مقالة منهجية

مراقبة التغيرات في الخلايا البطانية الوريدية للوريد السري البشري عند الإصابة الفيروسية باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة

1.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64887

⸱

مايو 5, 2023

 ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

في هذه المقالة

ملخص

تصف الدراسة الحالية بروتوكولا لمراقبة التغيرات في الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) أثناء العدوى الفيروسية باستخدام نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي (RTCA).

الملخص

تبطن الخلايا البطانية السطح الداخلي لجميع الأوعية الدموية واللمفاوية، مما يخلق حاجزا شبه نافذ ينظم تبادل السوائل والمذاب بين الدم أو اللمف والأنسجة المحيطة بهما. تعد قدرة الفيروس على عبور الحاجز البطاني آلية مهمة تسهل انتشار الفيروس في جسم الإنسان. تم الإبلاغ عن العديد من الفيروسات لتغيير نفاذية البطانة و / أو التسبب في اضطراب حاجز الخلايا البطانية أثناء العدوى ، والتي يمكن أن تسبب تسرب الأوعية الدموية. تصف الدراسة الحالية بروتوكول تحليل الخلايا في الوقت الفعلي (RTCA) ، باستخدام محلل خلايا تجاري في الوقت الفعلي لمراقبة سلامة البطانة وتغيرات النفاذية أثناء عدوى فيروس زيكا (ZIKV) للخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). تمت ترجمة إشارات المعاوقة المسجلة قبل وبعد الإصابة بفيروس زيكا إلى قيم مؤشر الخلية (CI) وتحليلها. يسمح بروتوكول RTCA بالكشف عن التأثيرات العابرة في شكل تغيرات مورفولوجية للخلايا أثناء العدوى الفيروسية. يمكن أن يكون هذا الفحص مفيدا أيضا لدراسة التغيرات في سلامة الأوعية الدموية ل HUVECs في الإعدادات التجريبية الأخرى.

المقدمة

تبطن الخلايا البطانية (ECs) السطح الداخلي لجميع الأوعية الدموية واللمفاوية. وهي متصلة بواسطة تقاطعات فجوة ضيقة ، مما يخلق حاجزا شبه نافذ بين الدم أو الليمفاوية والأنسجة المحيطة 1,2. تعتبر تقاطعات الخلايا البطانية السليمة ضرورية لتنظيم نقل الجزيئات الكبيرة والمواد المذابة والسوائل ، وهي ضرورية للأنشطة الفسيولوجية للأنسجة والأعضاء المقابلة3. الحاجز البطاني ديناميكي ومعدل بواسطة محفزات محددة4. يعد اضطراب أو فقدان وظيفة الحاجز البطاني سمة مميزة للفيزيولوجيا المرضية للمرض في الالتهاب الحاد والمزمن في التسبب في العديد من الأمراض5،6،7 ، بما في ذلك العدوى الفيروسية8،9،10،11. بالنسبة للفيروسات المصفرة ، وجد أن البروتين غير الهيكلي NS1 يمكن أن يغير نفاذية البطانة ، على سبيل المثال ، عن طريق تعطيل الطبقة الشبيهة بالجليكوكاليكس البطانية نتيجة لزيادة التعبير وتنشيط cathepsin L ، sialidases ، و endoglycosidaseheparinase 9. في حالة المرض ، تتأثر سلامة الطبقة الأحادية البطانية ، وتتعطل تقاطعات الخلايا الخلوية ، مما قد يؤدي إلى إصابة البطانة واختلال وظيفي12 وفي النهاية مظاهر مرضية واسعة الانتشار عبر أنظمة أعضاء متعددة13,14. تؤدي العدوى الفيروسية ل ECs إلى تغييرات في مسارات إشارات الخلية وملف التعبير الجيني الخلوي ، مما قد يؤثر على وظائف حاجز السوائل ، ويسبب اضطرابا في ECs ، ويحفز تسرب الأوعية الدموية10,15. تم العثور على عدوى فيروس زيكا (ZIKV) من ECs لتعطيل سلامة الموصل الذي يسبب تغيرات في نفاذية الأوعية الدموية ويؤدي إلى خلل في الحاجز البطاني ، مما يؤدي إلى تسرب الأوعية الدموية10,15. وقد أظهرت الدراسات أن فيروس زيكا مرتبط بالعيوب الخلقية الشديدة. ومع ذلك ، لا يعرف الكثير عن الآلية الدقيقة التي يحدث بهاهذا 16,17. لذلك فإن فهم تغيرات الحاجز البطاني أثناء العدوى أمر بالغ الأهمية لفهم آلية المرض.

تستخدم ECs حاليا كنظام تجريبي مهم في نموذج الأوعية الدموية في المختبر لمختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية18،19،20،21. تم استخدام الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) على نطاق واسع كنظام خلوي أولي غير خالد لدراسة البطانة الوعائية وبيولوجيا الأوعية الدموية في المختبر22،23،24،25. تم عزل HUVECs لأول مرة للثقافة في المختبر في أوائل سبعينيات القرن العشرين من الوريد السري للحبل السري البشري26. تحتوي HUVECs على مورفولوجيا تشبه الحصى يمكن بسهولة تكاثرها في المختبر. بسبب إجهاد القص بعد الحفاظ عليه لفترات طويلة في حالة الالتقاء ، لوحظ استطالة شكل الخلية. يمكن أن تتميز HUVECs بوجود أجسام Weibel و Palade (WPB) ، والحويصلات pinocytic ، وكميات صغيرة من الألياف الموجودة بالقرب من النواة ، والميتوكوندريا ذات الأشكال الأنبوبية التي نادرا ما تظهر تشعباتها ، ونواة إهليلجية ذات نمط حبيبي دقيق من الكروماتين المكثف ، ونواة واحدة إلى ثلاث نوى موجودة في كل نواة27. على الرغم من أن HUVECs تظهر العديد من الخصائص المورفولوجية ، إلا أنه لا يمكن تحديد HUVECs عن طريق الفحص البصري وحده. تستخدم المقايسات ، مثل تلطيخ التألق المناعي للبطانة الوعائية (VE) -cadherin ، بشكل شائع لمراقبة سلامة الأوعية الدموية في HUVECs28،29،30،31.

تصف هذه الدراسة بروتوكول تحليل الخلايا في الوقت الفعلي (RTCA) لعدوى HUVECs. يستخدم نظام RTCA ألواحا متخصصة مطلية بالذهب تحتوي على أقطاب كهربائية دقيقة توفر سطحا موصلا لربط الخلية. عندما تلتصق الخلايا بسطح القطب الدقيق ، يتم تشكيل حاجز يعيق تدفق الإلكترون عبر الأقطاب الكهربائية الدقيقة. يمكن استخدام قياس المعاوقة الناتجة عن الأقطاب الكهربائية الدقيقة للحصول على معلومات حول بعض العمليات الخلوية ، بما في ذلك ارتباطات الخلايا والانتشار والهجرة32. الفحص المبلغ عنه هو فحص خلوي قائم على المعاوقة ، إلى جانب محلل الخلايا في الوقت الفعلي ، يوفر قياسا مستمرا لتكاثر الخلايا الحية ، وتغيرات التشكل (مثل تقلص الخلايا) وجودة ارتباط الخلية بطريقة غير جراحية وخالية من الملصقات. في هذه الدراسة ، يتم استخدام محلل الخلايا في الوقت الفعلي لمراقبة سلامة البطانة والتغيرات المورفولوجية ل HUVECs أثناء عدوى ZIKV. باختصار ، يقيس الجهاز تدفق الإلكترون المنقول في ألواح المعايرة الدقيقة المطلية بالذهب الدقيقة في وجود وسط ثقافة (محلول موصل كهربائيا). يؤدي التصاق الخلية أو التغيرات في عدد الخلايا والتشكل إلى إزعاج تدفق الإلكترون ويسبب اختلافات في المعاوقة يمكن التقاطها بواسطة الأداة (الشكل التكميلي 1). يتم تسجيل الفرق بين نمو HUVEC وانتشاره والالتزام قبل وبعد الإصابة بفيروس ZIKV في الوقت الفعلي بواسطة إشارة مقاومة كهربائية ثم ترجمته إلى قيمة مؤشر الخلية (CI). يتم استخدام قيمة CI من مرحلة ما قبل العدوى كخط أساس لتطبيع قيمة CI. تعكس التغييرات في قيم CI التغيرات المورفولوجية الخلوية أو فقدان التصاق الخلية عند الإصابة33. تظهر نتائج الدراسة أن بروتوكول RTCA يسمح بالكشف عن التأثيرات العابرة أو التغيرات المورفولوجية للخلايا أثناء العدوى الفيروسية مقارنة بمقايسة نقطة النهاية ، مثل تلطيخ التألق المناعي ل VE-cadherin. يمكن أن تكون طريقة RTCA مفيدة لتحليل تغيرات سلامة الأوعية الدموية HUVEC عند الإصابة بفيروسات أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الخلية

  1. إعداد HUVECs
    1. تنمو 7.5 × 105 خلايا HUVEC / مل في 75 سم2 (مغلفة ب 20 ميكروغرام / مل كولاجين من النوع 1) دورق زراعة الخلايا يحتوي على 12 مل من وسط الخلايا البطانية (ECM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، 0.01٪ مكمل نمو الخلايا البطانية (ECGS) الذي يحتوي على عوامل النمو والهرمونات والبروتينات اللازمة لثقافة HUVECs ، و 0.01٪ بنسلين-ستربتومايسين (P / S). احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 (الشكل 1).

2. إعداد تجربة RTCA

  1. تشغيل التحقق من المقاوم على RTCA
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز برنامج RTCA في سطح المكتب لتشغيل التطبيق. ستظهر نافذة تسجيل الدخول ، اكتب اسم المستخدم وكلمة المرور لتسجيل الدخول.
    2. ضع لوحة مقاومة RTCA ذات 96 بئرا بحيث يكون البئر A1 مواجها للداخل في محطة RTCA الموجودة في حاضنة زراعة الخلايا.
    3. في علامة التبويب Exp Notes في برنامج RTCA، اكتب اسم التجربة وSN للجهاز ونوع الجهاز (لوحة مراقبة الجودة).
    4. في علامة التبويب تخطيط ضمن علامة التبويب خلية في برنامج RTCA ، قم بتمييز جميع الآبار وانقر بزر الماوس الأيمن على الآبار المميزة للتأكد من تشغيل جميع الآبار (باللون الرمادي).
    5. في علامة التبويب جدولة في برنامج RTCA، انقر فوق Step_1. أدخل عمليات المسح: 10 ، والفاصل الزمني: 30 ثانية. انقر على تطبيق. انقر فوق ابدأ / متابعة في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج لبدء تشغيل التحقق.
      ملاحظة: تأكد من أن توصيل الآبار بمحطة RTCA على ما يرام من خلال ملاحظة "مسح اللوحة. اتصالات موافق" في أسفل الصفحة.
  2. تشغيل التحقق من المقاوم لتحليل البيانات
    1. في علامة التبويب فهرس الخلية ، تحقق من البيانات عند الانتهاء من التشغيل. يجب أن تكون جميع قيم CI أقل من 0.063.
    2. في الجزء السفلي من علامة التبويب فهرس الخلية ، تحقق من بيانات الفحص الأولية. يجب أن تظهر بيانات المسح الأولي أنماط قيم متكررة تبلغ 40.0 ± 2.0 (الصفان A و H) و 67.5 ± 2.5 (الصفان B و G) و 93.6 ± و 2.9 (الصفان C و F) و 117.6 ± 3.2 (الصفان D و E).
    3. لإيقاف تشغيل التحقق، انقر فوق لوحة > لوحة تحرير. لوحة مقاومة RTCA ذات 96 بئرا جاهزة الآن للإزالة من محطة RTCA.
  3. الحصول على قراءة خلفية على RTCA
    1. اغسل صفيحة الإلكترود الدقيقة المتخصصة المطلية بالكولاجين من النوع 1 (المغلفة ب 20 ميكروغرام / مل من الكولاجين من النوع 1) مع 60 ميكرولتر / بئر من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS ؛ مع بيكربونات الصوديوم ، بدون كلوريد الكالسيوم وكبريتات المغنيسيوم) 2x.
    2. تخلص من HBSS المتبقي وأضف 50 ميكرولتر / بئر من ECM. ضع لوحة القطب الذهبي الدقيقة المتخصصة التي تحتوي على ECM مع توجيه البئر A1 إلى الداخل في محطة RTCA الموجودة في حاضنة زراعة الخلايا.
    3. في علامة التبويب Exp Notes في برنامج RTCA، اكتب اسم التجربة وSN للجهاز ونوع الجهاز (تنسيق 96-well).
    4. في علامة التبويب تخطيط ضمن علامة التبويب خلية في برنامج RTCA ، قم بتمييز الآبار التي سيتم استخدامها وانقر بزر الماوس الأيمن على الآبار المميزة للتأكد من تشغيل جميع الآبار (باللون الرمادي).
    5. في علامة التبويب جدولة في برنامج RTCA ، انقر فوق Step_1 ، وانقر فوق ابدأ / متابعة في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج للحصول على قراءة الخلفية.
      ملاحظة: تأكد من صحة توصيل الآبار من خلال ملاحظة "مسح اللوحة. اتصالات موافق" في أسفل الصفحة.
    6. بمجرد الحصول على قراءة الخلفية ، تكون لوحة القطب الذهبي الدقيقة المتخصصة جاهزة الآن لبذر الخلايا وجاهزة للإزالة من محطة RTCA.
  4. تحضير HUVEC في لوحة الذهب الدقيقة المتخصصة
    1. قم بزرع HUVECs في لوحة القطب الدقيق الذهبي المتخصصة مع 50 ميكرولتر / بئر من الوسط المكيف ، 1 × 104 خلايا / بئر (وسط مكيف: ECM مكمل ب 10٪ FBS ، 0.01٪ ECGS ، و 0.01٪ P / S). ضع اللوحة مرة أخرى في محطة RTCA مع توجيه البئر A1 للداخل للحضانة الليلية في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: تم إجراء عدد الخلايا على تعليق الخلية مع عامل تخفيف اثنين باستخدام مقياس الدم.
    2. في علامة التبويب جدولة ، انقر على إضافة خطوة في الزاوية العلوية اليمنى. انقر فوق Step_2 وقم بتغيير عمليات المسح: 601 ، والفاصل الزمني: 2 دقيقة. انقر فوق تطبيق. انقر فوق Step_2 وانقر فوق ابدأ / متابعة في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج.
    3. بعد 20 ساعة من الحضانة وعندما تظهر قيم CI في علامة تبويب الرسم البياني للبئر هضبة ، تكون اللوحة جاهزة للعدوى. في علامة التبويب جدولة من برنامج RTCA، انقر فوق إحباط الخطوة.
    4. لوحة القطب الذهبي الدقيقة المتخصصة جاهزة الآن للإزالة من محطة RTCA للخطوات اللاحقة.

3. العدوى الفيروسية في HUVECs

  1. تخفيف الفيروس
    1. يتم الاحتفاظ بمخزون ZIKV عند -80 درجة مئوية. في هذه الدراسة ، قم بإزالة مخزون الفيروس المحفوظ في القوارير المبردة وتخفيف مخزون ZIKV باستخدام ECM الخالي من المصل في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل لتحقيق تعدد العدوى (MOIs) بمقدار 0.1 و 1.
      ملاحظة: تم تحضير مخزون ZIKV مسبقا عن طريق إجراء التكاثر في خلايا Vero وحصاد طاف ZIKV34.
  2. إصابة الخلية أحادية الطبقة
    1. قم بإزالة وتجاهل الوسط المكيف (ECM المكمل ب 10٪ FBS و 0.01٪ ECGS و 0.01٪ P / S) من كل بئر. شطف كل بئر مع 60 ميكرولتر من HBSS 2x. أدخل HBSS بمساعدة جانب البئر ؛ لا تطلق النار على الخلية أحادية الطبقة.
    2. من أعلى إلى أدنى تخفيف ، أضف 40 ميكرولتر من كل عينة فيروس مخففة في ECM خالية من المصل في البئر. قم بمضاعفة البئر ثلاث مرات لكل تخفيف والحفاظ على ستة آبار بدون عدوى (التحكم السلبي والثرومبين المتحكم الإيجابي). لا تطلق النار على الخلية أحادية الطبقة ؛ بدلا من ذلك ، أضف الفيروس المخفف بمساعدة جانب البئر. استخدم طرف ماصة جديد لكل إدخال.
      ملاحظة: تم اختيار الثرومبين كعنصر تحكم إيجابي لأنه يمكن أن يزيد من نفاذية البطانة ل HUVECs بسرعة.
    3. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للسماح بامتصاص الفيروس. حفيف اللوحة 5 مرات كل 15 دقيقة للسماح بامتصاص الفيروس في جميع أنحاء الطبقة الأحادية للخلية.
  3. إضافة وسط زراعة الخلايا المتراكبة
    1. بعد 1 ساعة من الحضانة ، قم بإزالة معلق الفيروس وتجاهله من أدنى تركيز إلى أعلى.
    2. اغسل الخلايا المصابة ب 60 ميكرولتر من HBSS 2x. تراكب البئر مع ECM تستكمل مع 2 ٪ FBS. بالنسبة لآبار التحكم الإيجابية ، قم بتخفيف الثرومبين إلى 20 وحدة / مل مع ECM المكمل ب 2٪ FBS ، وقم بتراكب الآبار بوسط ECM المحتوي على الثرومبين. لا تطلق النار على الخلية أحادية الطبقة ؛ بدلا من ذلك ، أضف وسائط تراكب بمساعدة جانب البئر.
  4. إعادة صفيحة الأقطاب الكهربائية الدقيقة المتخصصة المصابة إلى محطة RTCA
    1. في علامة التبويب جدولة ، انقر على إضافة خطوة في الزاوية العلوية اليمنى. انقر فوق Step_3 وقم بتغيير عمليات المسح: 3,601 والفاصل الزمني: 2 دقيقة. انقر فوق تطبيق.
    2. انقر فوق موافق في النافذة المنبثقة التي تظهر. ضع لوحة القطب الذهبي الدقيقة المتخصصة المصابة بحيث يكون البئر A1 متجها إلى الداخل في محطة RTCA الموجودة في حاضنة زراعة الخلايا.
    3. انقر فوق Step_3 وانقر فوق ابدأ / متابعة في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج.

4. تحليل البيانات وتصدير البيانات

  1. إضافة معلومات تجريبية لكل بئر
    1. في علامة التبويب تخطيط ، انقر فوق علامة التبويب خلية (الشكل 2 أ). لإدخال معلومات الخلية المستهدفة وتحديد نوع البئر لكل بئر ، قم بتمييز البئر واكتب اسم الخلية المستهدفة ورقمها ولونها في الجزء السفلي من البرنامج. انقر فوق تطبيق (الشكل 2 ب).
    2. لتحديد نوع البئر وتحديده لكل بئر في علامة التبويب خلية ، قم بتمييز البئر، وحدد نوع البئر (عينة أو عنصر تحكم موجب أو عنصر تحكم سالب)، وانقر فوق تعيين.
    3. في علامة التبويب تخطيط ، انقر فوق علامة التبويب العلاج (الشكل 2C). لإدخال معلومات العلاج ، قم بتمييز البئر واكتب اسم العلاج وتركيز المعالجة والوحدة واللون. انقر فوق تطبيق (الشكل 2D).
    4. لتحديد نوع البئر وتحديده لكل بئر في علامة التبويب المعالجة ، قم بتمييز البئر، وحدد نوع البئر (عينة، أو عنصر تحكم إيجابي، أو تحكم سلبي)، وانقر فوق تعيين.
      ملاحظة: لكل اختيار ، يمكن تمييز آبار متعددة في نفس الوقت.
  2. تطبيع قيمة CI
    1. انقر بزر الماوس الأيمن على يمين علامة التبويب تحليل البيانات وحدد فهرس الخلية الطبيعي من المربع المنسدل المحور ص (الشكل 3 أ). في قسم المحور X في الأسفل ، حدد الوقت الطبيعي كآخر نقطة زمنية تم قياسها حيث تمت إزالة لوحة القطب الذهبي الدقيقة المتخصصة للعدوى (الشكل 3B).
      ملاحظة: تزيل عملية التطبيع التي يقوم بها البرنامج معظم التباين بسبب الاختلافات في بذر البئر والتعلق ، طالما أن نقطة التطبيع المختارة هي قبل إضافة الفيروس و / أو العلاج. ومن ثم ، يجب أن تكون النقطة الزمنية المثلى للتطبيع هي النقطة الزمنية الأخيرة قبل إضافة الفيروس و / أو العلاج. يمكن التحقق من النقطة الزمنية للتطبيع في علامة التبويب "جدول" ضمن Step_2. إجمالي الوقت المشار إليه هو النقطة الزمنية للتطبيع (الشكل 3C).
  3. تخطيط البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج RTCA
    1. في علامة التبويب تحليل البيانات ، حدد الآبار المراد إضافتها إلى الرسم البياني عن طريق تمييز الآبار والنقر فوق << إضافة. مؤشر الخلية الذي تمت تسويته مقابل الرسم البياني الزمني جاهز الآن للنسخ والتصدير. تأكد من وضع علامة في مربع الاختيار متوسط .
  4. تصدير البيانات باستخدام برنامج RTCA
    1. في الزاوية العلوية اليمنى من برنامج RTCA، انقر على اللوحة > تصدير معلومات التجربة.... حدد المربع لتحديد البيانات المراد تصديرها. انقر فوق موافق.
      ملاحظة: يمكن تصدير البيانات الأولية (قيم CI الأولية) عند تحديد فهرس الخلية > الكل .
    2. حدد المجلد لحفظ ملف التصدير. انقر على حفظ. ستظهر نافذة منبثقة تشير إلى تصدير المعلومات التجريبية. بمجرد الانتهاء من التصدير ، ستظهر نافذة أخرى تشير إلى أن معلومات التجربة المصدرة جاهزة للعرض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قبل الإصابة بفيروس زيكا ، كان CI المسجل لطبقة HUVEC أحادية الطبقة المستزرعة على صفيحة عيار دقيق مطلية بالذهب الدقيق أعلى من 8 ، مما يشير إلى خصائص الالتصاق القوية. يجب التخلص من الألواح أو الآبار ذات مؤشر CI أقل من 8. ثم أصيبت HUVECs بفيروس ZIKV عند MOI من 0.1 و 1 ، وتم تسجيل مقاومة الخلية لمدة 7 أيام. بدأت قيمة CI لمركبات HUVEC المصابة بفيروس ZIKV P6-740 عند MOI من 0.1 (الخط الأزرق الفاتح) في الانخفاض عند 15 ساعة بعد الإصابة (HPI) ، مقارنة بمكافحة العدوى السلبية (الخط البني; الشكل 4). أما ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

عادة ما ترتبط العدوى الفيروسية الخلوية في الخلايا المتساهلة بتغيرات كبيرة في مورفولوجيا الخلايا والتخليق الحيوي36. تعرف التغيرات المورفولوجية الخلوية التي يسببها الفيروس ، مثل تقلص الخلايا و / أو تضخم الخلايا و / أو تكوين الخلايا الاصطناعية ، أيضا باسم تأثيرات الاعتلال الخلوي (CPEs) ، المميزة لبعض أنواع العدوى الفيروسية37. في ECs ، تم وصف CPE بأنه تدمير الخلايا وانهيار التقاطعات الضيقة بين كل EC ، مما تسبب في انهيار الحاجز البطاني38,39

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تلقى هذا البحث دعما من وزارة التعليم العالي الماليزية في إطار برنامج مركز التميز للمؤسسات العليا (HICoE) (MO002-2019) والتمويل في إطار برنامج المنح البحثية طويلة الأجل (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN / F1 / 01/2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنبوب الطرد المركزيالدقيق عش615601
37 درجة ؛ حاضنة C مع 5٪ CO2SanyoMCO-18AIC
75 سم 2< / sup> قارورة ثقافة الأنسجة   ؛Corning430725U
محلول المضادات الحيوية البنسلين والستربتومايسين (P / S)Sciencell0503
خزانة السلامة البيولوجية ، الفئة الثانيةهولتنHB2448
الكولاجين من النوع 1SIgma-AldrichC3867
مكمل نمو الخلايا البطانية (ECGS)Sciencell1052
وسط الخلايا البطانية (ECM)ساينسل1001
لوحة إلكترونية 96شركة Agilent Technologies، Inc.05232368001
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Sciencell0025
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)Sigma-AldrichH9394
HemocytometerLaboroptik LTDNeubauer تحسين
الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs)Sciencell8000
المجهر المقلوبZEISSTELAVAL 31
Latitude 3520 LaptopDell -
ماصة دقيقة متعددة القنوات (10 - 100 وميكرو ؛ L)Eppendorf3125000036
ماصة دقيقة متعددة القنوات (30 - 300 & micro; L)Eppendorf3125000052
Reagent ReserviorReservior TarsonsT38-524090
RTCA المقاوم لوحة 96Agilent Technologies، Inc.05232350001
RTCA Software Pro (الإصدار 2.6.1)Agilent Technologies، Inc.5454433001
ماصات أحادية القناة (10 - 100 وميكرو؛ L)Eppendorf3123000047
ماصات أحادية القناة (100 - 1000 وميكرو؛ L)Eppendorf3123000063
ماصات أحادية القناة (20 - 200 & micro; L)Eppendorf3123000055
xCELLigence محلل الخلايا في الوقت الحقيقي SP (الموديل: W380)Agilent Technologies، Inc.00380601030https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

المراجع

  1. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
  2. Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
  3. Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
  4. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
  5. Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
  6. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690(2021).
  7. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  8. Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
  9. Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
  10. Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
  11. Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
  12. Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12(2012).
  13. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
  14. Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
  15. Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642(2019).
  16. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  17. Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517(2016).
  18. Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
  19. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
  20. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
  21. Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
  22. Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753(2022).
  23. Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
  24. Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
  25. Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603(2020).
  26. Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
  27. Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
  28. Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
  29. Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978(2021).
  30. Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
  31. Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
  32. Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126(2014).
  33. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  34. Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  35. Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
  36. Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S. Effects on cells. Medical Microbiology. 4th Edition. , (1996).
  37. Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
  38. Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
  39. Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A. Virus infection of endothelial cells. The Journal of Infectious Diseases. 143 (2), 266-273 (1981).
  40. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  41. Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579(2015).
  42. Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
  43. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
  44. Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
  45. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
  46. Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RTCA

مقالات ذات صلة