مقالة منهجية

توليد وصيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالرئيسيات المشتقة من البول

DOI:

10.3791/64922

⸱

يوليو 28, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي طريقة لعزل وتوسيع وإعادة برمجة الخلايا المشتقة من بول الرئيسيات البشرية وغير البشرية إلى الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، بالإضافة إلى تعليمات للصيانة الخالية من المغذيات للخلايا الجذعية المستحثة حديثا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد الأساليب عبر الأنواع التي تدرس الخلايا الجذعية متعددة القدرات للرئيسيات ومشتقاتها ضرورية لفهم الآليات الجزيئية والخلوية للمرض والتطور والتطور بشكل أفضل. لجعل الوصول إلى الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الرئيسيات (iPSCs) أكثر سهولة ، تقدم هذه الورقة طريقة غير جراحية لتوليد iPSCs من الرئيسيات البشرية وغير البشرية من الخلايا المشتقة من البول ، وصيانتها باستخدام طريقة زراعة خالية من التغذية.

يمكن أخذ عينات من البول من بيئة غير معقمة (على سبيل المثال ، قفص الحيوان) ومعالجتها بكوكتيل مضاد حيوي واسع الطيف أثناء زراعة الخلايا الأولية لتقليل التلوث بكفاءة. بعد انتشار الخلايا المشتقة من البول ، يتم إنشاء iPSCs بواسطة طريقة نقل معدلة لنظام ناقل فيروس سينداي المتاح تجاريا. قد تكون مستعمرات iPSC الأولى مرئية بالفعل بعد 5 أيام ، ويمكن قطفها بعد 10 أيام على أقرب تقدير. يدعم تمرير التكتل الروتيني مع مخزن مؤقت للتفكك الخالي من الإنزيم تعدد قدرات iPSCs المتولدة لأكثر من 50 مقطعا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد المقارنات الجينومية للرئيسيات البشرية وغير البشرية (NHPs) ضرورية لفهم تاريخنا التطوري وتطور السمات الخاصة بالإنسان1. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح هذه المقارنات بالاستدلال على الوظيفة من خلال تحديد تسلسلات الحمض النووي المحفوظة2 ، على سبيل المثال ، لتحديد أولويات المتغيرات المرتبطة بالمرض3. تعد مقارنات الأنماط الظاهرية الجزيئية مثل مستويات التعبير الجيني ضرورية لتفسير المقارنات الجينومية بشكل أفضل واكتشاف ، على سبيل المثال ، اختلافات النمط الظاهري الخلوي. علاوة على ذلك ، لديهم - على غرار المقارنات على مستوى الحمض النووي - القدرة على استنتاج الأهمية الوظيفية ، وبالتالي تفسير التباين ذي الصلة طبيا بشكل أفضل داخل البشر4. يتطلب دمج بيانات النمط الظاهري الجزيئي الشاملة في هذه الدراسات المقارنة موارد بيولوجية مناسبة (أي خلايا متعامدة عبر الأنواع). ومع ذلك ، فإن الأسباب الأخلاقية والعملية تجعل من الصعب أو المستحيل الوصول إلى مثل هذه الخلايا المماثلة ، خاصة أثناء التطوير. تسمح الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) بتوليد أنواع الخلايا التي يتعذر الوصول إليها في المختبر 5,6 ، ويمكن الوصول إليها تجريبيا ، وقد تم استخدامها لمقارنات الرئيسيات 6،7،8،9،10،11،12،13،14.

لتوليد iPSCs ، يحتاج المرء إلى الحصول على الخلايا الأولية لإعادة برمجتها. تتمتع الخلايا المعزولة من البول بميزة أنه يمكن أخذ عينات منها بشكل غير جراحي من الرئيسيات ، وأنه يمكن إعادة برمجتها بسهولة ، ربما بسبب الملامح الجزيئية الشبيهة بالخلايا الجذعية15. ظروف الاستزراع للحفاظ على iPSCs الرئيسيات لا تقل أهمية عن إعادة البرمجة. من الناحية الكلاسيكية، تتطلب زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وسيطا غير محدد قائم على المصل وزراعة مشتركة للخلايا الليفية الجنينية للفأر - ما يسمى بالخلايا المغذية - التي توفر العناصر الغذائية الأساسية وسقالة للخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)16. منذ تطوير أنظمة الاستزراع المحددة كيميائيا والخالية من التغذية17,18 ، هناك الآن خيارات مختلفة لوسائط ومصفوفات الاستزراع iPSC المتاحة تجاريا. ومع ذلك ، فقد تم تحسين معظم ظروف الثقافة هذه ل ESCs البشرية و iPSCs ، وبالتالي قد تعمل بشكل أقل جودة في ثقافة NHP iPSC. في بروتوكول الفيديو هذا ، نقدم تعليمات لإنشاء وصيانة iPSCs البشرية و NHP المشتقة من زراعة الخلايا البولية.

منذ التقرير الأول لتوليد iPSC عن طريق التعبير القسري لعوامل محددة في الخلايا الليفية في عام 2006 ، تم تطبيق هذه الطريقة على العديد من أنواع الخلايا المختلفة من أصول مختلفة19،20،21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31، 32. من بينها ، يمكن الحصول على الخلايا المشتقة من البول فقط بطريقة غير جراحية تماما. استنادا إلى البروتوكول الموصوف سابقا من قبل Zhou et al.33 ، يمكن للمرء عزل وتوسيع الخلايا من بول الرئيسيات حتى من العينات غير المعقمة ، عن طريق استكمال المضادات الحيوية واسعة الطيف15. والجدير بالذكر أن الخلايا المشتقة من البول التي تم أخذ عينات منها بواسطة هذا البروتوكول تظهر إمكانات عالية لإنتاج iPSCs ، في غضون فترة زمنية أقصر (تصبح المستعمرات مرئية في 5-15 يوما) من إعادة البرمجة التقليدية للخلايا الليفية (20-30 يوما ، في تجربتنا) ، وبمعدل نجاح مرتفع بما فيه الكفاية. تم تصنيف هذه الخلايا المشتقة من البول على أنها مجموعة مختلطة من الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية الوسيطة والخلايا الظهارية للمثانة ، مما تسبب في كفاءة إعادة برمجة عالية15.

بالإضافة إلى الاختلاف في الخلايا الأولية ، تختلف طرق إعادة البرمجة لإنشاء iPSCs أيضا وفقا للغرض من الاستخدام. تم تنفيذ إجراءات إعادة البرمجة التقليدية للخلايا الجسدية البشرية من خلال الإفراط في التعبير عن عوامل إعادة البرمجة مع ناقلات الفيروسات القهقرية أو الفيروسات العدسية ، مما سمح بدمج الحمض النووي الخارجي في الجينوم5،34،35. للحفاظ على iPSCs المتولدة سليمة جينيا ، طور الباحثون مجموعة متنوعة من الأنظمة غير التكاملية - ناقل PiggyBac القابل للاستئصال 36,37 ، الناقل العرضي38,39 ، نواقل الفيروسات غير المدمجة مثل فيروس سينداي 40 والفيروس الغدي 41 ، نقل mRNA 42 ، نقل البروتين 43,44 ، ومعالجة المركبات الكيميائية 45. نظرا للكفاءة وسهولة التعامل ، يتم استخدام ناقلات إعادة البرمجة المستندة إلى فيروس Sendai في هذا البروتوكول. يتم إجراء إصابة الخلايا الأولية في ثقافة تعليق 1 ساعة من الخلايا والفيروسات في تعدد العدوى (MOI) من 5 قبل الطلاء. يمكن أن تزيد هذه الخطوة المعدلة من احتمالية الاتصال بين أسطح الخلايا والفيروسات ، مقارنة بالطريقة التقليدية التي تضاف فيها الفيروسات مباشرة إلى ثقافة الخلايا الملتصقة ، وبالتالي تنتج المزيد من مستعمرات iPSC15.

يمكن إجراء تمرير الخلايا الجذعية البشرية و NHP متعددة القدرات عن طريق تمرير التكتل وتمرير الخلية الواحدة. حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) هو عامل مخلب فعال من حيث التكلفة يربط أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم ، وبالتالي يمنع النشاط الملتصق للكاديرين والانتغرين. يستخدم EDTA أيضا ككاشف تفكك انتقائي خفيف ، حيث تنفصل الخلايا غير المتمايزة قبل الخلايا المتمايزة بسبب جزيئات الالتصاق المختلفة. يؤدي التفكك الكامل إلى موت الخلايا الهائل ل iPSCs الرئيسيات عبر الملف الملفوف المرتبط ب Rho / Rho الذي يحتوي على بروتين كيناز (Rho / Rock) بوساطة فرط تنشيط الميوسين. لذلك ، فإن استكمال وسط الاستزراع بمثبط Rho / Rock ضروري للتجارب التي تتطلب خلايا مفردة في تعليق46,47. في هذا البروتوكول ، نوصي بتمرير التكتل كطريقة مرور روتينية ونوصي بتمرير خلية واحدة فقط عندما يكون ذلك ضروريا ، على سبيل المثال ، عندما يكون البذر لأرقام الخلايا المحددة مطلوبا ، أو أثناء الاستنساخ الفرعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذا الإجراء التجريبي من قبل لجنة الأخلاقيات المسؤولة عن التجارب البشرية (20-122 ، Ethikkommission LMU München). تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.
ملاحظة: يجب الحصول على الموافقة من اللجنة الأخلاقية المناسبة قبل البدء في التجارب التي تتعامل مع العينات البشرية و NHP. يجب تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للإرشادات واللوائح ذات الصلة. يجب تنفيذ كل خطوة من الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. يمكن العثور على جميع المخزن المؤقت وتركيبات الوسائط في الجدول التكميلي S1. تأكد من تسخين جميع الوسائط إلى درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية) قبل إضافتها إلى الخلايا. يجب إجراء كل خطوة من خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة ، ما لم يذكر خلاف ذلك.

1. عزل الخلايا من عينات البول

تنبيه: تأكد من خلو المتبرعين من البشر من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) وفيروس التهاب الكبد B (HBV) وفيروس التهاب الكبد C (HCV). بالنسبة ل NHPs ، تأكد من خلو المتبرعين / الخلايا المحتملة من مسببات الأمراض المحددة - فيروس B (BV) وفيروس نقص المناعة Simian (SIV) وفيروس Simian Betaretrovirus (SRV) وفيروس Simian T Cell Lymphotropic (STLV).

  1. قم بإعداد صفيحة 12 بئرا مغلفة بالجيلاتين عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الجيلاتين 0.2٪ لكل بئر ، وتوزيع السائل عن طريق تحريك اللوحة. ضعه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الحاجة.
  2. جمع عينات البول البشري في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. بالنسبة للقرود ، اجمع البول من أرضية المنشأة الحيوانية باستخدام حقنة.
    ملاحظة: ثبت أن حجم 5 مل من البول كاف لعزل مستعمرة واحدة على الأقل في 42٪ من المحاولات. ومع ذلك ، يوصى باستخدام حجم أكبر من ~ 50 مل من البول لزيادة فرصة عزل المستعمرات. يجب أخذ عينات من بول NHP طازجة قدر الإمكان ، ويفضل أن يكون ذلك بعد التبول مباشرة. لم يكن لتخزين عينات البول عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات أي تأثير سلبي على معدل نجاح البروتوكول ، ولكن لم يتم اختبار أوقات التخزين الأطول.
  3. جهاز طرد مركزي الأنبوب المحتوي على البول عند 400 × غرام لمدة 10 دقائق ، ونضح بعناية المادة الطافية ، وترك حوالي 1 مل في الأنبوب.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل المتبقية من السائل. قم بتجميع المعلقات في أنبوب واحد إذا تم جمع أنابيب متعددة من البول.
  5. اغسل الخلايا بإضافة 10 مل من محلول غسيل البول (انظر الجدول التكميلي S1) الذي يحتوي على 2.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين إلى الأنبوب ، واخلط المعلق بعناية باستخدام ماصة مصلية.
  6. قم بطرد الأنبوب عند 200 × جم لمدة 10 دقائق ، واستنشق بعناية المادة الطافية ، تاركا حوالي <0.2 مل في الأنبوب.
  7. إعادة تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط البول الأولي (انظر الجدول التكميلي S1) الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين لكل 50 مل من البول المعالج في البداية (يعاد تعليقه في 1 مل ، حتى لو تمت معالجة أقل من 50 مل من البول).
  8. نضح الجيلاتين من الآبار (أعدت في الخطوة 1.1) ، ولوحة 1 مل من التعليق من الخطوة 1.7 في بئر واحد من لوحة 12 بئر. كرر لأكبر عدد ممكن من الآبار حسب الرغبة ، أو لأكبر عدد ممكن من الملليلترات من التعليق المتاح.
    اختياري: لتجنب التلوث الناجم عن جمع العينات غير الصحية ، أضف 100 ميكروغرام / مل من الكاشف المضاد للميكروبات إلى الخلايا من الآن فصاعدا ، حتى الممر الأول.
  9. ضع اللوحةفي حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 5٪.
  10. أضف 1 مل من وسط البول الأساسي لكل بئر يوميا حتى اليوم 5 ، دون إزالة الوسط الموجود.
  11. في اليوم 5 ، نضح 4 مل من الوسط من اللوحة ، تاركا حوالي 1 مل من الوسط. أضف 1 مل من وسط REMC (انظر الجدول التكميلي S1) لكل بئر للحصول على خليط 1: 1 مع وسط الاستزراع الجديد.
  12. استبدل نصف الوسط بوسط REMC كل يوم حتى تظهر المستعمرات الأولى (الشكل 1 أ ، ب). لذلك ، قم بإزالة 1 مل من الوسط القديم ، وأضف 1 مل من وسط REMC الطازج لكل بئر.

2. توسيع الخلايا البولية

ملاحظة: يجب إجراء مرور الخلايا البولية قبل أن تصل الثقافة إلى التقاء 90٪.

  1. قم بإعداد الكمية المطلوبة من ألواح 12 بئرا المطلية بالجيلاتين ، كما هو مذكور في الخطوة 1.1.
  2. نضح الوسط القديم ، وغسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات في Dulbecco (DPBS).
  3. نضح DPBS ، وإضافة 300 ميكرولتر من إنزيم التفكك 0.5x المخفف مع DPBS. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. أضف 700 ميكرولتر من وسط REMC لإيقاف التفاعل الأنزيمي. ماصة التعليق برفق باستخدام ماصة P1000 حتى يتم فصل الخلايا إلى خلايا مفردة.
  5. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل ، والطرد المركزي الأنبوب في 200 × غرام لمدة 5 دقائق.
  6. قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط REMC.
  7. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا (مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي).
  8. لتوسيع الخلايا البولية ، لوحة 1.5 × 10 4 إلى 3 × 104 خلايا في 1 مل من وسط REMC في لوحة واحدة ذات 12 بئرا مغطاة ب 0.2٪ جيلاتين.
  9. قم بإجراء تغييرات متوسطة لاحقة كل يوم حتى تصل الثقافة إلى التقاء 80٪ -90٪. لذلك ، قم بنضح الوسط القديم وأضف 1 مل من وسط REMC الطازج.

3. توليد iPSCs بواسطة عدوى ناقل فيروس سينداي

ملاحظة: للاطلاع على سير عمل إجراء إعادة البرمجة، انظر الشكل 2 أ. يجب أن تكون الخلايا البولية المستخدمة لإعادة البرمجة صغيرة قدر الإمكان ، ولكن لا يلاحظ فقدان ملحوظ في كفاءة إعادة البرمجة قبل المرور 4. يجب استخدام مجموعة أدوات إعادة برمجة فيروسات سينداي في منشأة BL-2. تعامل مع الفيروسات تحت خزانة السلامة البيولوجية مع التدفق الصفحي ، واستخدم دائما معدات السلامة المناسبة لمنع التعرض للغشاء المخاطي.

  1. قم بإعداد صفيحة 12 بئرا مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر ، وتوزيع السائل عن طريق تحريك اللوحة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل ، واستبدل مصفوفة الغشاء القاعدي ب 900 ميكرولتر من وسط REMC. يخزن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. قم بإذابة مكونات مجموعة Sendai Reprogramming Kit بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. امزج فيروسات سينداي (polycistronic KLF4-OCT3 / 4-SOX2 و cMYC و KLF4) مع MOI من 5 ، وأضف وسيط REMC حتى 100 ميكرولتر. استخدم المعادلة (1):
    حساب صيغة حجم الفيروس ، طريقة وزارة الداخلية ، معادلة تطبيقات دراسة الخلايا.
    ملاحظة: نظرا لاختلاف عيار الفيروس بين الدفعات ، تحقق دائما من العيار في شهادة التحليل التي توفرها الشركة المصنعة.
    اختياري: استخدم بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) فيروس سينداي بالإضافة إلى ذلك كعنصر تحكم إيجابي لكفاءة النقل. لهذا ، قم بإعداد 3.5 × 104 خلايا إضافية في أنبوب منفصل خلال الخطوة 3.3.
  3. لتفكك الخلايا البولية ، اتبع الخطوات 2.2-2.4. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا ، وانقل 7 × 104 خلايا بولية إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
  4. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية دون تعطيل حبيبات الخلية. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من خليط SeV المحضر في الخطوة 3.2. احتضان الأنبوب لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية لعدوى التعليق.
  5. لوحة التعليق على لوحة الغشاء القاعدي المغلفة بمصفوفة 12 بئرا التي تم إعدادها في الخطوة 3.1. بشكل روتيني ، اللوحة 1 × 10 4 و 2.5 × 104 خلايا لكل بئر في التكرارات.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استبدل الوسط ب 1 مل من وسط REMC الطازج بعد 24 ساعة من النقل وفي اليوم 3.
  7. في اليوم 5 بعد التحويل ، قم بتغيير الوسيط إلى وسيط توليد PSC (انظر الجدول التكميلي S1) ، مع تغييرات وسيطة لاحقة كل يومين. لذلك ، قم بإزالة الوسط القديم وإضافة 1 مل من وسيط توليد PSC لكل بئر.
    ملاحظة: قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 15 يوما حتى تظهر المستعمرات الأولى.
  8. اختر مستعمرات iPSC الفردية عندما يتجاوز حجم المستعمرة 1 مم. للقيام بذلك ، كشط وجمع بعناية مستعمرة واحدة مع ماصة p10 تحت المجهر. نقل المستعمرة إلى بئر جديد من صفيحة 12 بئرا مغطاة بمصفوفة غشاء قاعدي تحتوي على 750 ميكرولتر من وسط زراعة PSC.
    اختياري: شطف اللوحة باستخدام DPBS ومعالجتها لمدة 1 دقيقة باستخدام 0.5 mM EDTA قبل الانتقاء يمكن أن يدعم الثقافة القوية لمزيد من الخطوات. إذا كان سيتم استزراع الخلايا لفترة أطول لانتظار المستعمرات الناشئة لاحقا ، فلا تقم بإجراء خطوة علاج EDTA هذه.
  9. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 مع تغييرات متوسطة لاحقة كل يوم ، كما هو مذكور في القسم 4 من البروتوكول. عندما تصل المستعمرة المنتقاة إلى قطر 2 مم ، استمر في المرور الروتيني iPSC ، كما هو موضح في القسم 5 من البروتوكول.

4. تغيير متوسط

ملاحظة: يجب تغيير وسط الاستزراع كل يوم حتى تنمو المستعمرات بشكل كبير بما يكفي للمرور.

  1. نضح الوسط القديم وأضف 750 ميكرولتر من الوسط الطازج لكل طبق من 12 بئرا. للتبديل إلى نوع مختلف من الوسائط ، استبدل الوسيط بعد 1 يوم على الأقل من المرور.

5. المرور

ملاحظة: يجب تمرير الخلايا عندما تنمو مستعمرات iPSC كبيرة بما يكفي (قطرها > 2 مم) ، أو عندما تكون المستعمرات على وشك لمس بعضها البعض. بشكل روتيني ، يمكن تقسيم iPSCs كل 5 أيام تقريبا. استخدم تمرير التكتل (الخطوة 5.1) للصيانة الروتينية ، وتمرير الخلية الواحدة (الخطوة 5.2) للتجارب التي تتطلب عددا محددا من الخلايا. في حالة اختلاف iPSCs كثيرا ، يمكن أن يساعد قطف المستعمرات (الخطوة 5.3) في تحسين نقاء الثقافات.

  1. التكتل العابر
    1. قم بإعداد صفيحة 12 بئرا مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر ، وتوزيع السائل عن طريق تحريك اللوحة. احتضان اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. استبدل مصفوفة الغشاء القاعدي ب 500 ميكرولتر من وسط زراعة PSC وقم بتخزين اللوحة عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. نضح الوسط من الخلايا المستزرعة ، واغسل الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من DPBS بعناية. قم بإزالة DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من 0.5 mM EDTA إلى البئر.
    3. احتضان اللوحة في RT لمدة 2-5 دقائق ، حتى تبدأ المستعمرات في الانفصال. مراقبة بعناية الخلايا تحت المجهر.
    4. عندما تبدأ حواف المستعمرات في التقشر وتصبح الفجوات بين الخلايا مرئية (الشكل 3 أ) ، قم بإزالة EDTA وأضف بعناية 500 ميكرولتر من DPBS.
      ملاحظة: دائما ماصة على الجدار الجانبي للبئر وليس مباشرة على الخلايا ، حتى لا تفصل الخلايا عن اللوحة.
    5. نضح DPBS واغسل البئر ب 500 ميكرولتر من وسط زراعة PSC باستخدام ماصة p1000. ماصة لأعلى ولأسفل 1x-5x لتفريق المستعمرات إلى كتل ذات حجم مناسب (الشكل 3 أ). لا ماصة أكثر من اللازم.
      ملاحظة: إذا تم سحب iPSCs عن طريق الخطأ أكثر من اللازم ، أضف 10 ميكرومتر من مثبط الصخور Y-27632 إلى الوسط. هذا يمكن أن يعزز البقاء على قيد الحياة ، حيث أن iPSCs غير قادرة على البقاء على قيد الحياة كخلايا مفردة.
    6. نقل 1 / 10-1 / 50 من تعليق كتلة الخلية إلى الآبار الجديدة. تعتمد النسبة على التقاء البئر قبل الانقسام ، والكثافة المطلوبة للخلايا المصنفة ، وتفضيل iPSC النسيلي.
    7. وزع الكتل بالتساوي في البئر عن طريق تحريك اللوحة برفق ذهابا وإيابا عدة مرات. احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية للسماح للكتل بالالتصاق.
    8. استبدل الوسط ب 750 ميكرولتر من وسط زراعة PSC إذا لوحظت العديد من الخلايا الميتة العائمة ؛ خلاف ذلك ، أضف 250 ميكرولتر من وسط ثقافة PSC. ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة.
      ملاحظة: يعد الاستبدال المتوسط بعد 30 دقيقة أمرا بالغ الأهمية ، خاصة بالنسبة لخطوط الخلايا غير المستقرة (مثل NHPs).
    9. قم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام حتى تنمو المستعمرات بشكل كبير بما يكفي للمرور. للتغيير المتوسط ، اتبع الخطوة 4 من البروتوكول.
  2. تمرير خلية واحدة
    1. قم بإعداد لوحة الاستزراع المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي ، كما هو مذكور في الخطوة 5.1.1 ، مع إضافة 10 ميكرومتر Y-27632 إلى وسط الاستزراع PSC.
      اختياري: أضف 10 ميكرومتر Y-27632 إلى الخلايا 1-3 ساعات قبل المرور لتعزيز بقاء خطوط الخلايا الحساسة.
    2. نضح الوسط وغسل الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من DPBS. قم بإزالة DPBS وإضافة 300 ميكرولتر من محلول الانفصال إلى الآبار.
    3. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق. عندما يلاحظ انفصال كاف للخلايا تحت المجهر ، أضف 700 ميكرولتر من وسط زراعة PSC أو DPBS.
    4. ماصة صعودا وهبوطا 5-10x باستخدام ماصة p1000 حتى يتم فصل الخلايا إلى خلايا واحدة. لا ماصة أكثر من اللازم ، من أجل منع تلف الخلايا.
    5. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 2 مل على الأقل من DPBS لتخفيف محلول الانفصال.
    6. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ونضح المحلول تماما ، دون تعطيل حبيبات الخلية.
    7. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع PSC المكمل ب 10 ميكرومتر Y-27632.
    8. عد الخلايا والبذور 5000-7000 خلية لكل صفيحة 12 بئرا مغلفة بمصفوفة غشاء القاعدية ، محضرة في الخطوة 5.2.1.
      ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى رقم خلية مختلف ، فقم بالتغيير إلى بئر أكبر أو أصغر وفقا لذلك.
    9. احتضن اللوحة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للسماح للخلايا بالتعلق.
    10. استبدل الوسط ب 750 ميكرولتر من وسط زراعة PSC + 10 ميكرومتر Y-27632 إذا لوحظت العديد من الخلايا الميتة ؛ خلاف ذلك ، أضف 250 ميكرولتر + 10 ميكرومتر Y-27632.
      ملاحظة: هذه الخطوة بالغة الأهمية ، خاصة بالنسبة لخطوط الخلايا غير المستقرة (مثل NHPs).
    11. ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة.
    12. قم بتغيير الوسيط إلى وسط ثقافة PSC بدون Y-27632 بعد 1 إلى 2 أيام من الانقسام ، للسماح للخلايا بعرض مورفولوجيا المستعمرة الكلاسيكية مرة أخرى (الشكل 3 ب).
    13. تغيير المتوسطة كل 2 أيام حتى تنمو المستعمرات كبيرة بما فيه الكفاية. للتغيير المتوسط ، اتبع القسم 4 من البروتوكول.
  3. تمرير iPSCs عن طريق قطف المستعمرة
    1. تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة ب 12 بئرا كما هو مذكور في الخطوة 5.1.1.
    2. نضح الوسط وغسل الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر بعناية من DPBS. قم بإزالة DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من 0.5 mM EDTA إلى البئر.
    3. احتضان اللوحة في RT لمدة 1-3 دقائق ومراقبة الخلايا تحت المجهر ، حتى يكون انفصال المستعمرة مرئيا على الحدود.
    4. قم بإزالة EDTA وأضف بعناية 500 ميكرولتر من DPBS. قم بشفط السائل قبل إضافة 500 ميكرولتر ببطء من وسط زراعة PSC إلى البئر ، دون فصل الخلايا.
    5. استخدم ماصة p200 لاختيار المستعمرة المطلوبة تحت المجهر ، دون جمع الخلايا المتمايزة. للقيام بذلك ، خدش بلطف على المستعمرة أثناء تناول الخلايا التي تحتوي على الوسط.
    6. نقل كل مستعمرة منتقاة إلى بئر واحد مغطى بمصفوفة غشاء قاعدي ، كما هو معد في الخطوة 5.3.1. افصل الخلايا إلى كتل صغيرة باستخدام ماصة p1000 ، عن طريق سحب الخلايا 2-5x.
    7. احتضن اللوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، مما يسمح للكتل بالالتصاق.
    8. استبدل الوسط ب 750 ميكرولتر من وسط زراعة PSC إذا لوحظت العديد من الخلايا الميتة العائمة ؛ خلاف ذلك ، أضف 250 ميكرولتر من وسط ثقافة PSC.
      ملاحظة: يعد الاستبدال المتوسط بعد 30 دقيقة أمرا بالغ الأهمية ، خاصة بالنسبة لخطوط الخلايا غير المستقرة (على سبيل المثال ، NHPs).
    9. ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة.
    10. قم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام حتى تنمو المستعمرات بشكل كبير بما يكفي للمرور. للقيام بذلك ، اتبع القسم 4 من البروتوكول.

6. تجميد الخلايا البولية و iPSCs للتخزين على المدى الطويل

ملاحظة: بشكل روتيني ، يتم تجميد iPSCs ككتل في وسط تجميد الخلية دون عد. يجب أن يكون السحب ضئيلا ، لتجنب التفكك إلى خلايا مفردة. بالنسبة للخلايا البولية ، بشكل روتيني ، يتم تجميد 1.5 × 104 إلى 3 × 104 خلايا لكل أنبوب ، مما يسمح للمستخدم بإذابة أنبوب واحد مباشرة في بئر واحد من صفيحة 12 بئرا دون الحاجة إلى خطوة عد أخرى.

  1. تحضير 5 مل من DPBS في أنبوب 15 مل.
  2. لتجميد الخلايا البولية ، اتبع الخطوات 2.2-2.4 من البروتوكول. لتجميد iPSCs ، اتبع الخطوات 5.1.2-5.1.5 من بروتوكول تمرير التكتل.
  3. انقل التعليق إلى الأنبوب سعة 15 مل المحضر في الخطوة 6.1. لتجميد الخلايا البولية ، عد 10 ميكرولتر من تعليق الخلية باستخدام مقياس الدم. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 200 × غرام ، ونضح طاف طاف تماما.
  4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من وسط تجميد الخلية لكل أنبوب ، وقم بتوزيع الخلايا على الكمية المطلوبة من أنابيب التبريد.
  5. انقل أنابيب التبريد على الفور إلى -80 درجة مئوية. انقل الأنابيب المجمدة إلى فريزر -150 درجة مئوية أو النيتروجين السائل بعد يوم واحد من التجميد عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

7. إذابة الخلايا البولية و iPSCs

  1. لإذابة الخلايا البولية ، قم بإعداد الكمية المطلوبة من 12 بئرا مغلفة بالجيلاتين ، كما هو مذكور في الخطوة 1.1 من البروتوكول. بالنسبة ل iPSCs ، قم بإعداد ألواح 12 بئرا المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي ، كما هو مذكور في الخطوة 5.1.1. في كلتا الحالتين ، لا تبادل المصفوفة مع المتوسطة.
  2. قم بإعداد أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من DPBS ، وقم بتخزينه عند 37 درجة مئوية.
  3. ضع قارورة مجمدة من الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية للذوبان ، حتى تصبح قطعة من الثلج العائم مرئية.
    ملاحظة: امسح أنبوب التبريد بالإيثانول قبل وبعد الحضانة في حمام مائي لتجنب التلوث.
  4. أضف 500 ميكرولتر من وسط REMC للخلايا البولية ، أو 500 ميكرولتر من وسط زراعة PSC ل iPSCs إلى التعليق المحتوي على الجليد ، وانقل المعلق على الفور إلى أنبوب 15 مل الذي تم تسخينه مسبقا والمحضر في الخطوة 7.2.
  5. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية تماما.
  6. بالنسبة للخلايا البولية ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط REMC. بالنسبة إلى iPSCs ، أعد تعليق الحبيبات بعناية في 750 ميكرولتر من وسط زراعة PSC. تجنب سحب الكتل أكثر من اللازم ، من أجل الحفاظ على الكتل سليمة.
    اختياري: يمكن أن يدعم استكمال الوسط ب 10 ميكرومتر Y-27632 بقاء iPSCs بعد الذوبان.
  7. قم بنضح المصفوفة من لوحات 12 بئرا المحضرة في الخطوة 7.1 ، وانقل تعليق الخلية بعناية إلى البئر.
  8. ضع اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة.
  9. في اليوم التالي ، استبدل الوسيط بوسط زراعة PSC ، بدون Y-27632 ل iPSCs ومع REMC للخلايا البولية.
  10. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة.
  11. قم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام حتى تنمو الخلايا بشكل كبير بما يكفي للمرور. للتغيير المتوسط ، اتبع القسم 4 من البروتوكول.

8. الكيمياء المناعية

ملاحظة: يعد التلوين المناعي بالأجسام المضادة التي تستهدف العلامات المرتبطة بتعدد القدرات مثل NANOG و OCT3 / 4 و SOX2 و TRA-1-60 و EpCAM أحد أكثر عمليات التحقق استخداما على نطاق واسع من iPSCs التي تم إنشاؤها حديثا. يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول الأجسام المضادة والتخفيفات في جدول المواد.

  1. لوحة iPSCs 1-3 أيام قبل الاستخدام في عدد مناسب من 12 لوحة بئر. نضح الوسط ، وغسل الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من DPBS ، وإزالة DPBS. أضف 400 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لكل بئر ، وقم بإصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة في RT.
  2. قم بإزالة 4٪ PFA ، واغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانسداد لكل بئر ، واحتضن اللوحة لمدة 30 دقيقة في RT.
  3. قم بنضح المخزن المؤقت المانع ، وأضف الأجسام المضادة المخففة في 400 ميكرولتر من محلول تخفيف الأجسام المضادة (ADB) إلى كل بئر. احتضن الطبق على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
  4. قم بإزالة ADB الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية ، واغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS.
  5. نضح DPBS ، وإضافة 400 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في ADB لكل بئر. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في RT في الظلام.
  6. قم بإزالة ADB ، واغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS. أضف 1 ميكروغرام / مل 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) مخفف في DPBS لكل بئر ، واحتضانه لمدة 3 دقائق في RT.
  7. نضح محلول DAPI ، واغسل الخلية 3x باستخدام DPBS. أضف 500 ميكرولتر من DPBS للتصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند عزل الخلايا عن بول الإنسان و NHP ، يمكن تحديد أنواع مختلفة من الخلايا مباشرة بعد العزل. تفرز الخلايا الحرشفية ، وكذلك الخلايا المستديرة الأصغر ، مع البول. يحتوي بول الإناث على خلايا حرشفية أكثر بكثير من بول الذكور (الشكل 1B - اليوم 0 ؛ الشكل التكميلي S1). بعد 5 أيام من المزرعة في وسط البول الأولي ، يمكن رؤية أول خلايا متكاثرة ملتصقة (الشكل 1 أ ، ب - اليوم 5). في هذه المرحلة ، يتم استبدال نصف الوسط بوسط انتشار REMC كل يوم ، ح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد iPSCs أنواعا قيمة من الخلايا لأنها تسمح بتوليد أنواع الخلايا التي يتعذر الوصول إليها في المختبر. كمواد أولية لإعادة البرمجة ، على سبيل المثال ، لا تتوفر الخلايا الليفية بسهولة من جميع أنواع الرئيسيات ، تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتوليد iPSCs من الخلايا المشتقة من البول. يمكن الحصول على هذه الخلايا بطريقة غير جراحية ، حتى من عينات بول الرئيسيات غير المعقمة ، عن طريق استكمال وسط الاستزراع بالمضادات الحيوية واسعة الطيف.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول تستحق بعض المناقشة ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل DFG EN 1093 / 5-1 (رقم المشروع 458247426). تم دعم M.O. من قبل زمالة JSPS للأبحاث الخارجية. تم إنشاء جميع الأرقام مع BioRender.com. تم إجراء قياس التدفق الخلوي بمساعدة قياس التدفق الخلوي للمرفق الأساسي في المركز الطبي الحيوي في ميونيخ. نود أن نشكر ماكوتو شيدا وتومويو موتو من ASHBi ، جامعة كيوتو ، لدعم تصوير الفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حل انفصال الخلايا Accumax & trade ( حل الانفصال < / em>)Sigma-AldrichSCR006
Amphotericin B-SolutionMerckA2941-100ML
الأجسام المضادة للفأر TRA-1-60 المضادة للإنسان   ؛تقنيات الخلايا الجذعية60064التخفيف: 1/200
الأجسام المضادة المترافقة PE المضادة للإنسان TRA-1-60  Miltenyi Biotec130-122-965التخفيف: 1/50
Bambanker & trade ؛ ( وسط تجميد الخلايا< / em>)Nippon GeneticsBB01
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار ، 12 بئر CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess & trade ؛ II عداد الخلايا الآليThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing & reg ؛ أنابيب 1.5 مل مع الباركود ثنائي الأبعاد ( Cryotubes< / em>)Sued-Laborbedarf52 95-0213يمكن استخدام أنواع مختلفة من الأنابيب المبردة للتجميد. تتميز أنابيب الباركود ثنائية الأبعاد بميزة أنه يمكن تخزين عينة المعلومات في قاعدة بيانات تحتوي على معلومات أنبوب فريدة.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus< / em>)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune & trade ;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit ( Sendai virus Reprogramming Kit< / em>) ThermoFisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochlorideSigma-Aldrich10236276001
DMEM High الجلوكوزTH. GeyerL0102
DMEM / F12 w L-glutamineFisher Scientific15373541
الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor & trade ؛ 488Thermo Fisher ScientificA-21202التخفيف: 1/500
الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor & trade ؛ 594Thermo Fisher ScientificA-21207التخفيف: 1/500
DPBS بدون الكالسيوم بدون المغنيسيومTH. GeyerL0615-500
EpCAM أجسام مضادة للأرانب متعددة النسيلة المؤتلفة (22 HCLC)710524الحراريالحراري: 1/500
حمض رباعي الأسيتيك إيثيلين ديامين (EDTA)أنبوبفالكونكارل روث CN06.3
15 مل قاع مخروطيالشكل Greiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 مل قاع مخروطيGreiner BIO-ONE227261
مصل الأبقار الجنينية، مؤهل، معطل الحرارة، البرازيل (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 663441
الجيلاتين من جلد الخنازيرSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex & trade ؛ مصفوفة غشاء أساسي خالية من LDEV ، مؤهلة من hESC ، منخفضة عامل النموThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX & trade ؛ مكملحراري فيشر35050038
Heracell & trade ؛ 240i حاضنة CO2فيشر Scientific16416639
Heraeus Heraخزانة أمان آمنةKendro51017905
Human EGF ، درجة ممتازةMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ & nbsp ؛فيجيالإصدار 2.9.0
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X)11140035Thermo Fisher Scientific
PP ، 1.5 ملNerbe Plus04-212-1000
مجهر نيكون كسوف TE2000-SنيكونTE2000-S
ماوس الأجسام المضادة للبروتين الجنينيألفا R & D أنظمةMAB1368التخفيف: 1/100
الفأر المضادة للعضلات الملساء ألفا الأكتينR & D أنظمةMAB1420التخفيف: 1/100
فأر مضاد للجسم المضاد للبيتا الثالث TubulinR & D أنظمةMAB1195التخفيف: 1/100
mTeSR & trade; 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb تقنية إشارات الخلية4903Sالتخفيف: 1/400
Normocure & Trade ؛ (كاشف مضاد للميكروبات< / em>)Invivogenant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody  تقنية إشارات الخلية2750Sتخفيف: 1/400
بارافورمالدهيد (PFA)سيجما ألدريتش441244-1 كجم
بنسلين ستربتومايسين (10.000 وحدة / مل) (PS)البنسلينوالستربتومايسين 15140122 Thermo Fisher Scientific على 100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكرو ؛ جم / مل من الستربتومايسين.
المؤتلف البشري FGF-basicPeproTech100-18B
المؤتلف البشري PDGF-ABPeproTech100-00AB
جهاز طرد مركزي مبرد على الطاولةSIGMA 4-16KS
الخلايا الظهارية الكلوية القاعدية المتوسطةATCCPCS-400-030
طقم نمو الخلايا الظهارية الكلويةATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) الماوس mAb # 4900تقنية إشارات الخلية4900Sالتخفيف: 1/400
SSEA4 (MC813) الماوس mAbNEB4755Sالتخفيف: 1/500
StemFit & reg ؛ Basic02Nippon Genetics3821.00تم إيقاف إنتاج هذه الوسيلة ، استخدم StemFit Basic04CT لخطوط الخلايا البشرية أو StemFit Basic03 للرئيسيات غير البشرية بدلا من ذلك.
Triton X-100  سيجما ألدريتشT8787-50ML
TrypLE & التجارة ؛ حدد الإنزيم (1x) ، لا يوجد فينول أحمر ( إنزيم التفكك< / em>)Thermo Fisher Scientific12563011
Waterbath Precision GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632 ، ملح ثنائي هيدروكلوريد ( مثبط الصخور< / em>)BiozolBYT-ORB153635
مؤقتللتكوين ، انظر التكميلي الجدول S1
المخزن المؤقتللتكوين انظر الجدول التكميلي S1
REMCللتكوين انظر الجدول التكميلي S1
البول الأوليللتكوين انظر الجدول التكميلي S1
ثقافة PSCللتكوين ، انظر الجدول التكميلي S1
توليد PSCللتكوين ، انظر الجدول التكميلي S1
المخزن المؤقتللتكوين ، انظر الجدول التكميلي S1
تخفيف علميأنبوب الطرد المركزي الدقيق يحتوي مزيج مخزن لتخفيف الأجسام المضادة للحجب وسيط وسط وسط وسيط لغسل البول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214(2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103(2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312(2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361(2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516(2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432(2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة