يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس حركية الأنسجة الدهنية في الجسم الحي لدى البشر باستخدام نهج وضع العلامات على الديوتيريوم (2ساعة)

721 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64883

⸱

يوليو 21, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول هنا لقياس حركية الأنسجة الدهنية في الجسم الحي في البشر باستخدام طريقة وضع العلامات على الديوتيريوم (2ساعة).

الملخص

الأنسجة الدهنية البيضاء هي عضو بلاستيكي للغاية ضروري للحفاظ على توازن طاقة الجسم بالكامل. يتم تنظيم كتلة الأنسجة الدهنية والتغيرات في كتلة الدهون أو توزيعها من خلال التغيرات في تخليق وانهيار (أي دوران) الخلايا الدهنية وثلاثي الجلسرين. تشير الدلائل إلى أن طريقة وحجم تمدد الأنسجة الدهنية تحت الجلد (أي التضخم مقابل تضخم) ودوران الدوران يمكن أن يؤثر على صحة التمثيل الغذائي ، حيث أن تكوين الشحم متورط في التسبب في السمنة والأمراض ذات الصلة. على الرغم من الدور المحتمل لدوران الدهون في صحة الإنسان ، إلا أن هناك نقصا في المعرفة حول حركية الخلايا الدهنية في الجسم الحي . ويرجع ذلك جزئيا إلى معدل الدوران البطيء للخلايا في الأنسجة الدهنية والتعقيد العملي لوضع العلامات مباشرة على سلائفها الأيضية في الجسم الحي. هنا ، نصف طرق قياس حركية الدهون في الجسم الحي ومعدلات الدوران لدى البشر من خلال استهلاك المياه المسماة الديوتيريوم (2ساعة). يوفر دمج 2H في شقوق الديوكسي ريبونوكليوتيدات الحمض النووي في الخلايا الشحمية والخلايا الشحمية مقياسا دقيقا لتكوين الخلايا وموتها (دوران الدهون). بشكل عام ، يعد هذا نهجا مبتكرا لقياس حركية الدهون في الجسم الحي ويمثل خروجا جوهريا عن التقييمات الأخرى في المختبر .

المقدمة

السمنة هي مرض يتميز بزيادة الأنسجة الدهنية البيضاء (AT) وهي عامل خطر كبير لتطور مرض السكري من النوع الثاني وأمراض القلبوالأوعية الدموية 1. White AT هو عضو عالي البلاستيك يخزن الطاقة على شكل ثلاثي الجلسرين (TGs) وهو ضروري للتوازن الأيضي2. يحتفظ White AT بالقدرة على التوسع والتقليل وإعادة التشكيل خلال مرحلة البلوغ3 ، ويتم تحديد كتلة AT من خلال التغيرات الديناميكية في حجم الخلايا الشحمية (عن طريق تخليق TG وانهياره) ، وتكوين الخلايا الشحمية المستمر عن طريق تكاثر وتمايز الخلايا الشحمية (أي تضخم أو تكوين الشحم) ، وموت الخلايا الدهنية4.

تشير الدلائل إلى أن هناك صلة مهمة بين دوران AT تحت الجلد (على سبيل المثال ، تكوين الخلايا الشحمية والموت) وصحة القلب الأيضي5،6،7،8 ، ولا يزال دور تكوين الشحم في التسبب في الاضطرابات المرتبطة بالسمنة قابلا للنقاش4. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن دوران AT في الجسم الحي في البشر ويرجع ذلك جزئيا إلى معدل الدوران البطيء للمكونات الخلوية ل AT وتعقيد وضع العلامات مباشرة على سلائفها الأيضية في الجسم الحي. في حين أن الطرق في المختبر قد قدمت بعض الأفكار ، إلا أن هذه الأساليب لا توفر تقييما شاملا في الجسم الحي داخل البيئة الطبيعية ل AT.

تم تطوير طريقة من قبل مختبر Hellerstein9 لتقييم معدل دوران AT في الجسم الحي باستخدام دمج النظير المستقر الديوتيريوم (2H) من الماء الثقيل (2H2O) في AT (الشكل 1) 10. يتضمن البروتوكول ، الذي تم التحقق من صحته في الفئران والبشر ، تكثيفا أوليا قدره 2ساعة2O لزيادة تخصيب مياه الجسم لمدة 2ساعة ، متبوعا بتناول يومي كاف للحفاظ على قيم تخصيب مستقرة وشبه الهضبة. يتم دمج 2H من 2H2O (أي الماء الثقيل) في جزء الديوكسيريبوز (dR) من الديوكسي ريبونوكليوتيدات في الحمض النووي للخلايا الدهنية ، ويتم قياس تخصيب النظائر في الحمض النووي عن طريق قياس الطيف الكتلي وتطبيق تحليل توزيع النظائر الكتلية (MIDA) 9،10،11. إن وضع العلامات على جزء الديوكسيريبوز من الديوكسي ريبونوكليوتيدات البيورين في الحمض النووي بسلائف نظائر مستقرة له العديد من المزايا مقارنة بالطرق السابقة ، مثل تلك التي تضمنت وضع العلامات باستخدام شقوق قاعدة نيوكليوتيدات البيريميدين (على سبيل المثال ، من 3H-thymidine أو bromo-deoxyuridine). وتجدر الإشارة إلى أن إعادة الدمج الذاتي للقواعد ، خاصة بالنسبة للبيريميدين ، ولكن ليس dR ، في تكرار الحمض النووي أربك سابقا تفسير دمج الملصق12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن دمج تسمية النظائر المستقرة في dR لا يسبب أي سمية جينية ، على عكس دمج العوامل المشعة أو السامة للجينات مثل 3H (التريتيوم) أو برومو ديوكسيوريدين. لذلك ، فإن الاستخدام طويل الأمد لهذه التقنية في النماذج الحيوانية والبشر آمن.

يشير قياس تخليقالحمض النووي المسمى 2 H إلى مرور الخلية عبر المرحلة S من انقسام الخلية ويحدد الخلايا الشحمية والخلايا الشحمية التي تم تشكيلها حديثا (عن طريق تمايز الخلايا الشحمية السابقة) أو تكوين الشحم13. تحل الخلايا التي تخضع لدوران سريع (على سبيل المثال ، الخلايا الوحيدة) محل الحمض النووي الخاص بها بسرعة وتصل إلى هضبة في تخصيب 2H ، مما يوفر مرجعا داخليا للمقايس. تسمح نسبة تخصيب الحمض النووي 2H من الخلايا الدهنية إلى الخلايا الوحيدة (الخلايا المرجعية) أو قياس الجسم المتكامل 2H2O بحساب جزء الخلايا الدهنية المركبة حديثا. هنا ، يصف هذا البروتوكول طرقا لقياس معدلات دوران الخلايا الدهنية في الجسم الحي (تكوين الشحم) في البشر عبر بروتوكول وضع العلامات الأيضية 2H ، بما في ذلك التقنيات المكررة لتنقية الخلايا الشحمية عن طريق الانتقاء المناعي السلبي وإثراء مجموعة ما قبل الخلاياالشحمية 14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وافق مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع لمركز بنينجتون للأبحاث الطبية الحيوية على جميع الإجراءات (# 10039-PBRC) ، وأعطى جميع الأشخاص موافقة خطية مستنيرة.

1. ثمانية أسابيع 2ساعة2فترة وضع العلامات على O

  1. قم بإعطاء حصص من 70٪ أو 99.9٪ من الماء الملصق بالديوتيريوم (2ساعة2درجة مئوية) في عبوات بلاستيكية معقمة.
  2. توجيه المشاركين لشرب 35 مل جرعات من 99.9٪ 2 H2O أو 40 مل جرعات من 70٪ المخصب 2H2O ثلاث مرات يوميا في الأسبوع 1 (فترة التحضير) وشرب جرعتين 35 مل أو 50 مل, على التوالي, يوميا في الأسابيع 2-8.
    ملاحظة: الدوخة العابرة أو الدوار هي الآثار الضارة الوحيدة المعروفة لتناول 2ساعة2درجة وترتبط بالتغيرات السريعة في تدفق المياه السائبة ، والتي تدركها بصيلات الشعر في الأذن الداخلية. ومن ثم ، اطلب من المشاركين تناول الجرعات على الأقل ~ 2 ساعة لتجنب حدوث الدوخة العابرة أو الدوار15. للسبب نفسه ، لا تعوض عن الجرعات الفائتة بمضاعفة جرعة واحدة. إن إعطاء الجرعة كما هو موضح أعلاه (مفصولة ب ≥2 ساعة) يجعل هذا التأثير الضار نادرا للغاية لدى البشر (<1٪ من عدة مئات من الأشخاص).
  3. مراقبة الامتثال لتناول 2H2O من خلال مجموعات البول لقياس التخصيب 2H في مياه الجسم وأيضا عن طريق العودة الأسبوعية للقوارير الفارغة للعد.
    1. نظف عينات البول باستخدام الفحم المنشط وفلتر.
      1. أضف 8 مل من البول إلى أنبوب سعة 10 مل مع 1 مل من الفحم المنشط.
      2. ضع العينة على آلة هزاز لمدة 10 دقائق ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 800 × جم حتى ينتقل الفحم إلى قاع الأنبوب. قم بتصفية العينة باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر.
    2. قم بقياس التخصيب 2H2O في ماء الجسم (البول) عن طريق قياس الطيف الكتلي لنسبة النظائر (IRMS).
      ملاحظة: يمكن تحليل تخصيب 2H2O بطرق مختلفة ، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي للقواعد الكروماتوغرافيا16 ، ومحلل عنصر التحويل بدرجة حرارة عالية (TC / EA) إلى جانب IRMS17 ، والتحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لأسفل التجويف (IRIS) 18 ، أو باستخدام H / Device متصل بمطياف الكتلة (على سبيل المثال ، IRMS) 19.
    3. استخدم متوسط 2H2O التخصيب المقاس في البول خلال فترة وضع العلامات لمدة 8 أسابيع لحساب التعرض للسلائف 2H2O وجزء الخلايا AT المركبة حديثا (انظر القسم 7 والقسم 8 أدناه).

ملاحظة: يحافظ بروتوكول وضع العلامات 2H2O على تخصيب قريب من الهضبة 2H في مياه الجسم في حدود 1.0٪ -2.5٪ لمدة 8 أسابيع من فترة وضع العلامات (الشكل 2) 10.

2. مجموعات خزعة الأنسجة الدهنية من البشر

  1. بعد تطهير البشرة بمحلول بوفيدون اليود ، قم بإجراء التخدير الموضعي (على سبيل المثال ، 2٪ ليدوكائين / 0.5٪ بوبيفاكايين) ، وقم بعمل شق ~ 0.75 سم في الجلد ، وجمع خزعات AT تحت الجلد عبر تقنية شفط الدهون بالإبرة في ظل ظروف معقمة13.
  2. وزن أنبوب معقم سعة 50 مل يحتوي على 5 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) 1 M HEPES المؤقت ، درجة الحموضة 7.3. ضع AT على الفور في الأنبوب باستخدام المخزن المؤقت HEPES للمعالجة.
  3. قم بوزن الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على AT ، وسجل الوزن.

3. عزل الخلايا الشحمية المنقاة

  1. أضف محلول الكولاجيناز من النوع 1 / HEPES (2 مجم / مل) إلى 2 جم / مل AT.
  2. هضم AT عن طريق الحضانة في حمام مائي مع الرج (100 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية حتى يكون هناك خليط متجانس مع بضع قطع كبيرة سليمة من AT.
  3. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 500 × جم لمدة 8 دقائق في RT لفصل الخلايا الشحمية والكسر اللحمي الوعائي (SVF).
  4. قم بإزالة الطبقة الدهنية العليا برفق (الخلايا الشحمية) ، وانقلها إلى أنبوب منفصل. لا تعطل الحبيبات (SVF) في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. كما هو موضحسابقا 14 ، قم بتنقية الخلايا الشحمية باستخدام فصل الخلايا المغناطيسية المناعية.
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة المهمة "لتنظيف" الخلايا الشحمية ، حيث أن أنواع الخلايا الأخرى ذات الدوران السريع للخلايا ، بما في ذلك الخلايا المكونة للدم ، والبطانية ، والخلايا الجذعية ، قد تلتصق بالخلايا الشحمية العائمة وتؤثر على القياسات.
    1. ضع ~ 400 ميكرولتر من الخلايا الشحمية في أنبوب 5 مل لتنقية المناعة السلبية.
    2. أضف الجسم المضاد الممنع FcR (100 ميكرولتر / مل).
    3. أضف مزيجا من الأجسام المضادة الحيوية ضد علامات الخلايا البطانية (CD31 المضاد للإنسان ؛ 1: 100) ، والخلايا المكونة للدم (CD45 المضاد للإنسان ؛ 1: 400) ، والخلايا الجذعية الوسيطة (CD34 المضاد للإنسان ؛ 1: 100) إلى محلول الخلايا الشحمية لمدة 15 دقيقة في RT.
    4. أضف كوكتيل اختيار البيوتين (100 ميكرولتر / مل) إلى محلول الخلايا الشحمية ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة في RT مع إمالة / دوران لطيف.
    5. امزج الجسيمات النانوية المغناطيسية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ، وأضف الجسيمات (50 ميكرولتر / مل) إلى محلول الخلايا الشحمية ، واخلطها جيدا ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في RT مع دوران لطيف (10 دورة في الدقيقة).
    6. أضف PBS / 2٪ FBS / 1 ملي مولار EDTA إلى محلول الخلايا الشحمية للحصول على حجم إجمالي يبلغ 1 مل.
    7. ضع الأنبوب في المغناطيس واتركه لمدة 5 دقائق.
    8. التقط المغناطيس ، وبحركة واحدة مستمرة ، اقلب المغناطيس الذي يحتوي على الأنبوب ، واسكب المحتويات في أنبوب جديد سعة 5 مل. لا تنقر على الأنبوب أثناء الصب. ترتبط الخلايا المرتبطة بالأجسام المضادة بالجسيمات النانوية المغناطيسية وتتم إزالتها ، بينما يتم الاحتفاظ بالخلايا الشحمية المنعقة.
    9. قم بتجميد الخلايا الشحمية المنقاة في السائل N2 ، وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي.

4. عزل الخلايا الشحمية

  1. لعزل مجموعة غنية من الخلايا الشحمية ، استخدم بروتوكولا لاستغلال قدرتها على الالتصاق بالبلاستيك بعد ثقافة قصيرة المدى ل SVF20.
  2. في غطاء التدفق الصفحي ، أعد تعليق حبيبات SVF في 5 مل من محلول تحلل كريات الدم الحمراء لمدة 5-10 دقائق عند RT (تخلط جيدا) ، وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10٪ FBS في ألفا (α) MEM.
  3. ضع الخلايا على طبق استزراع بلاستيكي لمدة ~ 8-12 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية وبجو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 .
  4. بعد ~ 8-12 ساعة ، اغسل الخلايا غير الملتصقة برفق من لوحة الثقافة باستخدام PBS داخل غطاء تدفق رقائقي.
  5. بعد شفط PBS ، أضف 1-1.5 مل من 0.25٪ تريبسين / 1 ملي EDTA إلى طبق الثقافة لفصل الخلايا الملتصقة (مجموعة مخصبة من الخلايا الشحمية السابقة). ضع طبق الثقافة في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ~ 5-8 دقائق للمساعدة في رفع الخلايا.
  6. أضف 10٪ FBS / αMEM إلى اللوحة ، واغسل اللوحة جيدا لجمع جميع الخلايا من اللوحة. انقل محلول الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل أو 50 مل ، وجهاز طرد مركزي بحجم 800 × جم لمدة 8 دقائق.
  7. قم بإزالة المادة الطافية ، وقم بتخزين الحبيبات (الخلايا الشحمية المسبقة) عند -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي.

5. عزل الخلايا الوحيدة في الدم

ملاحظة: يتم تحليل الخلايا الوحيدة لتمثيل مجموعة خلايا (تقريبا) مقلوبة بالكامل ، ويمكن استخدام قياس تخصيب 2H في الخلايا الوحيدة كعلامة مرجعية للتعرض ل 2H2O في كل فرد. بدلا من ذلك ، يمكن قياس تخصيب الجسم 2H2O واستخدامه لحساب التعرض 2H2O.

  1. اسحب الدم الكامل الطازج من البشر إلى أنابيب التفريغ التي تحتوي على EDTA.
  2. جهاز الطرد المركزي للدم عند 1,000-2,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لا تستخدم الفرامل.
  3. قم بإزالة الطبقة العليا من البلازما. احرص على عدم لمس الطبقة البيضاء المصقولة أسفل البلازما مباشرة.
  4. قم بشفط الطبقة البيضاء باستخدام ماصة النقل ، وانقلها إلى أنبوب سعة 50 مل. أضف ~ 10 مل من PBS إلى الطبقة المصقولة.
  5. أضف برفق 10 مل من وسط تدرج الكثافة لطبقة طبقة من الطبقة المصفرية.
    ملاحظة: تأكد من أن طرف الماصة يلامس الجزء السفلي من الأنبوب، ثم أخرجه بعناية بحيث تكون هناك طبقة واضحة من وسط تدرج الكثافة في الأسفل. تجنب إدخال الفقاعات.
  6. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 800 × جم لمدة 30 دقيقة مع إيقاف تشغيل الفرامل.
  7. تخرج الماصة (~ 10 مل) الطبقة البيضاء (الجزء أحادي النواة) ، مما يجعل حركات دائرية مع طرف ماصة النقل بالقرب من الحدود ولكن لا تلمس الطبقة العليا. انقله إلى أنبوب جديد سعة 50 مل ، وأضف 10 مل من PBS. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق (لا تستخدم الفرامل) ، وتخلص من المادة الطافية.
  8. أضف 5 مل من محلول تحلل كريات الدم الحمراء إلى الحبيبات. امزج واتركه لمدة دقيقتين في RT.
  9. أضف 5 مل من PBS مع 0.1٪ BSA إلى محلول تحلل كريات الدم الحمراء / محلول الحبيبات ، وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
  10. اعزل الخلايا الوحيدة كخلايا CD14 + باستخدام حبات مغناطيسية مناعية. قم بعزل خلايا CD14+ باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  11. قم بتخزين الخلايا الوحيدة المعزولة عند -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي.

6. تحضير الحمض النووي (العزل والتحلل المائي والاشتقاق)

  1. اعزل الحمض النووي من الخلايا الشحمية والخلايا الشحمية والخلايا الوحيدة في الدم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  2. لتحرير الديوكسي ريبونوكليوسيدات ، قم بتحلل الحمض النووي إنزيميا (~ 200 ميكرولتر) بين عشية وضحاها (لا تزيد عن 24 ساعة) عند 37 درجة مئوية في 50 ميكرولتر من كوكتيل التحلل المائي للإنزيم الذي يحتوي على 1 مل من نوكلياز S1 ، و 1 مل من إنزيم الفوسفاتيز ، و 36.8 مل من محلول التحلل المائي 5x في أنابيب زجاجية مغطاة بالمسمار 16 مم × 100 مم (10 مل). بالإضافة إلى ذلك ، قم بتضمين العينات التالية: ماء فارغ ، وكوكتيل تحلل مائي فارغ ، وعمود فارغ من مجموعة استخراج الحمض النووي ، و 500 نانوغرام من معايير الحمض النووي.
    1. لتحضير المخزن المؤقت للتحلل المائي 5x ، ضع 94 مل من الماء النقي من درجة البيولوجيا الجزيئية في دورق معقم. قم بوزن 3.08 جم من أسيتات الصوديوم و 21.5 مجم من كبريتات الزنك ، أضف الماء واخلط حتى يذوب. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.0 باستخدام حمض الخليك الجليدي ، واختبره باستخدام ورق الأس الهيدروجيني. أضف الماء للوصول إلى الحجم الإجمالي 100 مل.
    2. لتحضير إنزيم الفوسفاتيز ، أعد تعليق قارورة من حمض الفوسفاتيز في 1 مل من الماء النقي.
    3. لتحضير إنزيم نوكلياز 0.5 U / μL S1 ، قم بتخفيف 2.5 ميكرولتر من نوكلياز S1 إلى 2 مل من محلول التحلل المائي 1x (أضف 1 مل من محلول التحلل المائي 5x إلى 4 مل من الماء النقي).
  3. اشتقاق التحلل المائي إلى مشتقات خماسي فلوروبنزيل هيدروكسيلامين (PFBHA). على وجه التحديد ، أضف ما يلي مباشرة إلى عينات الحمض النووي المهضومة ، بما في ذلك المعايير والفراغات ، في أنابيب غطاء لولبي مقاس 16 مم × 100 مم (10 مل): 100 ميكرولتر من خماسي فلورو بنزيل هيدروكسيلامين هيدروكلوريد (PFBHA ؛ 1 مجم / مل) و 75 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي. دوامة (لفترة وجيزة) ، قم بتغطية القوارير ، وضع عينات التحلل المائي على كتلة تسخين مثبتة على 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بإزالة العينات واتركها تبرد لمدة ~ 5 دقائق إلى RT. بعد التبريد ، أضف 2 مل من أنهيدريد الخليك و 100 ميكرولتر من 1-ميثيل إيميدازول إلى كل أنبوب تحت غطاء الدخان. اضبط الأنابيب على كتلة حرارية 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. قم بإزالة العينات ، ثم اتركها لتبرد لمدة ~ 15-20 دقيقة. بمجرد أن تبرد ، أضف 3 مل من الماء من درجة البيولوجيا الجزيئية إلى كل عينة ، ودوامة لفترة وجيزة ، واتركها لمدة 10 دقائق.
  6. أضف 2 مل من ثنائي كلورو الميثان (DCM) إلى الأنابيب ، وقم بتدوير العينات بقوة لمدة 15 ثانية لاستخراج المشتق في المرحلة العضوية.
  7. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق لفصل المراحل. انقل طبقة ثنائي كلورو الميثان السفلية بعناية إلى قارورة GC نظيفة سعة 1.6 مل.
    ملاحظة: لا تنقل أيا من الطور المائي ، لأن هذا سيزيد من الخلفية.
  8. تبخر حتى يجف بالنيتروجين لمدة ~ 20 دقيقة لإزالة DCM وحمض الخليك المتبقي ، متبوعا ب ~ 10 دقائق جافة في فراغ سريع عند RT لإزالة جميع آثار الكواشف.

7. تحليل الكروماتوغرافيا الغازية - قياس الطيف الكتلي (GC-MS) للحمض النووي

  1. بمجرد أن تجف ، أعد تعليق مشتقات PFBHA في 150 ميكرولتر من أسيتات الإيثيل ، والغطاء. بعد ذلك ، قم بتحليل دمج 2H في الحمض النووي على أداة كروماتوغرافيا الغاز (GC) / قياس الطيف الكتلي (MS) المجهزة بعمود DB-225 باستخدام التأين الكيميائي سالب الميثان وجمع الأيونات في وضع المراقبة الأيونية الانتقائية عند m / z 435 و m / z 436 و m / z 437 (تمثل نظائر الكتلة M0 و M1 و M2 ، على التوالي). اتبع تعليمات الشركة المصنعة للأداة المستخدمة.
    1. اضبط شروط GC على النحو التالي: العمود: 30 م × 0.25 مم المعرف × 0.25 ميكرومتر طلاء الفيلم ؛ كروماتوغراف: غاز ناقل الهيليوم عند تدفق ثابت 1.0 مل / دقيقة ؛ الحقن النبضية أقل الانقسام. درجة حرارة الحاقن: 250 درجة مئوية ؛ خط نقل MS: 325 درجة مئوية ؛ ظروف الفرن: درجة الحرارة الأولية 100 درجة مئوية ، استمر لمدة دقيقتين ، منحدر عند 40 درجة مئوية / دقيقة إلى درجة حرارة 220 درجة مئوية ، استمر 7.5 دقيقة ، منحدر ثان عند 40 درجة مئوية / دقيقة إلى 320 درجة مئوية ، استمر لمدة دقيقة واحدة. إجمالي وقت التشغيل هو 16.0 دقيقة. أوقات الشطف النموذجية هي 10.5 دقيقة و 10.8 دقيقة للقمتين الأولى والثانية ، على التوالي.
    2. اضبط شروط MS على النحو التالي: مصدر التأين الكيميائي سالب الميثان مع الكشف في وضع مراقبة الأيونات الفردية ؛ الأيونات التي تم جمعها ل dR: m / z 435 و m / z 436 و m / z 437 (تمثل نظائر الكتلة M0 و M1 و M2 ، على التوالي).
      ملاحظة: قم بطلاء البطانة الزجاجية المفتوحة بالسيليكون بسدادة صغيرة من الصوف الزجاجي المصنوع من السيليكون في الجزء السفلي من البطانة. قم بتغيير هذه البطانة كثيرا (كل ~ 100 حقنة).
  2. احسب نسب وفرة النظائر الكتلية M1 في مشتق dR غير المخصب (الوفرة الطبيعية) على النحو التالي:
    نسبة M1 = وفرة M1 / (مجموع وفرة M0 و M1 و M2)
    بعد ذلك ، اطرح نسب الوفرة الطبيعية M1 من نسب M1 في dR للعينات المسماة لحساب التخصيب (وفرة النظائر الزائدة ، أو ٪ EM1) 21.
  3. قياس وفرة النظائر الكتلية لمعايير الحمض النووي الأساسية (غير المخصبة) بشكل متزامن على مدى وفرة أيونات M0 التي تمتد على نطاق وفرة أيونات M0 في العينات التي تم تحليلها.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتصحيح "حساسية الوفرة" لنسب النظائر المقاسة بواسطة GC / MS22.
  4. قم بإنشاء رسم بياني لوفرة أيون M0 المقاسة مقابل نسب النظائر الكتلية المقاسة M1 في المعايير غير المسماة لتحديد تركيز العينة على العمود الأكثر دقة لنظائر الكتلة M1 (أي حيث يكون الأقرب إلى نسبة الوفرة الطبيعية المعروفة المحسوبة M1 ، أو "البقعة الحلوة"). نسبة M1 لهذا المشتق dR غير المخصب هي 0.1669.
  5. حقن العينات التجريبية بحيث تكون أقرب ما يمكن في منطقة الذروة M0 إلى هذه "البقعة الحلوة". استخدم انحدارا تربيعيا لنسبة M1 للمعايير غير المخصبة مقابل منطقة الذروة M0 لتقدير نسبة M1 "الوفرة الطبيعية المعدلة" لكل عينة بتركيزها الخاص M0. اطرح هذا من نسبة عينة الخلايا الدهنية M1 للحصول على نسبة التخصيب المئوية فوق الوفرة الطبيعية ، أو ٪ EM1 (الشكل 3) 23.
  6. احسب الحد الأقصى النظري لتخصيب M1 (EM1 *) في الخلايا الدهنية باستخدام تحليل توزيع النظائر الكتلية (MIDA) المعادلات24 بناء على الجسم 2H 2 Oالتعرض (المقاس في البول) المتكامل على مدار فترة 8 أسابيع (الشكل 4) أو تخصيب الخلايا الأحادية المقاسة المؤقتة (الخطوة 7.5).

8. حساب جزء الخلايا المركبة حديثا ، أو في الجسم الحي adipogenesis

  1. احسب جزء الخلايا الجديدة (٪) ، وهو مقياس لتكوين الشحم في الجسم الحي أو تكوين الخلايا الشحمية أو الخلايا الشحمية المركبة حديثا ، باستخدام الصيغة التالية:
    جزء من الخلايا الجديدة (٪) = [(إثراء M1 في عينة الخلايا [الدهنية])/EM1* (الحد الأقصى النظري لتخصيب M1 )] × 100
    ملاحظة: * يمكن أيضا استخدام تخصيب 2H في الخلايا الوحيدة كمقام للمعادلة. يمثل هذا القياس في الخلايا الوحيدة علامة خلية مرجعية للتعرض 2H2O في كل فرد ويمكن استخدامه لتأكيد حسابات الحد الأقصى النظري لتخصيب M1من قيم الجسم المقاس 2H2O.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يحافظ بروتوكول وضع العلامات 2H2O (القسم 1) على تخصيب قريب من الهضبة 2H في مياه الجسم في حدود 1.0٪ -2.5٪ طوال فترة وضع العلامات لمدة 8 أسابيع10 ، كما هو موضح في الشكل 2. استخدمت دراسة سابقة بروتوكول وضع العلامات 2H2O لتقييم حركية الدهون عن طريق دمج 2H في الحمض النووي للخلايا الدهنية ، كما هو مفصل في الأقسام 2-8 ، وذكرت أن تكوين الشحم في الجسم الحي (كل من تكاثر الخلايا الشحمية وتكوين الخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعد التقييمات في الجسم الحي ضرورية لتوفير معرفة جديدة حول ديناميكيات دوران AT الأبيض ودوره في السمنة وأمراض التمثيل الغذائي ذات الصلة ، حيث لا تشمل التقييمات المختبرية البيئة الطبيعية ل AT. على الرغم من أن استخدام التأريخ بالكربون المشع بأثر رجعي لتقييم ديناميكيات الدهون كان مفيدا7،25 ، إلا أن هذا النهج غير مناسب لالتقاط التغييرات الديناميكية أثناء دراسات التدخل المستقبلية. تم التحقق من صحة طريقة وضع العلامات

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون قلب قياس الطيف الكتلي في مركز بنينجتون للأبحاث الطبية الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-ميثيل إيميدازولميليبورسيجما336092
2H2OSigma Aldrich
خليك أنهيدريدAldridge539996
ACK Lysing Buffer (مخزن تحلل كريات الدم الحمراء)Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 GC / MS Agilent
Anti-Human CD31 (PECAM-1) BiotinInvitrogen13-0319-82
مضاد للإنسان CD34 BiotinInvitrogen13-0349-82
مضاد للإنسان CD45BioLegend304004
محلول مضاد حيوي مضاد للفطرياتMilliporeSigmaA5955
كولاجيناز نوع 1ورثينجتون بيوكيمياء شركةLS004196
Deoxyribose (2-deoxy d-ribose)MilliporeSigma31170
Deuterium OxideMilliporeSigma756822
DB-225 العمود (30 م ، 0.25 مم ، 0.25 ميكرومتر)J& W Scientific122-2232
ثنائي كلورو ميثان (DCM)MilliporeSigma34856
معيار الحمض النووي (الحمض النووي للغدة الصعترية في ربلة الساق)MilliporeSigmaD4764
Dneasy Blood and Tissue Kit (طقم استخراج الحمض النووي)Qiagen69504
Easy Sep مجموعة البيوتين البشريتقنيات الخلايا الجذعية17663
EasySep Human CD14 الاختيار الإيجابي تقنيات الخلايا الجذعية18058C
أسيتات الإيثيلفيشرEX0241-1
فالكون 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستديرVWR 60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeقارورة GCGE17-1440-02
GC (2 مل)فيشرC-4011-1W
قارورة GC إدراجفيشرC-4011-631 ؛ C-4012-530
حمض الخليك الجليديفيشرAC14893-0010
أنابيب زجاجية (للتحلل المائي)فيشر14-959-35AA
HEPES عازلةThermoFisher15630080
Hyclone Water ، درجة البيولوجيا الجزيئيةتوماس ScientificSH30538.02
MEM ألفافيشر Scientific32561-037
PFBHA (o- (2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6) -penatfluorobenzylhydroxylamin hydrochloride)MilliporeSigma194484
شرائط مؤشر الأس الهيدروجينيفيشر987618
حمض الفوسفاتيزكالبيوكيم (VWR)80602-592
S1 nuclease (من Aspergillus oryzae)MilliporeSigmaN5661
كبريتات الصوديومMilliporeSigma23913
للكوكتيل

المراجع

  1. Cypess, A. M. Reassessing human adipose tissue. The New England Journal of Medicine. 386 (8), 768-779 (2022).
  2. Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
  3. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  4. White, U., Ravussin, E. Dynamics of adipose tissue turnover in human metabolic health and disease. Diabetologia. 62 (1), 17-23 (2019).
  5. Danforth, E. Failure of adipocyte differentiation causes type II diabetes mellitus. Nature Genetics. 26 (1), 13(2000).
  6. Virtue, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue expandability, lipotoxicity and the metabolic syndrome--An allostatic perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 338-349 (2010).
  7. Arner, E., et al. Adipocyte turnover: relevance to human adipose tissue morphology. Diabetes. 59 (1), 105-109 (2010).
  8. Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
  9. Busch, R., Neese, R. A., Awada, M., Hayes, G. M., Hellerstein, M. K. Measurement of cell proliferation by heavy water labeling. Nature Protocols. 2 (12), 3045-3057 (2007).
  10. Neese, R. A., et al. Measurement in vivo of proliferation rates of slow turnover cells by 2H2O labeling of the deoxyribose moiety of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15345-15350 (2002).
  11. Strawford, A., Antelo, F., Christiansen, M., Hellerstein, M. K. Adipose tissue triglyceride turnover, de novo lipogenesis, and cell proliferation in humans measured with 2H2O. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 286 (4), E577-E588 (2004).
  12. Macallan, D. C., et al. Measurement of cell proliferation by labeling of DNA with stable isotope-labeled glucose: Studies in vitro, in animals, and in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (2), 708-713 (1998).
  13. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Differences in in vivo cellular kinetics in abdominal and femoral subcutaneous adipose tissue in women. Diabetes. 65 (6), 1642-1647 (2016).
  14. Tchoukalova, Y. D., et al. In vivo adipogenesis in rats measured by cell kinetics in adipocytes and plastic-adherent stroma-vascular cells in response to high-fat diet and thiazolidinedione. Diabetes. 61 (1), 137-144 (2012).
  15. Jones, P. J., Leatherdale, S. T. Stable isotopes in clinical research: Safety reaffirmed. Clinical Science. 80 (4), 277-280 (1991).
  16. Bacchus-Souffan, C., et al. Relationship between CD4 T cell turnover, cellular differentiation and HIV persistence during ART. PLoS Pathogens. 17 (1), e1009214(2021).
  17. Simonato, M., et al. Disaturated-phosphatidylcholine and surfactant protein-B turnover in human acute lung injury and in control patients. Respiratory Research. 12 (1), 36(2011).
  18. Tremoy, G., et al. Measurements of water vapor isotope ratios with wavelength-scanned cavity ring-down spectroscopy technology: New insights and important caveats for deuterium excess measurements in tropical areas in comparison with isotope-ratio mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (23), 3469-3480 (2011).
  19. dos Santos, T. H. R., Zucchi, M. D., Lemaire, T. J., de Azevedo, A. E. G., Viola, D. N. A statistical analysis of IRMS and CRDS methods in isotopic ratios of H-2/H-1 and O-18/O-16 in water. Sn Applied Sciences. 1, 664(2019).
  20. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nature Protocols. 4 (1), 102-106 (2009).
  21. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  22. Patterson, B. W., Zhao, G., Klein, S. Improved accuracy and precision of gas chromatography/mass spectrometry measurements for metabolic tracers. Metabolism. 47 (6), 706-712 (1998).
  23. Mazzarello, A. N., Fitch, M., Hellerstein, M. K., Chiorazzi, N. Measurement of leukemic B-cell growth kinetics in patients with chronic lymphocytic leukemia. Methods in Molecular Biology. 1881, 129-151 (2019).
  24. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: A technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263, E988-E1001 (1992).
  25. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
  26. Allerton, T. D., et al. Exercise reduced the formation of new adipocytes in the adipose tissue of mice in vivo. PLoS One. 16 (1), e0244804(2021).
  27. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Association of in vivo adipose tissue cellular kinetics with markers of metabolic health in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (7), 2171-2178 (2017).
  28. White, U., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Adipose depot-specific effects of 16 weeks of pioglitazone on in vivo adipogenesis in women with obesity: A randomised controlled trial. Diabetologia. 64 (1), 159-167 (2021).
  29. Steele, R. Influences of glucose loading and of injected insulin on hepatic glucose output. Annals of the New York Academy of Sciences. 82, 420-430 (1959).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.