مقالة منهجية

عزل وتحليل النسخ لأنواع الخلايا النباتية

DOI:

10.3791/64913

⸱

أبريل 7, 2023

 ,  ,  , 
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تبشر جدوى وفعالية طرق scRNA-seq عالية الإنتاجية بعصر الخلية الواحدة في أبحاث النبات. يظهر هنا إجراء قوي وكامل لعزل أنواع معينة من خلايا جذر Arabidopsis thaliana وبناء مكتبة النسخ اللاحقة وتحليلها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الكائنات الحية متعددة الخلايا، يمكن أن تكون البرمجة التنموية والاستجابات البيئية متباينة للغاية في أنواع الخلايا المختلفة أو حتى داخل الخلايا، وهو ما يعرف بعدم التجانس الخلوي. في السنوات الأخيرة ، أصبح عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية جنبا إلى جنب مع تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) أدوات مهمة لدراسة العمليات البيولوجية بدقة خلية واحدة. ومع ذلك، فإن عزل الخلايا النباتية أكثر صعوبة نسبيا بسبب وجود جدران الخلايا النباتية، وهو ما يحد من تطبيق نهج الخلية الواحدة في النباتات. يصف هذا البروتوكول إجراء قويا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) القائم على عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية مع الخلايا النباتية ، وهو مناسب للتحليل متعدد الأوميكس المصب والدراسات الأخرى. باستخدام خطوط علامات الفلورسنت الجذرية Arabidopsis ، نوضح كيف يتم عزل أنواع معينة من الخلايا ، مثل خلايا pericycle ذات قطب الخشب ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي ، وخلايا القشرة ، وخلايا الأديم الباطن. علاوة على ذلك ، يتم أيضا توفير طريقة فعالة لتحليل النسخ النهائي باستخدام Smart-seq2. يمكن تكييف طريقة عزل الخلايا وتقنيات تحليل النسخ مع أنواع الخلايا والأنواع النباتية الأخرى ولها إمكانات تطبيق واسعة في علوم النبات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا هي الوحدة الأساسية لجميع الكائنات الحية وتؤدي وظائف هيكلية وفسيولوجية. على الرغم من أن الخلايا في الكائنات متعددة الخلايا تظهر تزامنا واضحا ، إلا أن الخلايا من أنواع مختلفة وخلايا فردية تظهر اختلافات في نسخها أثناء التطور والاستجابات البيئية. يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية عالي الإنتاجية (scRNA-seq) قوة غير مسبوقة لفهم عدم التجانس الخلوي. ساهم تطبيق scRNA-seq في علوم النبات في بناء أطلس الخلايا النباتية1 بنجاح ، وقد تم استخدامه لتحديد الأصناف الخلوية النادرة في الأنسجة النباتية2 ، وقدم نظرة ثاقبة لتكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية ، وتم استخدامه لتحديد الهوية الخلوية والوظائف المهمة المستخدمة أ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحسين البروتوكول التالي لبذور A. thaliana من النوع البري (WT) بدون خطوط مضان وعلامات فلورية لأنواع الخلايا الجذرية التالية: خلايا pericycle قطب نسيج الخشب (J0121) ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي (J3411) ، وخلايا الأدمة الداخلية والقشرة (J0571) (الشكل 1A). تم الحصول على جميع خطوط العلامات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد) ، باستثناء خط علامة خلية بدء الجذر الجانبي ، والذي تم إنشاؤه عن طريق إدخال بنية GFP مدفوعة بمحفز GATA23 في نبات أرابيدوبسيس من النوع البري بعد تقرير نشرسابقا 14.

1. تحضير المواد النباتية

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل البروتوبلاست
هذا البروتوكول فعال لفرز البروتوبلاست لخطوط علامة الجذر الفلورية A. thaliana. تم تطوير خطوط العلامات هذه عن طريق اندماج البروتينات الفلورية مع الجينات المعبر عنها على وجه التحديد في أنواع الخلايا المستهدفة ، أو باستخدام خطوط مصيدة المحسن (الشكل 1). تم تشريح العديد من الأنسجة والأعضاء إلى أنواع خلايا تعبر عن علامات فلورية محددة في النباتات والمحاصيل النموذجية.

محتوى FACS والخلايا التي تم فرزها ومراقبة الجودة للم.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن للبروتوكول المستند إلى Smart-seq2 إنشاء مكتبات تسلسل موثوقة من عدة مئات من الخلايا8. جودة المواد الأولية ضرورية لدقة تحليل النسخ. FACS هو أداة قوية لإعداد الخلايا ذات الأهمية ، ولكن يجب تحسين هذا الإجراء ، وخاصة خطوة protoplasting ، لتطبيقات النبات. يمكن أيضا استخدام التشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM) أو خلايا التشريح اليدوي كمدخل25,26 ، لذلك يمكن استخدام البروتوكول المقدم هنا في مجموعة متنوعة من الأنواع النباتية وأنواع الخلايا مع أ.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنشأنا هذا البروتوكول في منشأة متعددة الخلايا أحادية الخلية تابعة لكلية الزراعة والبيولوجيا ، جامعة شنغهاي جياو تونغ ، وتم دعمنا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 32070608) ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (المنحة رقم 20PJ1405800) ، وجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم المنحة Agri-X20200202 ، 2019TPB05).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 وميكرو ؛ م مصفاةSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
محلل شظايا رشيقAglientAglient 5200
مجموعة الحمض النووي عالية الحساسيةAglientDNF-474-0500
حبات Ampure XPBECKMANA63881
BetaineyuanyeS18046-100g
مبيضالسيد العضلاتFnBn83BK20٪ (v / v) مبيض
BSAsigma9048-46-8
CaCl 2< / sub>yuanyeS24109-500g
Cellulase R10Yakult (اليابان)9012-54-8
Cellulase RSYakult (اليابان)9012-54-8
أنبوب الطرد المركزي (1.5 مل)Eppendolf30121589
DNase و RNase و DNA و RNA بعيدا عن الملوثات السطحيةBeyotimeR0127
dNTPs (10 ملم)NEBN0447S
DTT (0.1 م)
invitrogen		18090050
الإيثانولSinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd100092680
FACSBD FACS ميلوديBD-65745
FACSسونيSH800S
طرف المرشح  (1000 وميكرو ؛ L)طرف مرشح Thermo ScientificTF112-1000-Q
  ؛ (200 وميكرو ؛ L)Thermo ScientificTF140-200-Q
(10 & micro ؛ L)Thermo ScientificTF104-10-Q
(100 & micro ؛ L)Thermo ScientificTF113-100-Q
مجهر الفلورسنتنيكونEclipse Ni-E
خلاط دوار رباعي الأبعادKylin -BellBE-1100
Hemicellulasesigma9025-56-3
IS PCR التمهيدي5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix ( 2X)Roche 7958935001
KClSinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (اليابان)9032-75-1
حامل الفصل المغناطيسيinvitrogen12321D
Mannitolaladdin69-65-8
MESعلاء الدين145224948
MgCl2< / sub> yuanyeR21455-500 مل
أجهزة الطرد المركزي الدقيقةEppendorfالطرد المركزي 5425
أجهزة الطرد المركزي الصغيرةالصغيرة Titan Timi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT DNA مكتبة إعدادكيت illuminaFC-131-1024
oligo-dT30VN التمهيدي5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'PCR
أداةThermal cyclerA24811
PectolyaseYakult (اليابان)9033-35-6
خطوط علامات النباتمركز مخزون نوتنغهام أرابيدوبسيس (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitinvitrogenQ33231
Qubit 2.0 مقياس الفلورinvitrogenQ32866
RNase inhibitor محلول 10977023 المنشط المائي الخالي من Thermo Scientific
RNase
(ث / ع) هيميسيلولاز ، 0.5٪   ؛ (ث / ف) بكتوليز و 1 ٪ & nbsp ؛ (وزن / حجم) Macerozyme R10 في كمية جديدة من المحلول مصفاة
453463مدقة معقمةBIOTREAT
(40 & micro; م )Sorfa 251100
SuperScript IV النسخ العكسي (200 U/µ L)invitrogen18090050
SuperScript IV عازلة (5x)invitrogen18090050
أنبوب اختبار (5 مل)BD Falcon352052
أنابيب PCR رقيقة الجدران مع أغطية (0.5 مل)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO التمهيدي5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'Vortex
TitanVM-T2
طرف مرشح طرف مرشح EO0382 A 400 ملي مولار مانيتول ، 0.05٪ BSA ، 20 ملي مولار MES (الرقم الهيدروجيني 5.7) ، 10 ملي كالسيكلوريد < الفرعي >2< / فرعي > ، 20 ملي مولار KCl محلول ب 1٪ (وزن / حجم) السليولاز R10 ، 1٪ (وزن / حجم) السليولاز RS ، 1٪ & nbsp ؛

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
  2. Denyer, T., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Smart seq2

مقالات ذات صلة