منذ ظهور أجهزة الكشف عن الإلكترون المباشر وتحسين البرامج والأجهزة ، أصبح الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) تقنية تسمح للباحثين بشكل روتيني بتحديد بنية الجزيئات الكبيرة إلى التفاصيل القريبة من الذرية1،2. تم تحفيز هذا التسارع من خلال سلسلة سريعة الخطى للغاية من التطورات الجديدة ، من إعداد العينات إلى جمع البيانات ومعالجتها. للسماح بإضفاء الطابع الديمقراطي على نطاق واسع لهذه التقنية لغير الخبراء ، تم إنشاء خطوط أنابيب أكثر كفاءة ويمكن الوصول إليها. اللافت للنظر ، بعد أقل من 10 سنوات من "ثورة الدقة" ، أصبح cryo-EM تقنية أساسية لتوصيف البروتين ، سواء في الأوساط الأكاديمية أو الصناعة3،4.
كان أحد أبرز جوانب مجتمع أبحاث cryo-EM هو الاستعداد لمشاركة البروتوكولات والاستراتيجيات والبرامج بشكل مفتوح5. وقد أسهم هذا الانفتاح في التكنولوجيا والخبرة إسهاما كبيرا في الوتيرة السريعة جدا للتنمية، ولكن بعض الاختناقات لا تزال تحول دون إمكانية الوصول إليها بشكل كامل. في مجموعة الطرق هذه ، نهدف إلى وصف بعض التطورات الحديثة في إعداد الشبكات المناسبة للتحليل الهيكلي بواسطة cryo-EM ، والتي تعد ، جنبا إلى جنب مع الوصول إلى أجهزة تحليل البيانات ، عنق الزجاجة الرئيسي للعديد من المشاريع. نناقش أيضا بروتوكولات جديدة قيد التطوير حاليا في هذا المجال ، لمناهج جديدة في تحليلات التبريد والانحرافيات.
كما هو مذكور أعلاه ، فإن أحد الاختناقات الحالية للتطبيق الروتيني ل cryo-EM في المختبر هو تحضير العينة. يمكن مواجهة العديد من المشكلات على مستوى تطبيق العينة على الشبكات: الأكثر شيوعا ، الاتجاه المفضل للعينة في الجليد ، وتمسخها في واجهة الهواء والماء. يعد حماية العينة من واجهة الهواء والماء أحد الحلول لهذه المشكلة ، باستخدام أغشية دعم من الكربون أو الجرافين تمنع العينة فعليا من ملامسة الهواء. لتسهيل تطبيق الأغشية الرقيقة على الشبكات ، طور de Martin Garrido et al.6 كتلة تعويم داعمة تنتجها طابعة ثلاثية الأبعاد تسمح بتطبيق قطرات صغيرة من الماء والعينة بطريقة خاضعة للرقابة. باستخدام هذه الكتلة ، يتم ترسيب طبقات الجرافين والكربون بطريقة غير مكلفة وسهلة الاستخدام.
هناك طريقة أخرى لمنع التلف في واجهة الهواء والماء وهي الحد من وقت تعرض البروتين للغلاف الجوي. لهذا الغرض ، تستخدم أداتان مختلفتان ، طورهما Klebs et al.7 و Budell et al.8 ، طرقا جديدة لإعداد الشبكة بسرعة (منخفضة تصل إلى 10 مللي ثانية) ، مما يقلل من احتمالية حدوث مشكلات في اتجاه الجسيمات. ميزة أخرى لهذه الأجهزة هي إمكانية إجراء تجارب تم حلها بمرور الوقت ، وهي حدود جديدة ومثيرة للدراسات الهيكلية.
في نهج متناقض ، أبلغ Nguyen et al.9 عن طريقة لتجميد الشبكات لتحليل cryo-EM في حالة عدم وجود أجهزة تجارية أو مخصصة ، والتي تكون إما مكلفة للغاية أو يصعب بناءها. إنها توضح كيف يمكن الحصول على شبكات ذات جودة مماثلة باستخدام جهاز رخيص محلي الصنع لا يتطلب أي أجهزة باهظة الثمن ، مما يساهم في إضفاء الطابع الديمقراطي على cryo-EM.
في cryo-EM ، لا تكون العينة ذات الأهمية دائما بروتينا ، ولكن يمكن أن تكون بدلا من ذلك جزيئا صغيرا أو نظاما بيولوجيا كبيرا مثل خلية كاملة. يعد إعداد مثل هذه العينات فريدا من نوعه ، ويتطلب خطوات محددة ، فضلا عن استراتيجيات مختلفة في جمع البيانات.
بالنسبة لحيود الإلكترون الجريزوبلوري (MicroED) ، فإن العينة المراد دراستها هي مادة كيميائية صغيرة توجد عادة على شكل مسحوق. يتم تطبيق المسحوق مباشرة على شبكة EM للحفاظ على شكل بلوري. ثم يتم جمع البيانات في وضع الحيود ، كما هو موضح من قبل Martynowycz و Gonen10. في المقابل ، تكون الخلايا بأكملها سميكة جدا لتحليل التبريد EM. لمعالجة هذا الأمر ، أبلغ Bisson et al. عن طريقة لاستخدام SEM للحفر المادي في مثل هذه العينة ، من أجل الحصول على أقسام رقيقة مناسبة للدراسات الهيكلية11.
من عينة إلى أخرى ، من المهم الاحتفاظ بسجل لكل خطوة من خطوات العملية حيث يتم تغيير العديد من المعلمات لكل عينة بروتين من تركيز البروتين إلى إعدادات المجهر وتحليل البيانات. وتحقيقا لهذه الغاية، طور Wypych et al.12 أداة لإدارة المعلومات على شبكة الإنترنت تتيح للمستخدمين تنظيم سير عملهم وتتبع جميع التفاصيل اللازمة للمنشورات في المستقبل. هذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص حيث أصبحت الأتمتة أكثر انتشارا في cryo-EM ، لا سيما في إعدادات الصناعة.
تقدمت Cryo-EM بوتيرة رائعة في العقد الماضي ، على جبهات الأجهزة والبرامج. ولضمان النشر الواسع النطاق لأفضل الممارسات، واعتماد أساليب جديدة على نطاق واسع، من الضروري وضع مجموعة شفافة من البروتوكولات. وسيساهم هذا العدد الخاص في هذا الجهد.