تحديد مناعة اللقاح باستخدام الخلايا المتغصنة المشتقة من وحيدات الأبقار

يمثل التطعيم البيطري جانبا حاسما من جوانب تربية الحيوانات وصحتها ، حيث يساهم في تحسين الأمن الغذائي ورعاية الحيوان من خلال توفير الحماية ضد الأمراض التي تؤثر على قطاع الثروة الحيوانية على مستوى^{العالم 1}. ومن شأن وجود طريقة فعالة في المختبر لتقييم استمناع اللقاحات المرشحة المحتملة أن يساعد في تسريع عملية تطوير اللقاح وإنتاجه. لذلك ، من الضروري توسيع مجال المقايسات المناعية بمنهجيات مبتكرة تستند إلى الدراسات المختبرية ، لأن هذا من شأنه أن يساعد في الكشف عن تعقيد العمليات المناعية المتعلقة بالتحصين والعدوى الممرضة. وفي الوقت الراهن، تستخدم دراسات التمنيع والتحدي في الحيوانات في الجسم الحي ، التي تتطلب أخذ عينات دورية (مثل الدم والطحال)، لقياس استمناع اللقاحات المرشحة والمواد المساعدة. هذه المقايسات باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا ولها آثار أخلاقية ، لأنه في معظم الحالات ، يتم تنفيذ القتل الرحيم للحيوانات بنهاية التجارب.

كبديل للمقايسات في الجسم الحي ، تم استخدام خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) لتقييم الاستجابات المناعية التي يسببها اللقاح في المختبر². PBMCs هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا تتكون من 70٪ -90٪ خلايا ليمفاوية ، 10٪ -20٪ وحيدات ، وعدد محدود من الخلايا المتغصنة (DCs ، 1٪ -2٪) ³. تؤوي PBMCs خلايا مقدمة للمستضد (APCs) مثل الخلايا البائية ، والوحيدات ، و DCs ، والتي تقوم باستمرار بدوريات في الكائن الحي بحثا عن علامات العدوى أو تلف الأنسجة. تسهل الكيموكينات المفرزة محليا تجنيد وتفعيل ناقلات الجنود المدرعة في هذه المواقع عن طريق الارتباط بمستقبلات سطح الخلية. في حالة الوحيدات ، توجه chemokines مصيرها إما للتمايز إلى DCs أو الضامة⁴. بمجرد أن تواجه DCs مسببات الأمراض وتلتقطها ، فإنها تهاجر إلى الأعضاء اللمفاوية الثانوية ، حيث يمكنها تقديم مستضدات الببتيد الممرض المعالجة باستخدام البروتينات السطحية من الفئة الأولى أو الفئة الثانية من معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) إلى خلايا CD8 + T أو خلايا CD4 ⁺ T ، على التوالي ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية ^5,6.

إن الدور الرئيسي الذي تلعبه البلدان النامية في تنظيم استجابة مناعية وقائية ضد مسببات الأمراض المختلفة يجعلها هدفا بحثيا مثيرا للاهتمام لفهم آليات المناعة داخل الخلايا ، خاصة عند تصميم اللقاحات والمواد المساعدة ضد العوامل المعدية⁷. نظرا لأن جزء DCs الذي يمكن الحصول عليه من PBMCs صغير نوعا ما (1٪ -2٪) ، فقد تم استخدام الخلايا الوحيدة بدلا من ذلك لتوليد DCs في المختبر⁸. تم تطوير هذه الخلايا الأحادية المشتقة من الخلايا الأحادية (MoDCs) في البداية كاستراتيجية علاج محتملة في العلاج المناعي للسرطان⁹. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام MoDCs لأبحاث اللقاحات¹⁰،11،12 ^، والوحيدات الكلاسيكية هي النوع الفرعي السائد (89٪) لإنتاج MoDC ¹³. تم تحقيق إنتاج MoDCs في المختبر سابقا من خلال إضافة عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) المعطى بالاشتراك مع السيتوكينات الأخرى مثل إنترلوكين -4 (IL-4) ، عامل نخر الورم α (TNF-α) ، أو IL-13¹⁴،^15،16.

يعتمد نجاح مقايسة MoDC في المختبر على قدرة MoDCs الناضجة المحفزة بالمستضد على تعديل مدى ونوع الاستجابة المناعية الخاصة بنوع المستضد المكتشف¹⁷. يحدد نوع العامل الممرض الذي تتعرف عليه وتقدمه MoDCs تمايز الخلايا المساعدة CD4 ⁺ T (Th) إلى خلايا مستجيبة Th1 أو Th2 أو Th17 وتتميز بملف تعريف السيتوكين الإفرازي الخاص بمسببات الأمراض. يتم استنباط استجابة Th1 ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا وتؤدي إلى إفراز إنترفيرون جاما (IFN-γ) وعامل نخر الورم بيتا (TNF-β) ، الذي يعدل الحماية المعتمدة على البلعمة. يتم تشغيل استجابة Th2 ضد الكائنات الطفيلية وتتميز بإفراز IL-4 و IL-5 و IL-10 و IL-13 ، والذي يبدأ الحماية الخلطية المستقلة عن البلعمة. يوفر Th17 حماية تعتمد على العدلات ضد الالتهابات البكتيرية والفطرية خارج الخلية بوساطة إفراز IL-17 و IL-17F و IL-6 و IL-22 و TNF-α¹⁸،¹⁹،^20،21. بناء على الدراسات السابقة ، لوحظ أنه لا تقع جميع مسببات الأمراض ضمن ملف السيتوكين المتوقع. على سبيل المثال ، تحفز MoDCs الجلدية ، استجابة للعدوى الطفيلية الليشمانيا ، إفراز IFN-γ من الخلايا التائية CD4 + وخلايا CD8 ⁺ T ، مما يؤدي إلى استجابة Th1 وقائية للالتهابات²².

وقد تبين أيضا أنه في الدجاج MoDCs المحضرة بسكريد السالمونيلا الشحمي (LPS) ، يمكن أن تحفز استجابة متغيرة ضد السالمونيلا التيفية عن طريق تنشيط كل من استجابات Th1 و Th2 ، في حين أن السالمونيلا جاليناروم تحفز استجابة Th2 وحدها ، مما قد يفسر المقاومة العالية للأخيرة تجاه إزالة MoDC²³. كما تم الإبلاغ عن تنشيط MoDCs ضد البروسيلا كانيس (B. canis) في كل من الكلاب و MoDCs البشرية ، مما يعني أن هذا يمكن أن يمثل آلية عدوى حيوانية المنشأ²⁴. تحفز MoDCs البشرية المحضرة ب B. canis استجابة Th1 قوية تمنح مقاومة للعدوى الشديدة ، في حين أن MoDCs الكلاب تحفز استجابة Th17 المهيمنة مع استجابة Th1 منخفضة ، مما يؤدي لاحقا إلى إنشاء عدوى مزمنة²⁵. تظهر MoDCs البقرية تقاربا معززا لفيروس مرض الحمى القلاعية (FMDV) المترافق مع الغلوبولين المناعي G (IgG) مقارنة ب FMDV غير المقترن وحده ، حيث تشكل MoDCs معقدا للأجسام المضادة الفيروسية استجابة ل¹⁰ السابقة. تظهر هذه الدراسات مجتمعة كيف تم استخدام MoDCs لتحليل تعقيد الاستجابات المناعية أثناء عدوى مسببات الأمراض. يمكن تقييم الاستجابات المناعية التكيفية عن طريق القياس الكمي لعلامات محددة مرتبطة بتكاثر الخلايا الليمفاوية. يعتبر Ki-67 ، وهو بروتين داخل الخلايا يتم اكتشافه فقط في الخلايا المنقسمة ، علامة موثوقة لدراسات الانتشار²⁶ ، وبالمثل ، فإن CD25 المعبر عنه على سطح الخلايا التائية خلال المرحلة المتأخرة من التنشيط يتوافق مع انتشار الخلايا الليمفاوية^27,28.

توضح هذه الدراسة طريقة موحدة لتوليد MoDCs في الماشية في المختبر متبوعة بتطبيقها في اختبار مناعي في المختبر يستخدم لاختبار مناعة اللقاحات. تم استخدام لقاح داء الكلب المتاح تجاريا (RV) للتحقق من فعالية هذا الفحص. تم قياس تنشيط الخلايا اللمفاوية التائية وانتشارها عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) من خلال تحليل علامات تنشيط الخلايا الراسخة مثل Ki-67 و CD25 وإفراز IFN-γ²⁸،²⁹،^30،31. لا يتم إجراء أي تجارب تجريبية على الحيوانات أو البشر أثناء فحص MoDC.

يتم جمع الدم من قبل خدمة بيطرية معتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للوكالة النمساوية للصحة وسلامة الأغذية (AGES) وبما يتوافق مع معايير رعاية الحيوان المقبولة³². حصلت الدراسة على موافقة أخلاقية من وزارة الزراعة النمساوية. يوضح الشكل 1 التصميم التجريبي لتوليد MoDCs وتطبيقه اللاحق.

1. إنتاج MoDCs الساذجة

ملاحظة: تم الحصول على عينات دم كاملة من عجل واحد خال من مسببات الأمراض عن طريق ثقب الوريد الوداجي مع vacutainers الهيبارين (تم استخدام ثمانية أنابيب دم سعة 9 مل لهذه الدراسة). نقل الدم في صندوق ثلج. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 2-4 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا ، أو قم بمعالجتها على الفور. حافظ على دوران الدم لتجنب تخثر الدم. تعقيم vacutainers مع 70 ٪ من الإيثانول. أجريت جميع التجارب التالية باستخدام عينة بيولوجية واحدة وست نسخ مكررة تقنية.

1. الطرد المركزي المتدرج الكثافة لعزل PBMCs من الدم الهيبارين
   1. امزج الدم جيدا عن طريق قلبه 10 أضعاف.
   2. باستخدام ماصة 10 مل ، انقل 20 مل من دم الهيبارين إلى أنبوب معقم سعة 50 مل ، وقم بتخفيفه ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   3. ماصة 15 مل من وسط عزل الخلايا الليمفاوية إلى أنبوب معقم سعة 50 مل.
      ملاحظة: اسمح للوسط العازل للخلايا الليمفاوية بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الماصة.
   4. قم بإمالة الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على وسط عزل الخلايا الليمفاوية إلى وضع 45 درجة. ضع طرف ماصة سعة 25 مل بشكل عمودي ، وقم بطبقة 30 مل من الدم PBS بعناية فوق وسط عزل الخلايا الليمفاوية ، دون خلط الاثنين. ببطء شديد ، أعد أنبوب 50 مل إلى الوضع الرأسي.
   5. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 35 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع أقصى تسارع وبدون فرامل (تم إيقاف تشغيل وظيفة التباطؤ).
   6. استخدم ماصة باستور لجمع طبقة PBMC (الطبقة البيضاء الرقيقة مباشرة بعد الطبقة الأولى من البلازما) ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
      ملاحظة: يفصل الطرد المركزي المتدرج الكثافة الدم الكامل إلى طبقات مختلفة. نتيجة لذلك ، تستقر كريات الدم الحمراء في القاع كحبيبات ، وتستقر الخلايا أحادية النواة (PBMCs) في طبقة الواجهة ، وتشكل البلازما الطبقة العليا. تم العثور على الخلايا المحببة بين الحبيبات وطبقة PBMC.
   7. اغسل PBMCs 2x المحصودة بإضافة PBS حتى حجم 40 مل والخلط جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ثم ، أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق مع أقصى تسارع وأقصى تباطؤ.
   8. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، وأعد تعليق الحبيبات في 15 مل من 1x مخزن مؤقت من كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم (ACK) ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: لا تحتضن لأكثر من 15 دقيقة. يستخدم المخزن المؤقت ACK المتاح تجاريا لضمان تحلل خلايا الدم الحمراء المتبقية (RBCs) الموجودة في جزء PBMC.
   9. أضف PBS حتى حجم 40 مل ، ثم جهاز طرد مركزي عند 500 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق مع أقصى تسارع وتباطؤ.
   10. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، وكرر الخطوة 1.1.9.
   11. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسط الاستزراع الكامل (في درجة حرارة الغرفة).
       ملاحظة: يتكون وسط الاستزراع الكامل من وسط زراعة الخلايا RPMI 1640 المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
2. الفصل المغناطيسي لخلايا CD14 ^+/− من مجتمع PBMC باستخدام حبات مغناطيسية مترافقة CD14
   1. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا مقياس الدم النظيف باستخدام 10 ميكرولتر من تعليق الخلية الممزوج ب 10 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق (0.4٪).
      ملاحظة: صبغة تريبان الزرقاء هي مادة كيميائية سامة ومسرطنة محتملة. يجب التعامل معها أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) لتجنب الاتصال ، ويجب التخلص من النفايات في حاوية نفايات سامة متخصصة محكمة الإغلاق. ستظهر الخلايا الميتة باللون الأزرق ، بينما ستظهر الخلايا الحية واضحة تحت المجهر.
   2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 500 × جم.
   3. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق الحبيبات في مخزن فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) باستخدام حجم 40 ميكرولتر لكل 1 × 10⁷ خلايا. تخلط جيدا باستخدام ماصة.
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت FACS من 2٪ FBS و 2 mM من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) المذاب في PBS.
   4. أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للميكروبيدات CD14 لكل 1 × 10⁷ خلايا ، واخلطها جيدا باستخدام ماصة.
   5. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 4-8 درجة مئوية للاختيار الإيجابي للوحيدات CD14 ⁺ البقري³³. دوامة كل 15 دقيقة خلال فترة الحضانة.
   6. الخطوة الاختيارية (لتحليل قياس التدفق الخلوي): أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد للتلطيخ CD14-FITC (فلوريسئين أيزوثيوسيانات) مع الحضانة اللاحقة لمدة 15 دقيقة عند 4-8 درجة مئوية. راجع تحليل قياس التدفق الخلوي في الخطوة 5 للحصول على التفاصيل.
   7. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 500 × جم.
   8. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل 1 × 10⁸ خلايا.
   9. أدخل عمود فصل الخلايا المغناطيسية المناعية في الفاصل (حامل العمود المغناطيسي) ، وضع أنبوب تجميع سعة 15 مل أسفل مخرج العمود لتجميع التدفق.
   10. اغسل العمود ب 1 مل من المخزن المؤقت FACS المنزوع الغاز. بعد الشطف ، استبدل الأنبوب المستخدم سعة 15 مل بأنبوب جديد.
   11. اسمح لتعليق الخلية (من الخطوة 1.2.8) بالمرور عبر العمود عن طريق سحب 1 × 10⁸ خلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت في المرة الواحدة.
       ملاحظة: انتبه إلى عدم توليد فقاعات هواء أثناء خلط الخلايا قبل السماح لها بالمرور عبر العمود.
   12. اشطف العمود 3 مرات ب 3 مل من المخزن المؤقت FACS المنزوع الغازات في كل مرة.
   13. اجمع التدفق ، وقم بتسمية هذا الجزء الأول على أنه جزء الخلية CD14⁻ (PBMCs ناقص الخلايا الوحيدة CD14 ⁺ ) ؛ وهذا ما يسمى أيضا جزء الخلايا الليمفاوية الساذجة.
       ملاحظة: يتم الاحتفاظ بخلايا CD14⁻ في وسط استزراع كامل حتى يتم إنتاج MoDCs النبضية للمستضد.
   14. قم بإزالة العمود من الفاصل.
   15. ضع أنبوبا معقما جديدا سعة 15 مل أسفل العمود لجمع النفايات السائلة.
   16. ماصة 5 مل من المخزن المؤقت FACS في العمود ، وادفعه على الفور باستخدام مكبس.
   17. اجمع التدفق ، وقم بتسمية هذا الجزء الثاني المستحضر على أنه جزء خلية CD14 ⁺ ؛ وهذا ما يسمى أيضا جزء الوحيدات الساذج.
   18. أضف وسط استزراع كامل إلى الخلايا الوحيدة CD14 ⁺ المحصودة لتحقيق 1 × 10⁶ خلايا / مل.
       ملاحظة: عد الخلايا الحية في جزء خلية CD14 ⁺ المستخلصة لتقدير حجم وسط الاستزراع الكامل المطلوب لتحقيق عدد الخلايا المطلوب.
   19. خذ صفيحة معقمة من 24 بئرا ، وأضف 1 مل من معلق الخلية (1 × 10⁶ خلايا / مل) إلى كل بئر.
3. تمايز الخلايا الوحيدة الساذجة CD14 + إلى MoDCs ساذجة بإضافة 3٪ وزن / وزن كوكتيل سيتوكين (GM-CSF ⁺ IL-4) بإجمالي 5 أيام من الحضانة
   1. استكمل كل بئر يحتوي على حيدات CD14 ⁺ ب 40 ميكرولتر (3٪ وزن / حجم) من كوكتيل السيتوكين المقدم في المجموعة.
   2. احتضان اللوحة في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO₂ وعند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
   3. في اليوم الثاني ، قم بنقل نصف محتوى كل بئر (500 ميكرولتر) باستخدام ماصة إلى أنابيب فردية سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق.
   4. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل الطازج.
   5. انقل 500 ميكرولتر من معلق الخلية هذا من الخطوة 1.3.4 مرة أخرى إلى كل بئر معين بحيث يكون الحجم النهائي 1 مل.
   6. إثراء كل بئر مع 20 ميكرولتر من كوكتيل السيتوكين.
   7. احتضان الثقافة لمدة 72 ساعة في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO₂ وعند 37 درجة مئوية.
   8. بعد الحضانة في اليوم 5 ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة.
      ملاحظة: سيحتوي كل بئر على 1 مل من تعليق الخلية من MoDCs الساذجة. سيكون عدد MoDCs نسبة مئوية (~ 20٪) من الخلايا الوحيدة الأصلية المطلية (1 × 10⁶ / مل).

2. فحص النشاط الداخلي MoDC

ملاحظة: يقيس فحص امتصاص المستضد أو مقايسة النشاط الداخلي قدرة MoDCs الساذجة على استيعاب المواد الغريبة. قم بإجراء الفحص باستخدام MoDCs الساذجة المستزرعة ب 3٪ وزن / وزن كوكتيل السيتوكين ومع 5 أيام من الحضانة ، كما هو موضح سابقا³⁴.

1. حصاد تعليق خلية MoDC الساذج من لوحة 24 بئرا ، ونقله إلى أنبوب 15 مل ؛ أيضا جمع أي خلايا المتبقية عن طريق شطف الآبار مع برنامج تلفزيوني.
2. جهاز طرد مركزي لمدة 500 × غرام لمدة 7 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط الاستزراع المكمل ب 1٪ FBS.
3. عد خلايا MoDC الحية لتقدير حجم الوسط المطلوب للوصول إلى عدد الخلايا المطلوب (2 × 10⁵ خلايا / مل).
4. استزراع MoDCs الساذجة في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل في صفيحة 24 بئرا مع تركيز خلية نهائي يبلغ 2 × 10⁵ خلايا / مل.
5. استكمل كل بئر ب 1 ملغ / مل ديكستران مقترن FITC (مسبار الفلورسنت المستخدم كمقتفي للخلاء).
   ملاحظة: يعمل FITC-dextran كمسبار فلوري ويستخدم كمقتفي للخلايا.
6. غطي الطبق واحتضنه في الظلام عند 5٪ CO₂ و 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
   ملاحظة: للتحكم في الخلفية ، احتضان خلايا MoDC الإضافية (2 × 10⁵ خلايا / مل) مع 1 مجم / مل FITC-dextran على الجليد ، لأن هذا النوع من الحضانة يمنع دخول جزيء التتبع (FITC-dextran) إلى الخلايا.
7. بعد الحضانة ، قم على الفور بنقل اللوحة المكونة من 24 بئرا على الجليد لوقف التداخل الخلوي ل FITC-dextran.
8. اغسل الخلايا بمحلول FACS بارد مثلج.
9. الحصاد والطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
10. تحليل شدة مضان FITC-dextran داخل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. راجع تحليل قياس التدفق الخلوي في الخطوة 5.2 للحصول على التفاصيل.

3. توليد MoDCs النبضية بالمستضد

ملاحظة: يمكن للقاح متاح تجاريا ومعتمد سريريا ضد فيروس داء الكلب (RV) أن يحفز تمايز MoDCs الساذجة إلى MoDCs الناضجة التي تقدم المستضدات. استخدم 0.1٪ (~ 1 ميكرولتر) من جرعة تطعيم RV واحدة لتوليد MoDCs النبضية بالمستضد. علاوة على ذلك ، يفضل إنتاج MoDCs نبضية RV في نفس لوحة الاستزراع المستخدمة (في الخطوة 1.3.8) لتوليد MoDCs ساذجة لأن نقل MoDCs الساذجة إلى لوحة جديدة من 24 بئرا سيؤثر سلبا عليها.

1. من الخطوة 1.3.8) أضف 1 ميكرولتر / مل من معلق RV إلى 1 مل من ثقافة MoDC الساذجة في لوحة 24 بئرا ، واحتضانها لمدة 48 ساعة عند 5٪ CO₂ و 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: يتم استخدام MoDCs الساذجة المزروعة بدون تحفيز RV كعنصر تحكم في الخلفية (وكتحفيز غير محدد للثقافة المشتركة مع الخلايا الليمفاوية في الخطوات التالية).
2. بعد الحضانة ، في اليوم 7 ، احتفظ باللوحة المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على MoDCs النبضية للمستضد على الجليد لمدة 10 دقائق.
3. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني مثلج بارد لكل بئر. امزج كل بئر جيدا عن طريق السحب ، وانقل التعليق إلى أنبوب سعة 15 مل.
4. اغسل الآبار ب 2 مل من برنامج تلفزيوني بارد جليدي لجمع الخلايا المتبقية داخل كل بئر.
5. نقل المحتويات إلى الأنابيب الخاصة بها ، والطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 7 دقائق.
6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية (MoDCs النبضية للمستضد) في وسط استزراع كامل ، واضبط الحجم على تركيز الخلية النهائي من 1 × 10⁵ خلايا / مل.
   ملاحظة: عد الخلايا الحية لتقدير حجم الوسط المطلوب للوصول إلى عدد الخلايا المطلوب. استخدم MoDCs النبضية RV من اليوم 7 لنظام الاستزراع المشترك MoDC-lymphocyte.

4. الثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC

ملاحظة: يحدد نظام الاستزراع المشترك MoDC-lymphocyte في المختبر قدرة MoDCs على الخلايا الليمفاوية الأولية الخاصة بالمستضد. تشمل مجموعات العلاج المختلفة للخلايا بعد 16 يوما من الثقافة المشتركة محددة وغير محددة ومراقبة. يتم تعريف المجموعة المحددة على أنها الخلايا الليمفاوية المستزرعة بشكل مشترك مع MoDCs النبضية RV. يتم تعريف المجموعة غير المحددة على أنها الخلايا الليمفاوية المستزرعة بشكل مشترك مع MoDCs غير النبضية للمستضد. ويتم تعريف المجموعة الضابطة على أنها الخلايا الليمفاوية المستزرعة بدون MoDCs.

1. أضف وسط استزراع كامل إلى جزء الخلايا الليمفاوية الساذجة (خلايا CD14⁻ ) للوصول إلى تركيز خلية يبلغ 2 × 10⁶ خلايا / مل.
   ملاحظة: عد الخلايا الحية في زراعة الخلايا CD14⁻ التي تم الاحتفاظ بها في وسط استزراع كامل في صفيحة 24 بئرا منذ جمعها لتقدير حجم الوسط المطلوب للوصول إلى عدد الخلايا المطلوب.
2. في اليوم السابع ، خذ صفيحة معقمة من 24 بئرا ، وقم بزرع الآبار ب 1 مل من معلق الخلايا الليمفاوية الساذجة (2 × 10⁶ خلية / مل) بالإضافة إلى 1 مل من معلق MoDC النبضي بالمستضد أو غير النبضي بالمستضد (1 × 10⁵ خلية / مل).
   ملاحظة: سيكون الحجم الإجمالي في كل بئر 2 مل بنسبة 1:20 MoDCs إلى الخلايا الليمفاوية لكل بئر.
3. احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
4. إثراء الثقافة وإعادة التحفيز باستخدام MoDCs النبضية للمستضد
   1. بعد حضانة الاستزراع المشترك للخلايا اللمفاوية MoDC النبضي بالمستضد ، في اليوم 9 ، استكمل كل بئر ب 20 نانوغرام / مل من IL-2 المؤتلف ، واستمر في الحضانة لمدة 120 ساعة أخرى (5 أيام حضانة).
   2. في اليوم 14 ، انقل 1 مل من الاستزراع المشترك إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 7 دقائق.
   3. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من MoDCs النبضية أو غير النبضية (1 × 10⁵ خلية / مل). امزج برفق عن طريق السحب ، وانقل معلقات الخلايا مرة أخرى إلى الآبار المخصصة لها.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، يبلغ الحجم الإجمالي في كل بئر 2 مل.
   4. استمر في الحضانة عند 5٪ CO₂ و 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد الحضانة في اليوم 16 ، تكون الثقافة المشتركة جاهزة للتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي و qPCR و ELISA.
      ملاحظة: لكل 2 مل في كل بئر من الثقافة المشتركة MoDC-lymphoyte ، يتم تلطيخ 1 مل من الخلايا المعلقة لقياس التدفق الخلوي ، ويتم استخدام 1 مل لاستخراج الحمض النووي الريبي ، ويتم استخدام المواد الطافية من كليهما ل ELISA.

5. تحليل التدفق الخلوي

ملاحظة: قم بتلطيخ الخلايا بعلامات مناسبة / mAb قبل تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي. ارجع إلى جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الكواشف (تلطيخ mAb وضوابط النمط المتماثل) ، والمجموعة ، والأداة ، والبرامج المستخدمة في تحليل قياس التدفق الخلوي.

1. بروتوكول تلطيخ مقياس التدفق الخلوي
   ملاحظة: قم بإجراء تلطيخ سطح الخلية ل PBMCs والخلايا الليمفاوية الساذجة والوحيدات باستخدام مضاد CD14 mAb (الخطوة 1.2.6). لتلطيخ سطح الخلية ل MoDCs الساذجة ، استخدم mAb الخاص ب CD86 ، ومضاد CD40 ، ومضاد MHC II. لتلطيخ سطح الخلية للخلايا من الثقافات المشتركة لليوم 16 ، استخدم مضادات CD4 و anti-CD8 و anti-CD25 mAbs ؛ للتلطيخ داخل الخلايا ، استخدم مضاد Ki-67 mAb. علاوة على ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا إما بالتحكم في النمط المتماثل السلبي mAb أو بدون mAb (FMO: الفلورسنت ناقص واحد). الفرق الرئيسي عند تلطيخ العلامات السطحية وداخل الخلايا هو أنه بالنسبة لعلامات سطح الخلية ، يجب أن تكون الخلايا ملطخة بسطح mAb محدد قبل تلطيخ الأحياء / الميتين (L / D) أو أي عمليات أخرى. ومع ذلك ، يتم إجراء تلطيخ داخل الخلايا بعد تلطيخ L / D ويتطلب التثبيت بالإضافة إلى خطوة النفاذية للسماح بالاختراق داخل الخلايا.
   1. نقل 1 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب معقم 1.5 مل باستخدام ماصة ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 500 × جم.
      ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، عند معالجة الخلايا من الثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC ، احفظ المادة الطافية لتحليل ELISA.
   2. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. اجمع الخلايا المتبقية باستخدام 1 مل من PBS ، وادمجها مع الحبيبات المعلقة.
   3. أضف 10 مل من PBS إلى أنبوب 15 مل الذي يحتوي على الخلايا ، واخلطه عن طريق السحب ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 850 × جم.
   4. تخلص من المادة الطافية، وكرر الخطوة 5.1.3.
   5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية بعناية مع التعليق المتبقي (حوالي 180 ميكرولتر) المتبقي بعد صب المادة الطافية.
   6. انقل تعليق الخلية إلى لوحة 96 بئرا ذات قاع V ، وأغلق الآبار لتجنب الانسكاب.
   7. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1400 × غرام لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بنفض الغبار عن اللوحة فوق حاوية نفايات لتفريغ آبار السائل ، واضغط على اللوحة على ورق ماص لضمان إزالة السائل الزائد.
   8. أضف 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتلوين السطح لكل بئر ، واخلطه برفق باستخدام ماصة ، متبوعا بالحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: لتحضير المزيج الرئيسي لتلطيخ السطح لبئر واحد، أضف 2.5 ميكرولتر من mAb السطحي إلى 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
   9. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل بئر ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1400 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، أفرغ آبار السائل عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص لإزالة السائل الزائد.
   10. أضف 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ L / D لكل بئر. تخلط جيدا باستخدام ماصة ، تليها الحضانة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
       ملاحظة: بالنسبة لبئر واحدة، قم بإذابة 0.25 ميكرولتر من صبغة L/D في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. تساعد صبغة L / D على التمييز بين الخلايا الحية والميتة.
   11. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. قم بتغطية الآبار بالغطاء ، وطرد مركزي اللوحة لمدة 1400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
   12. كرر الخطوة 5.1.11.
   13. أضف 50 ميكرولتر من محلول التثبيت لكل بئر (مرفق مع المجموعة) ، واخلطه مع ماصة قبل احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق.
   14. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية والغسيل (PW) المرفق مع المجموعة ، وقم بتغطية الآبار بالغطاء.
       ملاحظة: لتحضير 10 مل من 1x PW buffer ، قم بتخفيف 1 مل من المخزن المؤقت 10x perm في 10 مل من dH₂O.
   15. جهاز طرد مركزي على اللوحة عند 1400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
   16. أضف 200 ميكرولتر من 1x PW ، متبوعا بالطرد المركزي عند 1400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
   17. للتلطيخ داخل الخلايا ، أضف 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتلطيخ داخل الخلايا (Ki-67 mAb المضاد للإنسان) لكل بئر. تخلط جيدا ، واحتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية أو على الجليد في الظلام.
       ملاحظة: لتحضير مزيج رئيسي للتلطيخ داخل الخلايا لبئر واحد ، أضف 1 ميكرولتر من Ki-67 mAb إلى 24 ميكرولتر من 1x PW. يتم استخدام علامة تلطيخ داخل الخلايا فقط عند معالجة الخلايا من اليوم 16 الثقافة المشتركة. لا يتم التلوين داخل الخلايا أثناء معالجة PBMCs ، والخلايا الليمفاوية الساذجة ، والوحيدات ، و MoDCs الساذجة.
   18. بعد الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من 1x PW إلى كل بئر. تخلط مع ماصة ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1400 × غرام لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
   19. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، متبوعا بالطرد المركزي عند 1400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
   20. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، ونقل محتويات كل بئر لفصل أنابيب مقياس التدفق الخلوي المعقمة. استخدم 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل بئر لجمع الخلايا المتبقية. الخلايا جاهزة الآن لتحليل قياس التدفق الخلوي.
2. تشغيل العينة على مقياس التدفق الخلوي
   ملاحظة: تم تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي (باستخدام ليزر 488 نانومتر و 638 نانومتر و 405 نانومتر) وفقا لدليل الشركة المصنعة³⁵. راجع الدليل للحصول على التفاصيل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتخصيص البروتوكول.
   1. قم بإجراء إجراءات التنظيف الروتينية قبل وبعد قراءة العينات.
      ملاحظة: لا تخطي موضع أثناء تحميل الأنابيب في الجهاز.
      1. بالنسبة لدورة التنظيف ، استخدم ما مجموعه أربعة أنابيب ، حيث يحتوي الأنبوب الأول على كاشف تنظيف التدفق والأنابيب الثلاثة المتبقية التي تحتوي على dH₂O ؛ سيكون لكل أنبوب 3 مل. أثناء عملية التنظيف ، احصل على بيانات بمعدل تدفق متوسط لمدة 1 دقيقة تقريبا عن طريق التقاط 100000 حدث لكل أنبوب أقل من 330 فولت للتشتت الأمامي (FSC) مقابل 265 فولت للتشتت الجانبي (SSC).
         ملاحظة: لا ينبغي الإبلاغ عن أي حطام أو أحداث خلوية أثناء التنظيف ؛ إذا حدث هذا ، فقم بإجراء خطوة التنظيف مرة أخرى. لتشغيل العينات ، تأكد من أن جميع العينات في تعليق متجانس قبل الحصول على البيانات لأن هذا يضمن قراءة دقيقة.
   2. للاتصال وتشغيل مقياس الخلايا ، انقر فوق زر التطبيق الموجود في الزاوية اليسرى من شريط العنوان. من القائمة المنسدلة للتطبيق ، حدد الخيار قياس الخلايا، وانقر على الخيار تشغيل.
      ملاحظة: من القائمة المنسدلة للتطبيق ، يتيح الخيار Open للمستخدمين تصفح المقايسات المبرمجة مسبقا ، بينما يسمح الخيار New Protocol للمستخدمين بإنشاء بروتوكولات جديدة.
   3. قم في البداية بتحميل عينة التحكم السلبية في حامل الأنبوب المتعدد. حدد بروتوكول جديد ، ولاحظ قائمة العمل على الجانب الأيسر من مساحة العمل / الشاشة.
   4. في قائمة العمل ، حدد موضع العينة في حامل الأنبوب المتعدد ، وقم بإعطاء اسم للعينة والبروتوكول لتحديد الهوية.
   5. من لوحة الأجهزة الموجودة على الجانب الأيسر من مساحة العمل ، اضبط وحدد معلمات متعددة مثل أجهزة الكشف (FSC و SSC و 10 نطاقات مضان) ، والفولتية (V ) ومكاسب المضاعفات الضوئية ، وعرض ارتفاع المنطقة (AHW) للإشارة.
      ملاحظة: تم اختيار الإعدادات التالية لأجهزة الكشف بناء على التجربة والأداة المستخدمة: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A ، V: 350 ، G: 10 ؛ FL1 (CD8 / FITC ديكستران) - AHW: A ، V: 400 ، G: 1 ؛ FL2 (CD25 / PE) - AHW: A ، V: 500 ، G: 1 ؛ FL6 (CD4 / أليكسا فلور 647) - AHW: A ، V: 700 ، G: 1 ؛ FL7 (كي-67/أليكسا فلور 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L / D) - AHW: A ، V: 425 ، G: 1.
   6. من لوحة التحكم في اقتناء الأدوات الموجودة أسفل شريط العنوان ، اضبط خيارات معدل التدفق (متوسط) والوقت (5 دقائق) والأحداث (انظر الخطوة 5.2.8) المطلوب اكتشافها. انقر فوق الخيار الحصول على مفرد للسماح للأداة بسحب / تشغيل العينة وإظهار المعاينة في الوقت الفعلي للأحداث المكتشفة.
   7. من المعاينة في الوقت الفعلي ، اضبط عتبة التألق (الجهد والكسب) وحجم الخلية لرسم البوابات في النهاية حول مجموعة الخلايا المطلوبة مع استبعاد أي حطام خلوي.
      ملاحظة: يساعد FSC على تمييز الخلايا على أساس الحجم ، مما يسمح للمستخدمين بالتمييز بين خلايا الجهاز المناعي ، مثل الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية ؛ الوحيدات أكبر وتظهر كثافة FSC أعلى مقارنة بالخلايا الليمفاوية.
   8. احصل على ما يقرب من 5000 MoDC حي ، و 50000 خلية ليمفاوية حية ، و 50000 حدث وحيد حي.
   9. بمجرد ضبط جميع المعلمات بالإشارة إلى عينة التحكم السلبية ، انقر فوق إيقاف ، واحفظ البروتوكول.
   10. الآن قم بتحميل جميع العينات على اللودر متعدد الأنابيب. حدد كل عينة في قائمة العمل، وقم بتطبيق المعلمات المعدلة بالرجوع إلى عنصر التحكم السلبي على جميع العينات داخل التجربة. انقر فوق الخيار اكتساب للسماح بتشغيل جميع العينات في التجربة على التوالي.
   11. بمجرد الحصول على البيانات من جميع العينات ، احفظها وتحويلها إلى بيانات قابلة للقراءة باستخدام برنامج تحليل بيانات مناسب يسمح بإنشاء رسوم بيانية متسلسلة ثنائية المعلمات وأحادية المعلمات.

6. تحليل تعبير الحمض النووي الريبي رسول (mRNA)

1. استخراج الحمض النووي الريبي
   ملاحظة: استخرج الحمض النووي الريبي الكلي من المزرعة المشتركة MoDC-lymphocyte النبضية للمستضد (محددة) ، والاستزراع المشترك MoDC-lymphocyte غير النبضي للمستضد (غير محدد) ، وثقافة الخلايا الليمفاوية بدون MoDCs (التحكم) ، ومن الخلايا الليمفاوية الساذجة (خلايا CD14⁻ المعزولة قبل الزراعة المشتركة). لاستخراج الحمض النووي الريبي ، قم بإعداد الإيثانول باستخدام الماء الخالي من RNase. ارجع إلى جدول المواد للحصول على تفاصيل حول مجموعة الاستخراج والكواشف.
   1. نقل 1 مل من تعليق الخلية من لوحة الاستزراع المشترك MoDC-lymphocyte (~ 1 × 10⁶ خلايا / مل) إلى أنبوب معقم معقم 1.5 مل باستخدام ماصة ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 500 × جم.
   2. احفظ الطافي ل ELISA. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من PBS ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. اجمع أي خلايا متبقية باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني.
   3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 500 × غرام.
      ملاحظة: يجب التعامل مع جميع العينات بدقة كخلايا حية حتى يتم إجراء تحلل الخلية باستخدام المخزن المؤقت للتحلل الموجود في المجموعة. يطلق موت الخلايا RNases التي تحلل بسرعة قوالب الحمض النووي الريبي اللازمة للقياس الكمي في اتجاه مجرى النهر. يقوم المخزن المؤقت RLT بتحليل الخلايا في محلول يثبط RNases.
   4. أضف 350 ميكرولتر من محلول التحلل إلى كل بئر فارغ ، واحتضنها لمدة 2-3 دقائق لتحلل الخلايا الملتصقة التي لم يتم حصادها في الخطوات السابقة.
   5. بمجرد اكتمال الطرد المركزي في الخطوة 6.1.3 ، تخلص من المادة الطافية ، وادمج حبيبات الخلية مع 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المضاف في الخطوة 6.1.4.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، من الممكن تخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية أو متابعة استخراج الحمض النووي الريبي (الخطوات التالية).
   6. ماصة 350 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ إلى المحللة في الخطوة 6.1.5. الحجم النهائي لكل عينة هو 700 ميكرولتر.
   7. أدخل عمود الاستخراج داخل أنبوب تجميع سعة 2 مل (مرفق مع المجموعة).
   8. نقل 700 ميكرولتر من العينة لكل عمود استخراج ، وأجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 15 ثانية. تخلص من التدفق في أنبوب التجميع ، وضعه مرة أخرى في عمود الدوران.
   9. في عمود الاستخراج ، أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت الصارم للغسيل (متوفر في المجموعة) ، وأجهزة الطرد المركزي بأكثر من 10000 × جم لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق.
   10. أضف 80 ميكرولتر من مزيج حضانة DNase I لكل عينة على غشاء عمود الاستخراج ، واتركه يتماسك لمدة 15 دقيقة عند 20-30 درجة مئوية.
       ملاحظة: لتحضير مزيج حضانة DNase I لكل عينة ، أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون DNase I إلى 70 ميكرولتر من المخزن المؤقت DNase لحجم نهائي يبلغ 80 ميكرولتر. تخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات ، متبوعا بدوران قصير في جهاز الطرد المركزي.
   11. اغسل عمود الاستخراج ب 350 ميكرولتر من محلول الغسيل الصارم ، متبوعا بالطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 15 دقيقة. تخلص من التدفق في أنبوب التجميع بعد الطرد المركزي.
   12. اغسل عمود الاستخراج 2x ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المعتدل في كل مرة وبالطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 15 ثانية ومرة ثانية لمدة دقيقتين. تخلص من التدفق بعد كل طرد مركزي.
   13. أجهزة الطرد المركزي العمود بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة لتجفيف الغشاء ، وتجاهل أنبوب التجميع.
   14. ضع عمود الاستخراج في أنبوب تجميع جديد سعة 1.5 مل.
   15. ماصة 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase على غشاء العمود ، واحتضانها لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
       ملاحظة: بالنسبة لتركيزات الحمض النووي الريبي التي تقل عن 100 نانوغرام ، قم بتقليل حجم الشطف إلى 30 ميكرولتر ، وأعد إزالة غشاء عمود الاستخراج باستخدام المنتج من الشطف الأول لتركيز المنتج النهائي.
   16. أجهزة الطرد المركزي في 10000 × غرام لمدة 1 دقيقة لاستئصال الحمض النووي الريبي.
   17. قياس تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق الكشف عن الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام 0.5-2 ميكرولتر من العينة. اضبط تركيز الحمض النووي الريبي النهائي على 0.1-1 ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام الماء الخالي من RNase.
   18. قم بتخزين حصص الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
2. تخليق الحمض النووي التكميلي
   1. توليف الحمض النووي التكميلي (cDNA) من قالب الحمض النووي الريبي المستخرج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة المرفق مع المجموعة (راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل).
      ملاحظة: يرد ملخص للكواشف والأحجام المستخدمة في الجدول 1 والجدول 2. ويرد بروتوكول كامل بالتفصيل في الملف التكميلي 1.
3. تفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الحقيقي
   1. بالنسبة إلى qPCR ، قم بتشغيل عينات cDNA في ثلاث نسخ. تحديد مستويات نسخ mRNA البقري ل Ki-67 و IFN-γ باستخدام مجموعات أولية محددة في إشارة إلى جين GAPDH ، كما هو موضح في الجدول 3.
      ملاحظة: تم تفصيل بروتوكول كامل في الملف التكميلي 1.

7. مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم

1. معالجة طافات الاستزراع المجمعة الغنية بالبروتينات الإفرازية لتحديد كمية IFN-γ من خلال ELISA.
   ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على تفاصيل حول استخدام المجموعة. ويرد بروتوكول كامل بالتفصيل في الملف التكميلي 1.

8. التحليل الإحصائي

1. تحليل البيانات ، وجعل الرسوم التوضيحية الرسومية للتصميم التجريبي باستخدام البرامج التجارية. استخدم اختبارا غير معلمي غير مزاوج للتحليل المقارن. ضع في اعتبارك أن قيم P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

تصف هذه المنهجية الجيل المختبري من MoDCs الماشية لتقييم مستضدات اللقاح المرشحة قبل إجراء الدراسات في الجسم الحي. يوضح الشكل 1 المخطط التجريبي لتوليد MoDC البقري وتطبيق MoDCs للفحص في المختبر. باستخدام تقنية فرز الخلايا القائمة على المغناطيسية ، كان من الممكن جمع ما يقرب من 26 مليون خلية عضلية CD14 + من PBMCs المحصودة ، والتي تم عزلها سابقا من 50 مل من دم الماشية. كان جزء الخلية المستخلصة الخالي من الخلايا الوحيدة CD14 + غنيا بالخلايا الليمفاوية واستخدم كمصدر للخلايا التائية CD4 + و CD8 + الساذجة (جزء خلية الخلايا الليمفاوية CD14−).

يتكون جزء الخلية الوحيدة الساذجة من 98٪ خلايا وحيدة CD14 + ، كما لوحظ بعد تلطيخ خلايا CD14 وقياس التدفق الخلوي (الشكل 2A ، B). الخلايا الوحيدة الساذجة المنقاة ، عند تعرضها للزراعة في وجود كوكتيل السيتوكين 3 ٪ (GM-CSF و IL-4) مع حضانة لاحقة لمدة 5 أيام ، متباينة في نمط ظاهري يشبه DC. من زراعة أولية ل 26 مليون خلية وحيدة CD14 + ، يمكن الحصول على ما مجموعه حوالي 12 مليون MoDCs بعد 5 أيام من الحضانة. كانت MoDCs الساذجة قادرة وظيفيا على امتصاص المستضد ، كما لوحظ باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي ل FITC-dextran (الشكل 3). علاوة على ذلك ، تم تمييز MoDCs الساذجة ظاهريا من خلال تقييم التعبير عن MHC من الفئة الثانية وعلامات سطح الخلية CD86 و CD40 المحفزة المشتركة ، والتي تحققت من صحة النمط الظاهري الشبيه بالتيار المستمر (الشكل 4).

تم تحقيق التحفيز النبضي للمستضد من MoDCs الساذجة عن طريق استزراعهم في وجود RV المعطل لمدة 2 أيام. تم تحقيق تنشيط الخلايا الليمفاوية الساذجة (جزء الخلية CD14− ) عن طريق الاستزراع المشترك للخلايا الليمفاوية MoDC النبضي بالمستضد مع المكملات اللاحقة ل IL-2. خلال الاستزراع المشترك MoDC-lymphoyte في اليوم 9 ، لوحظ تغير مورفولوجي في MoDCs النبضية RV ، حيث أظهروا امتدادا للتغصنات ، وهو سمة من سمات نضوج MoDC (الشكل 5). في اليوم 14 ، تم تعزيز تنشيط الخلايا الليمفاوية من خلال إعادة تحفيز الثقافة المشتركة من خلال إضافة MoDCs النبضية RV المنتجة حديثا من نفس الحيوان.

بالمقارنة مع الثقافة المشتركة غير النبضية MoDC-lymphocyte ، تم توضيح زيادة كبيرة (p < 0.01) في تكاثر الخلايا الليمفاوية من خلال تنظيم علامات تنشيط Ki-67 و CD25 على كل من خلايا CD4 + و CD8 + T في اليوم 16 في الثقافة المشتركة للخلايا اللمفاوية MoDC النبضية (الشكل 6). أظهرت خلايا CD8 + T من الثقافات المشتركة الناضجة ل RV النبضية MoDC تنظيما أعلى بمقدار ثمانية أضعاف (p < 0.01) من Ki-67 عند مقارنتها بالمجموعة غير المحددة (الشكل 7A). أظهرت خلايا CD4 + T في نفس الثقافة المشتركة زيادة بمقدار سبعة أضعاف (p < 0.01) في Ki-67 مقارنة بالضوابط (الشكل 7B). يوضح هذا قدرة MoDCs المحضرة ب RV على تقديم مستضد RV بنجاح إلى الخلايا الليمفاوية الساذجة ثم تنشيطها لاحقا في حالة المختبر ، على غرار ما يحدث في حي. بالإضافة إلى تحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي ، خضعت الثقافات المشتركة أيضا ل qPCR و ELISA لتحديد تنشيط الخلايا الليمفاوية الخاصة ب RV باستخدام نسخ الحمض النووي الريبي (Ki-67 و IFN-γ) والإفراز خارج الخلية (IFN-γ) ، على التوالي (الشكل 8). يمكن أيضا استخدام طرق الكشف الإضافية هذه كاختبارات تأكيدية لمزيد من التحقق من صحة نتائج قياس التدفق الخلوي. أظهر تعبير الحمض النووي الريبي ل Ki-67 و IFN-γ الذي أظهرته qPCR ومستويات IFN-γ التي أظهرتها ELISA أنماطا مماثلة من الزيادة ، مما يشير إلى انتشار الخلايا الليمفاوية ، في الثقافة المشتركة الخاصة بالمستضد مقارنة بمجموعة العلاج غير المحددة. لذلك ، ارتبطت نتائج qPCR و ELISA بنتائج قياس التدفق الخلوي. أظهر qPCR زيادة بنسبة >30٪ في تعبير IFN-γ وزيادة بنسبة >5٪ في تعبير Ki-67 في جميع الثقافات المشتركة باستخدام GAPDH كمعاد (الشكل 8A ، B). تم قياس تركيز أعلى بكثير من IFN-γ المفرز (** p > 0.01) باستخدام ELISA باستخدام طاف الثقافة من الثقافة المشتركة MoDC-lymphocyte النبضية RV مقارنة بمجموعة العلاج غير المحددة (الشكل 8C).

الشكل 1: التصميم التجريبي للمقايسة المختبرية القائمة على MoDC البقري. (أ) حصاد وفرز الخلايا من وحيدات CD14 + و CD14− كسور الخلايا الليمفاوية من PBMCs البقري. تتم معالجة دم الماشية عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة لجمع PBMCs ، يليه فرز الخلايا المغناطيسية باستخدام أعمدة فصل الخلايا المغناطيسية المناعية والزراعة اللاحقة لجزء الخلية الوحيدة الساذجة CD14 + المحصودة في وسط RPMI 1640 المكمل . (ب) إنتاج MoDCs باستخدام 3٪ كوكتيل سيتوكين (GM-CSF + IL-4) مع 5 أيام من الحضانة والاستزراع المشترك MoDC-lymphoyte. في اليوم 0 ، يتم استزراع الوحيدات في وجود كوكتيل السيتوكين ويتم تحضينها لمدة 48 ساعة للحث على التمايز. في اليوم 2 ، يتم تنشيط الثقافة بنفس كوكتيل السيتوكين ، يليه الحضانة لمدة 72 ساعة ، مما يؤدي إلى إنتاج MoDCs الساذجة. في اليوم 5 ، يضاف مستضد اللقاح (لقاح داء الكلب) إلى مزرعة خلايا MoDC الساذجة ، تليها حضانة 48 ساعة. في اليوم 7 ، يتم إجراء الزراعة المشتركة ل MoDCs النبضية للمستضد مع الخلايا الليمفاوية الساذجة (جزء خلية CD14− ) ، تليها الحضانة. في اليوم 9 ، تتم إضافة IL-2 إلى الثقافة المشتركة. في اليوم 14 ، يتم إجراء إثراء / إعادة تحفيز الخلايا الليمفاوية المنشطة / المحضرة عن طريق إضافة MoDCs النبضية للمستضد ، تليها الحضانة لمدة 48 ساعة. أخيرا ، في اليوم 16 ، يتم حصاد الخلايا والخلايا الطافية للمزرعة لفحص انتشار الخلايا الليمفاوية. الاختصارات: MODCs = الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية. PBMCs = خلايا الدم أحادية النواة المحيطية ؛ GM-CSF = عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مورفولوجيا ونقاء الخلايا الوحيدة البقرية CD14 + التي يتم حصادها من PBMCs باستخدام الميكروبيدات المترافقة المضادة ل CD14. (أ) مورفولوجيا وحيدات الأبقار المحتضنة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في وسط استزراع كامل لإزالة الميكروبيدات ، مثبتة على شرائح مغلفة ببولي ليسين ، وملطخة بصبغة جيمسا المعدلة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (B) الرسم البياني لقياس التدفق الخلوي يظهر جزء خلية CD14 + المستنبط بمستوى نقاء 98.6٪ لوحظ باستخدام الجسم المضاد ل CD14 (أحمر) والجسم المضاد للتحكم في النمط المتماثل IgG1 للفأر المترافق FITC (أخضر). الاختصارات: PBMCs = خلايا الدم أحادية النواة المحيطية ؛ FITC cont = التحكم في أيزوثيوسيانات الفلوريسئين. تم تعديل هذا الرقم من Kangethe et al. ، 201811. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: النشاط الداخلي ل MoDCs البقري المتولد في المختبر. الرسم البياني لقياس التدفق الخلوي يظهر امتصاص جزيء التتبع (FITC-dextran) بحلول اليوم 5 MoDCs الساذجة. يتم تحضين MoDCs عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة مع جزيء التتبع (الأزرق) و MoDCs المحتضنة على الجليد مع جزيء التتبع (الرمادي) المستخدم كعنصر تحكم في الخلفية. الاختصارات: MODCs = الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية. FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات. تم تعديل هذا الرقم من Kangethe et al. ، 201811. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التنميط الظاهري لعلامات سطح الخلية الخاصة ب MoDC البقرية في المختبر. الرسوم البيانية لقياس التدفق الخلوي لاستراتيجيات البوابات (A) ل MoDCs ولليوم (B) 5 MoDCs الساذجة الملطخة بثلاثة أنواع مختلفة من DC (أزرق) ، بما في ذلك ما يلي: مضاد الأغنام MHC II mAb ، CD86 mAb المضاد للأبقار ، و CD40 mAb المضاد للأبقار. كل ذلك مقارنة مع ضوابط النمط المتماثل المقابلة لها (أحمر). الاختصارات: DC = الخلايا المتغصنة. MODCs = DCs المشتقة من الخلايا الواحدة البقرية ؛ MHC II = مجمع التوافق النسيجي الرئيسي II. تم تعديل هذا الرقم من Kangethe et al. ، 201811. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: علامات نضج MoDCs المنتجة في المختبر أثناء الاستزراع المشترك للخلايا الليمفاوية MoDC. مراقبة البنية الشجيرية الممتدة المميزة بواسطة MoDCs النبضية للمستضد مع الفحص المجهري المقلوب في اليوم 9 من الثقافة المشتركة MoDC-lymphoyte. (أ) MoDCs الناضجة داخل منطقة شديدة الالتقاء من الخلايا الليمفاوية المستزرعة المشتركة. (ب) يمكن تمييز MoDCs الناضجة بسهولة في منطقة بها عدد أقل من الخلايا الليمفاوية في الثقافة المشتركة. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. اختصار: MODCs = الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية. تم تعديل هذا الرقم من Kangethe et al. ، 201811. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: استراتيجية البوابات المتسلسلة المعتمدة للمخططات النقطية مقابل تعبير Ki-67 و CD25 بواسطة الخلايا الليمفاوية في الثقافة المشتركة MoDC-lymphocyte. (أ) استراتيجيةالبوابات الكاملة للخلايا التي يتم حصادها من اليوم 16 من الثقافة المشتركة للخلايا اللمفاوية MoDC. (B) تعبير Ki-67 من الخلايا الليمفاوية ذات البوابة CD4 + و (C) من الخلايا الليمفاوية CD8 + مقارنة بالتحكم في FMO (بدون mAb) والتحكم في النمط المتماثل IgG1-k mAb. تعبير CD25 على الخلايا الليمفاوية CD8 + و (E) CD4 + مقارنة بالتحكم في النمط المتماثل IgG1 mAb. تمثل مجموعة العلاج على وجه التحديد الخلايا الليمفاوية المستزرعة بشكل مشترك مع MoDCs النبضية RV ، في حين أن المجموعة الضابطة تمثل الخلايا الليمفاوية المزروعة في غياب MoDCs. الاختصارات: MODCs = الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية. FMO = الفلورسنت ناقص واحد ؛ RV = لقاح داء الكلب. تم تعديل هذا الرقم من Kangethe et al. ، 201811. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي لتعبير Ki-67 وCD25 بواسطة الخلايا الليمفاوية CD4+ وCD8+ بعد التحضير مع مولد الضد. تعبير Ki-67 و CD25 من الثقافة المشتركة لليوم 16. يتم تعريف مجموعة العلاج (محددة) على أنها الخلايا الليمفاوية المستزرعة مع MoDCs النبضية RV. تتوافق المجموعة غير المحددة مع الخلايا الليمفاوية المستزرعة مع MoDCs غير النبضية للمستضد ؛ تتوافق المجموعة الضابطة مع الخلايا الليمفاوية المستزرعة بدون MoDCs. تمثل الأشرطة الأفقية متوسط ستة مكررات تقنية. أ: التعبير داخل الخلايا لعلامة Ki-67 بواسطة الخلايا التائية CD8 و(ب) بواسطة الخلايا التائية CD4. ج: تعبير سطح الخلية لعلامة CD25 بواسطة الخلايا التائية CD8 و(د) بواسطة الخلايا التائية CD4 . الاختصارات: MODCs = الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية. RV = لقاح داء الكلب. تم تعديل هذا الرقم من Kangethe et al. ، 201811. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: تنشيط علامة Th1 (IFN-γ و Ki-67) بواسطة MoDCs المحضرة بمستضد فيروس داء الكلب ، كما تم اكتشافه من خلال qPCR و ELISA. البيانات مأخوذة من واحد مع ستة نسخ تقنية مكررة. تمثل الأشرطة الأفقية المتوسط. تظهر ثلاثة نسخ PCR كتغيرات في الطيات مقارنة بالخلايا الليمفاوية الساذجة بعد التطبيع باستخدام جين مرجعي GAPDH . (أ) تعبير IFN-γ ، (ب) تعبير Ki-67 . (ج) مقارنة إفراز IFN-γ في طاف المزرعة بين ثلاث مجموعات علاجية ، كما اكتشفها ELISA. يتم تعريف المجموعة المحددة على أنها الخلايا الليمفاوية المستزرعة مع MoDCs النبضية RV. تتوافق المجموعة غير المحددة مع الخلايا الليمفاوية المستزرعة مع MoDCs غير النبضية للمستضد ؛ تتوافق المجموعة الضابطة مع الخلايا الليمفاوية المستزرعة بدون MoDCs. الاختصارات: MODCs = الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية. RV = لقاح داء الكلب. تم تعديل هذا الرقم من Kangethe et al. ، 201811. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تكوين المزيج الرئيسي (مزيج الحمض النووي الريبي التمهيدي).

الجدول 2: مزيج تفاعل PCR 2x. الاختصارات: RT = النسخ العكسي. DTT = ديثيوثريتول.

الجدول 3: مجموعات التمهيدي المستخدمة للتضخيم50.

الجدول 4: المزيج الرئيسي qPCR

الجدول 5: سلسلة التخفيف القياسية IFN-γ

الملف التكميلي 1: بروتوكولات تخليق الحمض النووي التكميلي ، وتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S1: قدرة امتصاص المستضد MoDCs بتركيزات مختلفة من كوكتيل السيتوكين ومع 3 أيام أو 5 أيام من الثقافة. تم اختبار تركيزات مختلفة (5٪ وزن / وزن و 3٪ وزن / حجم) من كوكتيل السيتوكين الذي يحتوي على GM-CSF و IL-4 إما مع 3 أيام أو 5 أيام من المزرعة لتقييم أفضل مزيج لتوليد امتصاص مستضد عالي الأداء MoDCs (باستخدام جزيء التتبع FITC-dextran). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: تحضير CD4 و CD8 مع ذيفان الدفتيريا (DT) والنمط المصلي لفيروس اللسان الأزرق 4 (BTV). التعبير عن Ki-67 بواسطة خلايا CD8 بعد النبض ب (A) DT و (C) BTV والتعبير عن Ki-67 بواسطة خلايا CD4 بعد النبض ب (B) DT و (D) BVT في اليوم 16. تم إجراء مقارنات مع الثقافات النبضية مع DT و BVT (محددة) ، (C ، D) مع CD40L ، ومع معالجات فتيلة وتحكم غير محددة. تشير الأشرطة الأفقية إلى المتوسط. * p < 0.05 ، ** p < 0.01 وفقا لاختبار مان ويتني. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.