مقالة منهجية

مجهر رامان المتماسك: من الأجهزة إلى التطبيقات

DOI:

10.3791/64882

⸱

يناير 20, 2023

1Department of Chemistry, University of Washington

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقالات التي تمت مناقشتها: فئة

Clark، M.G.، Brasseale III، K.A.، Gonzalez، G.A.، Eakins، G.، Zhang، C. مقارنة مباشرة بين تشتت رامان المحفز الفائق الطيفي والفحص المجهري المتماسك المضاد لتشتت رامان المضاد لستوكيس للتصوير الكيميائي. مجلة التجارب المتصورة. (182) ، e63677 (2022)

De la Cadena ، A. et al. التصوير الكيميائي المتعدد على أساس النطاق العريض يحفز رامان < p class = "jove_content" > الفحص المجهري المتنثر. مجلة التجارب المتصورة. (185) ، e63709 (2022). فئة

Shi، L.، Wei، M.، Min، W. تصوير الأنسجة عالي الإرسال باستخدام أصباغ رامان. مجلة التجارب المتصورة. (182) ، e63547 (2022). < p class = "jove_content" > Espinoza ، R. ، Wong ، B. ، Fu ، D. في الوقت الحقيقي ، بلونين يحفز رامان تصوير تشتت دماغ الفأر لتشخيص الأنسجة. مجلة التجارب المتصورة. (180) ، e63484 (2022). فئة

Miao ، K. ، Lin ، L. E. ، Qian ، C. ، Wei ، L. تصوير فائق الدقة خال من الملصقات تم تمكينه عن طريق التصوير الاهتزازي للأنسجة المنتفخة والتحليل. مجلة التجارب المتصورة. (183) ، e63824 (2022). < ص الفئة = "jove_content" > يوان ، واي ، لو ، ف. غرفة مرنة لتصوير الخلايا الحية بفاصل زمني مع الفحص المجهري المشتت رامان المحفز. مجلة التجارب المتصورة. (186) ، e64449 (2022). < ص الفئة = "jove_content" >وو ، دبليو ، لي ، إكس ، تشو ، جي واي ، هو ، س. التصوير في الجسم الحي للأنسجة البيولوجية مع تألق ثنائي الفوتون المشترك وتحفيز الفحص المجهري المتناثر رامان. مجلة التجارب المتصورة. (178) ، e63411 (2021).

افتتاحية

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقد الماضي ، كان هناك اهتمام متزايد بتطبيق الفحص المجهري المتماسك رامان (CRM) على تصوير الخلايا والأنسجة1،2. CRM هي تقنية تصوير كيميائي قوية مع نوعين شائعين: الفحص المجهري المتماسك المضاد لتشتت رامان ستوكس (CARS) والفحص المجهري المحفز لتشتت رامان (SRS). تحظى SRS بشعبية متزايدة مقارنة ب CARS لأنها أقل تأثرا بتداخل الخلفية غير Raman ولها اعتماد خطي على التركيز3. يكتسب CRM معلومات الاهتزاز الجزيئي المشابهة للتحليل الطيفي Raman ، ولكنه يوفر سرعة اكتساب محسنة بشكل كبير4. يتم تحقيق ذلك عن طريق الإثارة الاهتزازية المتماسكة من خلال زوج من أشعة الليزر النبضية ذات كثافة الذروة العالية. نظرا لأن CRM يوفر رسم خرائط كيميائية محلية بدقة مكانية وزمانية عالية ، فقد وجد تطبيقات مهمة في تشخيص السرطان ، واستقلاب الدهون ، والتمثيل الغذائي للخلايا ، ونقل الأدوية ، وغيرها الكثير5،6،7،8. ومع ذلك ، فإن أحد الاختناقات الرئيسية التي تعيق الاعتماد الواسع النطاق لهذه التقنية هو تعقيدها التقني وافتقارها إلى بروتوكولات موحدة. على الرغم من توفر الليزر والمجاهر التجارية بالفعل ، إلا أن جميع الأنظمة المستخدمة حاليا في هذا المجال تقريبا تتضمن مستويات مختلفة من تخصيص الليزر والبصريات والمجاهر وأجهزة الكشف ، مما يخلق حاجزا كبيرا للباحثين المهتمين بدخول المجال أو اعتماد هذه التكنولوجيا. يؤدي عدم الوصول إلى إعاقة التطبيقات البيولوجية. الهدف من مجموعة الطرق هذه هو تقديم أمثلة مفصلة وإرشادات حول الأجهزة ، وأساليب التصوير الجديدة ، وتطبيقات تصوير الخلايا أو الأنسجة في المختبر / في الجسم الحي . قمنا بتضمين سبعة منشورات من خبراء في هذا المجال يتم تلخيصها هنا.

كلارك وآخرون يقدم مقارنة جنبا إلى جنب بين SRS الفائق الطيف و CARS من حيث الحساسية والدقة المكانية والدقة الطيفية9. يتم تنفيذ كلتا التقنيتين مع التركيز الطيفي لليزر الفيمتو ثانية ، وهو نهج شائع الاستخدام يستخدم ليزر الفيمتو ثانية عريض النطاق ذو الغرد الطيفي لتحقيق دقة رامان ضيق النطاق. تسمح المقارنة المباشرة بتقييم اختلافات الكشف والاختيار الأمثل للطريقة لتطبيقات التصوير الكيميائي المختلفة.

ينشر De la Cadena et al. طريقة SRS جديدة متعددة الإرسال يمكنها الحصول على صور SRS عريضة النطاقبسرعة 10. تعتمد هذه التقنية على اكتشاف مضخم قفل متعدد القنوات التفاضلي المخصص ، والذي يسمح باكتشاف ما يصل إلى 32 قناة في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض توصيف مفصل للضوضاء ، ويتم عرض طريقة كشف متوازنة للتخلص من ضوضاء الليزر. يوفر هذا البروتوكول إرشادات عملية للمستخدمين المهتمين ببناء أنظمة SRS متعددة الإرسال.

شي وآخرون يوضحون استخدام أصباغ رامان عالية الإرسال في تصوير SRS11. مع تعزيز ما قبل الرنين ، يظهرون أن SRS يمكن أن يوفر حساسية مماثلة للتألق المناعي القياسي. تتحايل هذه الطريقة على حد القنوات القابلة للحل طيفيا في التألق المناعي التقليدي وتسمح بمراقبة العديد من البروتينات في وقت واحد ودراسة تفاعلاتها. يتم توفير إرشادات مفصلة حول معالجة العينات وتلوين صبغة رامان لتسهيل اعتماد هذه الطريقة القوية.

يقدم Miao et al. التصوير الاهتزازي للأنسجة المنتفخة والتحليل (VISTA) ، وهي تقنية تصوير فائقة الدقة تجمع بين SRS والفحص المجهري التوسعي12. تتحايل VISTA على العقبات المرتبطة بالتصوير الفلوري وتحقق تصويرا حجميا فائقا خاليا من الملصقات في العينات البيولوجية بدقة مكانية تصل إلى 78 نانومتر. كما أنها تستغل خوارزمية التعلم العميق لتحقيق تجزئة متعددة المكونات ، بما في ذلك مجاميع البروتين في الخلايا وأنسجة المخ.

Espinoza et al. يقدم استخدام تصوير SRS بلونين في الوقت الفعلي للبروتينات والدهون لتطبيقات تشخيص الأنسجة13. يمكن أن ينتج تصوير SRS ثنائي اللون صورا مكافئة ل H&E لتطبيقات علم الأمراض. يصف هذا البروتوكول تفاصيل تنفيذ تقنية التعديل المتعامد والتركيز الطيفي للتصوير المتزامن باللونين SRS. كما يتم توضيح تحويل صور SRS ثنائية اللون إلى صور H & E الزائفة باستخدام أنسجة دماغ الفأر لتوضيح تطبيقات تشخيص الأنسجة.

يوان وآخرون ينشرون نظام غرفة مرن لتصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية14. تم تصميم معظم غرف مراقبة الخلايا الحية الحالية للتصوير بالمجال الساطع والفلورة. وهي غير متوافقة مع الكشف عن SRS بسبب الحاجة إلى هدف ومكثف NA عالي. يوضح المؤلفون تصوير SRS بفاصل زمني لمدة 24 ساعة باستخدام الغرفة المرنة ، والتي حافظت على درجة حرارة ثابتة ، ثاني أكسيد الكربون2 ، والرطوبة.

أخيرا ، Wu et al. يظهر في وقت واحد في الجسم الحي مضان ثنائي الفوتون (TPEF) وتصوير SRS15. يتم الجمع بين نظامي ليزر منفصلين لتحقيق الحساسية المثلى لكلا طريقتي التصوير لتوفير معلومات تكميلية. في الجسم الحي يواجه تصوير SRS للأنسجة تحديات فريدة بسبب الحاجة إلى الكشف عن الضوء غير المستقطب والمبعثر الخلفي. يناقش هذا البروتوكول تفاصيل الإعداد الأمثل لمجهر TPEF-SRS وكيف يمكن استخدامه للتصوير في الجسم الحي للحبل الشوكي للفأر.

تمثل هذه المجموعة من المنشورات أحدث ما توصلت إليه أجهزة CRM والتطورات التقنية. سيجد الباحثون المهتمون بكل من تطوير الأساليب والتطبيقات هذه المجموعة مفيدة لمقارنة الإعدادات ووضع معايير (الحساسية والدقة وما إلى ذلك) لإنشاء أو تحسين أنظمتهم الخاصة. ستعمل المبادئ التوجيهية وأفضل الممارسات المنصوص عليها في هذه البروتوكولات على إبلاغ التطبيقات الحالية والمستقبلية في المختبر وفي الجسم الحي . لا يزال الاعتماد على نطاق واسع لتقنية CRM ينتظر التطبيقات الرئيسية والمبتكرة وتسويق حلول CRM الكاملة. ومع ذلك ، فإن توحيد مناهج ومعايير التصوير أمر ضروري لضمان قابلية التكرار والموثوقية وتسهيل التنفيذ الأوسع لنظام إدارة علاقات العملاء16.

ينمو مجال CRM بسرعة عالية. تستمر التطورات التقنية التي تدفع الحساسية والخصوصية والحد الأقصى للدقة في دفع التكنولوجيا إلى مناطق جديدة. على سبيل المثال ، بدأت الدقة المكانية ل SRS في تجاوز حد الحيود17،18. تقترب حساسية SRS الإلكتروني قبل الرنين الآن من حساسية التألق19. بالمقارنة مع التألق ، يتمتع CRM بمزايا مميزة. على سبيل المثال ، سمح استخدام تتبع الديوتيريوم في الجسم الحي بدراسة ديناميكيات التمثيل الغذائي للجزيئات الصغيرة بدقة تحت الخلية لأول مرة20. باستخدام العلامات الصغيرة ، من الممكن إجراء اكتشاف رامان متعدد الإرسال للغاية ل 24 أو أكثر من الأهداف المسماة21. تتيح التطورات في الذكاء الاصطناعي إمكانات جديدة لإدارة علاقات العملاء من خلال الاستفادة من محتواها العالي من المعلومات والميزات الخاصة بالجزيئات لتقسيم وتصنيف الكائنات ذات الاختلافات الدقيقة في الميزات المكانية والطيفية22. معا ، تستعد هذه التطورات التقنية في CRM لتسريع وتوسيع التطبيقات في كل من التصوير البيولوجي والطبي الحيوي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف ليس لديه ما يفصح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلف بالدعم المالي من المعهد الوطني للصحة (NIH R35 GM133435) وجائزة Eli Lilly Young Investigator.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  2. Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
  3. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: Beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  4. Freudiger, C. W., et al. Label-Free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  5. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  6. Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).
  7. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  8. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  9. Clark, M. G., Brasseale, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct comparison of hyperspectral stimulated Raman scattering and coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for chemical imaging. Journal of Visualized Experiments. (182), e63677(2022).
  10. Dela Cadena, A., et al. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (185), e63709(2022).
  11. Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-Multiplexed tissue imaging with Raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547(2022).
  12. Miao, K., Lin, L. E., Qian, C., Wei, L. Label-Free super-resolution imaging enabled by vibrational imaging of swelled tissue and analysis. Journal of Visualized Experiments. (183), e63824(2022).
  13. Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. Real-Time, two-color stimulated Raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (180), e63484(2022).
  14. Yuan, Y., Lu, F. A flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (186), e64449(2022).
  15. Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63411(2021).
  16. Manifold, B., Fu, D. Quantitative stimulated Raman scattering microscopy: Promises and pitfalls. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 269-289 (2022).
  17. Qian, C., et al. Super-resolution label-free volumetric vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 3648(2021).
  18. Graefe, C. T., et al. Far-Field super-resolution vibrational spectroscopy. Analytical Chemistry. 91 (14), 8723-8731 (2019).
  19. Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
  20. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  21. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
  22. Manifold, B., Men, S., Hu, R., Fu, D. A versatile deep learning architecture for classification and label-free prediction of hyperspectral images. Nature Machine Intelligence. 3, 306-315 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Hyperspectral Stimulated Raman ScatteringCoherent Anti Stokes Raman ScatteringChemical ImagingMultiplex Chemical ImagingStimulated Raman Scattering MicroscopyTissue ImagingVibrational ImagingLive cell ImagingIn Vivo ImagingReal time ImagingSuper resolution Imaging

مقالات ذات صلة