نصف هنا طريقة قائمة على التألق المناعي لتحديد مستويات الحمض النووي أحادي الشريط في الخلايا. يمكن استخدام هذه الطريقة الفعالة والقابلة للتكرار لفحص إجهاد النسخ المتماثل ، وهي سمة شائعة في العديد من سرطانات المبيض. بالإضافة إلى ذلك ، يتوافق هذا الفحص مع خط أنابيب التحليل الآلي ، مما يزيد من كفاءته.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس إجهاد النسخ المتماثل في خلايا سرطان المبيض باستخدام التألق المناعي للحمض النووي أحادي الشريط
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إجهاد النسخ المتماثل هو السمة المميزة للعديد من سرطانات المبيض. يمكن أن ينشأ إجهاد النسخ المتماثل من مصادر متعددة ، بما في ذلك فواصل الشريط المزدوج ، أو تعارضات النسخ والتكرار ، أو تضخم الجينات المسرطنة ، مما يؤدي حتما إلى توليد الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA). وبالتالي ، فإن القياس الكمي ل ssDNA يمثل فرصة لتقييم مستوى إجهاد النسخ المتماثل في أنواع الخلايا المختلفة وتحت ظروف أو علاجات مختلفة مدمرة للحمض النووي. تشير الأدلة الناشئة أيضا إلى أن ssDNA يمكن أن يكون مؤشرا على الاستجابات لأدوية العلاج الكيميائي التي تستهدف إصلاح الحمض النووي. هنا ، نصف منهجية مفصلة قائمة على التألق المناعي لتحديد ssDNA. تتضمن هذه المنهجية تسمية الجينوم بنظير ثيميدين ، يليه الكشف القائم على الأجسام المضادة للتناظرية في الكروماتين في ظل ظروف عدم تغيير طبيعة الجينوم. يمكن تصور امتدادات ssDNA كبؤر تحت مجهر مضان. يرتبط عدد وشدة البؤر ارتباطا مباشرا بمستوى ssDNA الموجود في النواة. نصف أيضا خط أنابيب آلي لتحديد إشارة ssDNA. الطريقة سريعة وقابلة للتكرار. علاوة على ذلك ، فإن بساطة هذه المنهجية تجعلها قابلة للتطبيقات عالية الإنتاجية مثل الأدوية والشاشات الجينية.
المقدمة
كثيرا ما يتعرض الحمض النووي الجينومي لاعتداءات متعددة من مصادر داخلية وخارجيةمختلفة 1. يرتبط تواتر الضرر الداخلي ارتباطا مباشرا بمستويات المنتجات الثانوية الأيضية ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية أو الألدهيدات ، والتي تكون أعلى جوهريا في أنواع متعددة من السرطان ، بما في ذلك سرطانات المبيض 2,3. من الضروري حل تلف الحمض النووي بكفاءة. خلاف ذلك ، يمكن أن تعزز الآفات السمية الجينية ، وبالتالي ، الطفرات. تعتمد قدرة الخلايا على إصلاح الآفات السامة للجينات على وظائف مسارات إصلاح الحمض النووي الخالية من الأخطاء والتنظيم الفعال لتطور دورة الخلية استجابة لتلف الحمض النووي. والجدير بالذكر أن العديد م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم استخدام خط خلايا سرطان المبيض ، OVCAR3 ، في هذه الخطوات ، ولكن هذا البروتوكول ينطبق على نطاق واسع على خطوط خلايا أخرى متعددة ، بما في ذلك تلك المشتقة من مصادر غير مبيضية. يظهر رسم تخطيطي للبروتوكول في الشكل 2.
1. تصفيح الخلايا
- اصنع أغطية مغلفة بولي-L-lysine.
- أضف أغطية معقمة بقطر 12 مم إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل بمحلول بولي-إل-ليسين ، وضعها على كرسي متأرجح لمدة 15 دقيقة.
- نضح الحل في غطاء زراعة الأنسجة. اغسل أغطية الغطاء بإضافة الماء المعقم ، وضع الأنبوب الذي يحتوي على أغطية الأغطية مرة أخرى على الروك لمدة 5 دقائق. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات.
- ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 4 الصور التمثيلية والقياس الكمي لبؤر IdU من النوى المشتقة من الخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة ب 0.5 mM هيدروكسي يوريا لمدة 24 ساعة. كلتا النواتين ملطختان ويمكن التعرف عليهما في قناة DAPI. يتكون تحليل هذه الصور من تحديد عدد البؤر في كل نواة. عدد البؤر يتناسب مع درجة إجهاد النسخ المتماثل.
الشكل 1
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كما ذكر في البروتوكول ، من المفيد تضمين بعض الضوابط التجريبية لضمان عمل الفحص. وتشمل هذه العينة التي لا تعالج ب IdU بالإضافة إلى عينة معالجة بالأجسام المضادة الأولية. يجب أن ينتج عن كلا العنصرين السلبيين خلايا ملطخة بواسطة DAPI ولكنها لا تحتوي على إشارة IdU.
بناء على الظروف التجريبية وخطوط الخلايا المستخدمة ، قد تكون هناك حاجة إلى تخفيفات مختلفة للأجسام المضادة للحصول على أفضل إشارة فلورية. قد يؤدي الكثير من الإشارة إلى عدم القدرة على تحديد البؤر الفردية ، في حين أن الإشارة القليلة جدا قد تعني.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
يتم دعم PV من خلال منحة Pedal the Cause الافتتاحية من قبل مركز Alvin J. Siteman للسرطان من خلال مؤسسة مستشفى بارنز اليهودي ، ومنحة الأبحاث التجريبية من مركز مارشا ريفكين لأبحاث سرطان المبيض ، ومنحة أبحاث السرطان من مؤسسة ماري كاي آش ومؤسسة V. يتم دعم NR من خلال منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة على الخلايا والبيولوجيا الجزيئية T32 لجامعة واشنطن ، سانت لويس.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3٪ بارافورمالدهيد (PFA) | فيشر Scientific | NC0179595 | 10 جم سكروز + 100 مل 10X PBS + ماء ليصل الحجم إلى 925 مل. أضف 75 مل 40٪ من PFA الخالي من الميثانول ، واخلطه ، واصنع كميات 50 مل قبل التخزين التخزين: يخزن في -20 درجة ؛ C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 جم / مول. لمخزون 10 ملم: قم بإذابة 3.541 مجم IdU إلى 1 مل 1 نيوتن من الأمونيا السائلة التخزين: مخزنة في -20 درجة ؛ C |
| الأجسام المضادة المضادة ل BrdU | BD Biosciences | 347580 | التخزين: تخزينها في 4 درجات ؛ C |
| المضاد للفأر Alexa Fluor Plus 488 الجسم المضاد الثانوي | Thermo Scientific | A32766 | حساس للضوء - يحفظ في الظلام التخزين: يخزن في 4 درجات ؛ ألبومين |
| مصل الأبقار C (BSA) | سيجما ألدريتش | A7906-100G | مصنوع عن طريق إضافة كتلة محددة إلى حجم PBS التخزين: يخزن في 4 درجات ؛ C |
| غطاء دائري زجاج | علوم المجهر الإلكتروني | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | نيكون | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | وسائط النمو: RPMI مكمل ب L-glutamine ، 0.01 مجم / مل من الأنسولين البقري ؛ مصل الأبقار الجنيني إلى تركيز نهائي بنسبة 20٪ و 1X Pen Strep التخزين: وسائط التجميد: وسائط النمو + 5٪ DMSO ومخزنة في -80 درجة ؛ حل C |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P4832-50ML | التخزين: تخزينه في 4 درجات ؛ حامل C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant مع DAPI | Thermo Scientific | P36962 | التخزين: تخزينه في 4 درجات ؛ C |
| Trypsin-EDTA ، 0.25٪ | Genesee Scientific | 25-510 | التخزين: تخزينها في 4 درجات ؛ C |
| Water ، معقم مصفى | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | التخزين: تخزينه في 4 درجات ؛ ج |
المراجع
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamen....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
