كمنصة جراحية ، ومصباح أمامي لإضاءة منطقة الجراحة ، ووسادة تدفئة لإحياء ما بعد الجراحة. قم بتمزيق كرة قطنية جافة إلى قطع صغيرة وضعها على موقع الجراحة في حالة حدوث نزيف أثناء العملية.
2. إعداد التخدير
   1. يمكن تخدير الفأر بأي بروتوكول مخدر مناسب يحقق تخديرا عاما مؤكدا من خلال طريقة "قرصة إصبع القدم". بعد التخدير ، ضع مرهما بيطريا على عيون الماوس.
      ملاحظة: يمكن أن يكون بروتوكول التخدير العام المفضل هو: الحث والصيانة مع زيلازين (10 ملغم / كغم) والكيتامين (100 ملغم / كغم) داخل الصفاق (IP) ؛
      في هذه الدراسة ، تم استخدام إيزوفلوران و 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (50 مجم / كجم ، IP) لتحريض التخدير والصيانة بجرعات إضافية حسب الحاجة.
3. إعداد التطهير والتعقيم
   1. قم بتطهير منصة التشغيل والنفقات العامة في الهواء الطلق باستخدام بخاخ إيثانول بنسبة 75٪. قبل كل إجراء للماوس ، يوصى باستخدام مجموعة جديدة من الإبر التي تستخدم لمرة واحدة.
      ملاحظة: الملقط المسنن قابل لإعادة الاستخدام ويمكن تعقيمه باستخدام أي طريقة مفضلة مثل التعقيم بالبخار.

2. العملية الجراحية

1. تثبيت الفأر والفك السفلي
   1. اربط الماوس بمنصة جراحية في وضع ضعيف باستخدام شريط لاصق. قم بتثبيت إبرتين 26 G بما يتماشى مع مستوى الأذن المدارية وإبرتين أخريين 26 G بسهولة أسفل الفك السفلي.
   2. ضع الشريط المطاطي حول الإبر واعبر القواطع لإبقاء الفم مفتوحا. اسحب اللسان قليلا للخارج وقم بتثبيته تحت الشريط المطاطي المقابل للجانب الجراحي ، لمنعه من إعاقة مجال الرؤية (الشكل 1C).
2. القضاء على المقاومة البعيدة
   1. امسك الضرس بملاقط متوسطة ، وادفع إبرة 23 جم في العظم السنخي الشدقي للجذر البعيد ، وقم بعمل فاصل زمني.
      ملاحظة: يجب اتخاذ هذه الخطوة بحذر شديد ، لأن الإبرة المضمنة بعمق كبير من المحتمل أن تقطع الجذر.
   2. بعد ذلك ، قم بالتغيير إلى إبرة 25 G لمواصلة توسيع الفاصل الزمني ، والتقدم بدقة نحو المنطقة المحيطة بالذروة مع تدوير الإبرة ببطء للأمام ولغويا (مع الوضع التشريحي للفأر) للضغط على الجذر خارج الحفرة السنخية.
3. القضاء على المقاومة المتوسطة
   1. عندما يكون هناك مساحة كافية ، استخدم إبرة 23 G لإدخالها في شوكة الجذر ورفع الضرس بشكل إطباقي. بعد إمساك الضرس بإحكام ، خذ إبرة 23 G أخرى واجبرها على الدخول في الغشاء اللثوي المتوسط اللساني لإنشاء فاصل زمني.
   2. ثم استبدلها بإبرة 25 جم وقم بتدويرها ببطء للأمام والشدق. إذا كانت بعض العوائق الأساسية تعيق خلع الضرس ، فاستخدم إبرة 26 جم لاختراق قمة الجذر ، وكرر العمليات.
4. الاستخراج النهائي
   1. قلع السن ، وأثناء الاستخراج ، تأكد من أن التاج يرتفع عاليا فوق المستوى الإطباقي وأنه يمكن رؤية جذرين سليمين بوضوح.
      ملاحظة: يعتبر خلع (خلع) السن أكثر اللحظات إيلاما وحزنا في العملية. قبل خلع السن ، يجب إعادة تقييم عمق التخدير باستخدام اختبار قرصة إصبع القدم ، وبالتالي ، يجب إعطاء جرعة معتدلة من عامل مخدر إذا لزم الأمر.
5. رعاية ما بعد الجراحة
   1. بعد خلع السن ، ضع قطنا جافا لوقف النزيف ، وأعد وضع اللسان ، وتطبيق كاربروفين (5 مجم / كجم) تحت الجلد ، وضع الماوس على وسادة تسخين بدرجة حرارة ثابتة حتى الشفاء من التخدير.

3. تصوير الفك السفلي للفأر ومقبس الاستخراج

1. تحضير العينات
   1. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم. استخدم مقص العيون لقطع عضلات الهيكل العظمي المرتبطة بالفك السفلي والقوس الوجني. قطع من الحلق على طول الحافة السفلية للفك السفلي إلى الفرع الصاعد ثم إلى الجانب الخلفي من اللقمة ، ثم اسحب الفك السفلي لأسفل واقطع على طول خط الوسط السفلي القاطعة. بهذه الطريقة ، يتم حصاد الفك السفلي المنفصلين.
   2. قم بإجراء التثبيت وإزالة المعادن والجفاف باتباع الإجراء القياسي¹⁷. عند تضمين¹⁷، تأكد من أن مستوى الإطباق مواز لحافة الدرج (انظر جدول المواد). ثبت الفك السفلي في الجزء السفلي من الكاسيت ، مع تثبيت حافته السفلية (الشكل 2).
      ملاحظة: يقدم هذا البروتوكول المستوى السهمي لمنطقة الفك السفلي.
2. تثبيت العينة على الميكروتوم
   1. قم بتنظيم مشبك العينة في الميكروتوم لإبراز اللقمة وجانب التاج 5 درجات -20 درجة أكثر ، للحصول على صورة متكاملة من لب التاج المصاحب مع لب الجذر (الشكل 2).
3. إعداد الأقسام
   ملاحظة: اللقمة هي دائما أول بنية تشريحية يتم قطعها. عندما يتلاشى ، يمكن بعد ذلك تقطيع المنطقة المولية إلى عدة شرائح.
   1. قم بتحويل نطاق الميكروتوم إلى 5 ميكرومتر ، واجمع كل ثماني شرائح ، واستكشف العاج في الشريحة الأخيرة. إذا ظهر عاج التاج لأول مرة بدون أي عاج قمي جذري ، فاضبط مشبك العينة لجعل منطقة الجذر تبرز ، والعكس صحيح.
4. جمع الأقسام
   ملاحظة: زاوية القطع مناسبة حتى يتم الوصول إلى العاج بالتساوي في كل من منطقة التاج والقمي.
   1. قطع على طول هذا الاتجاه ومشاهدة الشرائح تحت المجهر حتى يظهر لب الأسنان في كل من التاج والجذور. اجمع الأقسام عندما يظهر محيط غامض من الأضراس على سطح عينة البارافين¹⁷.

لتوضيح الاستخدام العملي لهذه الطريقة ، تم استخراج الضرس الأول للفك السفلي الأيمن لاثنين من الفئران السليمة C57BL / 6 (3 أشهر من العمر ، كلاهما من الإناث) ومتابعته لمدة 1 أسبوع و 4 أسابيع ، على التوالي. تم استخدام الفك السفلي الأيسر غير التالف كضوابط صحية. يوضح الشكل 1 أ السمات المحددة للجهاز الجراحي ، بما في ذلك إبر 26-23 جم وملقط عيون مسنن. تتم إزالة إبرة 26 G بدقة وثنيها. تنحني إبرة 25 G عند حوالي 25 درجة عند النقطة الدقيقة. الإبر 23 G هي محور الجراحة وهي مثنية عند حوالي 25 درجة و 35 درجة ، على التوالي ، عند النقطة الدقيقة (الشكل 1B1 ، B2). تحتوي الملقط على سن بطول 1 مم يناسب شكل أضراس الفئران (الشكل 1B3). يوضح الشكل 1C حالة الفأر قبل الجراحة. النقاط الرئيسية هي موقع المسامير الأربعة حول الرأس وتثبيت اللسان تحت الشريط المطاطي على اليسار.

يوضح الشكل 3 أ موضع وشكل الضرس الأول للفك السفلي الأيمن. يشير الشكل 3B إلى أن تجويف الأسنان مملوء على الفور بالجلطة بعد الخلع. في 1 أسبوع و 2 أسابيع ، تم القتل الرحيم للفئران ، وتم إزالة المعادن من الفك السفلي ، ودمجها في البارافين17 ، وتقسيمها إلى شرائح. يعرض الشكل 4A عملية الشفاء من المقبس في 1 أسبوع. تم تشكيل بعض العظام التربيقية الشبيهة بالإسفنج ، لكن الجلطة بقيت. في عملية الشفاء في 2 أسابيع (الشكل 4B) ، تم ملء التجويف بالكامل بعظام الإسفنج ، مما يعني أن التجديد قد اكتمل تقريبا. كما أكد تلطيخ التألق المناعي (IF) نتائج تلطيخ التشريح المرضي. في الشكل 5 ، تم التعبير عن Sp7 على نطاق واسع في خلايا نخاع العظم ، وخاصة في الهامش ، وهو الجزء الأمامي المكون للعظام. في حالة الاتزان الداخلي ، كانت العظام التربيقية متسقة ومتقاربة ، مع رش كتل خلايا نخاع العظم مثل الجزر. ومع ذلك ، في 1 أسبوع بعد الجراحة ، ملأت العديد من الخلايا المعبرة عن Sp7 مقبس الاستخراج ، مع رش العظام التربيقية المشكلة حديثا. في 4 أسابيع بعد الجراحة ، انعكست الحالة وتحولت إلى عظم تربيقي مدمج إلى حد كبير مرة أخرى ، وانخفض نشاط الخلايا المعبرة عن Sp7 إلى مستوى يقترب من حالة التوازن.

الشكل 1: صور الأجسام للأجهزة الجراحية والفئران المعدة للجراحة . (أ) تتكون الأجهزة الجراحية بشكل أساسي من 26 و 25 و 23 جم من إبرة وملقط مسنن. (ب) تم ثني الإبر عند النقطة الدقيقة عند 20 درجة -40 درجة (B1،2). يجب أن يكون حجم سن الملقط حوالي 1 مم (B3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: المخطط الانسيابي للإجراء من قلع الأسنان إلى التقسيم. تعرض هذه الصورة تدفقا تخطيطيا من قلع الأسنان إلى التقسيم. تم استخراج الضرس الأول من الفك السفلي الأيمن وفقا للبروتوكول ، ثم تم القتل الرحيم للفأر ، وتم حصاد الفك السفلي. عند الحصاد ، تم نقع الفك السفلي في 4٪ POM لمدة 24 ساعة ، ثم أعيد نقعه في 10٪ EDTA ؛ تم تجديد السائل كل يوم لمدة 14 يوما. بعد ذلك ، تم تجفيف العينات ودمجها في البارافين وفقا لبروتوكول عالمي. يجب أن يكون الجانب الشدقي أو اللساني متجها لأسفل ، حيث من المفترض أن يتم تقسيم شرائح المستوى السهمي. أخيرا ، عند تثبيت العينة على مشبك العينة ، يجب أن تكون جوانب اللقمة والتاج بارزة بمقدار 5 درجات -20 درجة. الاختصارات: POM = بارافورمالدهيد. EDTA = حمض الإيثيلين ديامين رباعي الخليك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: صور مجسمة للضرس الأول للفك السفلي للفأر وتجويف الاستخراج. (أ) صورة مجسمة للضرس الأول من الفك السفلي الأيمن، يشار إليها بالسهم الأصفر. ب: تجويف الاستخراج للضرس الأول للفك السفلي الأيمن بعد الجراحة، ويشار إليه بالسهم الأصفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تلطيخ H&E . تلطيخ H& E لمقبس الاستخراج في (A) 1 أسبوع و (B) 4 أسابيع بعد الجراحة. تشير الأسهم الصفراء إلى الضرس الثاني للفك السفلي بالقرب من التئام مقبس استخراج الضرس الأول. يشير خط المستطيل المتقطع إلى منطقة مقبس الاستخراج المولي الأول للشفاء. قضبان المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: الكشف عن Sp7 عبر تلطيخ IF. توضح هذه الصورة توزيع تعبير Sp7 في خلايا نخاع العظم الفك السفلي للفأر والعظم التربيقي المحيط تحت حالة التوازن (التحكم الصحي) ، 1 أسبوع و 4 أسابيع بعد الجراحة ، على التوالي. حدد الخط الأبيض المتقطع الحجم المقدر للعظم التربيقي. تشير الأسهم الصفراء إلى الخلايا النموذجية المعبرة عن Sp7. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يتم تضمين جميع البيانات والصور الأصلية في هذه الورقة. يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.