تحسين عملية تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني النافذ للتقاطعات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة

Gan Guangming; Sheng Qingyuan; Ou Yutong; Chen Mei; Zhang Chenchen

doi:10.3791/64934

Method Article

تحسين عملية تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني النافذ للتقاطعات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة

DOI:

10.3791/64934

⸱

September 15th, 2023

Gan Guangming¹^,² , Sheng Qingyuan³ , Ou Yutong¹ , Chen Mei³ , Zhang Chenchen¹

¹The School of Medicine, Southeast University, ²The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, ³The School of Life Science and Technology, Southeast University

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming^1,2
Sheng Qingyuan³
Ou Yutong¹
Chen Mei¹
Zhang Chenchen¹
¹The School of Medicine, Southeast University,
²The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
³The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming^1,2
Sheng Qingyuan³
Ou Yutong¹
Chen Mei³
Zhang Chenchen¹
¹The School of Medicine, Southeast University,
²The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
³The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا التقرير إجراء جديدا لإعداد العينات لتصور الوصلات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة . هذه الطريقة أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية وهي مفيدة بشكل خاص لتحليل البنية التحتية للوصلات العصبية العضلية ذبابة الفاكهة .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برز تقاطع ذبابة الفاكهة العصبي العضلي (NMJ) كنظام نموذجي قيم في مجال علم الأعصاب. يتيح تطبيق الفحص المجهري متحد البؤر في ذبابة الفاكهة NMJ للباحثين الحصول على معلومات متشابكة ، تشمل كلا من البيانات الكمية حول وفرة المشابك العصبية والرؤى التفصيلية في مورفولوجيتها. ومع ذلك ، فإن التوزيع المنتشر والنطاق البصري المحدود ل TEM يمثلان تحديات للتحليل البنيوي الفائق. تقدم هذه الدراسة طريقة مبتكرة وفعالة لإعداد العينات تتجاوز النهج التقليدي. يبدأ الإجراء بوضع شبكة معدنية في قاعدة زجاجة مسطحة القاع أو أنبوب اختبار ، يليه وضع عينات اليرقات الثابتة على الشبكة. يتم وضع شبكة إضافية فوق العينات ، مما يضمن وضعها بين الشبكتين. يتم تجفيف العينات الثابتة تماما واختراقها قبل الشروع في إجراء التضمين. ثم يتم تضمين العينات في راتنجات الايبوكسي بطريقة ورقة مسطحة ، مما يسمح بإعداد العضلات لتحديد المواقع والتقسيم. بالاستفادة من هذه الخطوات ، يمكن تصور جميع عضلات يرقات ذبابة الفاكهة تحت المجهر الضوئي ، مما يسهل تحديد المواقع والتقسيم لاحقا. تتم إزالة الراتنج الزائد بعد^{تحديد موقع العضلات} ^{6 و 7} من أجزاء الجسم A₂و A₃. يتم إجراء التقسيم التسلسلي الرقيق للغاية^للعضلة ^{6 أو 7}.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد المجهر الإلكتروني أحد أكثر الطرق مثالية لدراسة البنية التحتية للمواد البيولوجية التي يمكنها إظهار البنية الداخلية للخلايا بصريا وبدقة على المستوى^{النانوي 1}. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد عملية تحضير العينة والتكلفة العالية ، فإن المجهر الإلكتروني ليس شائعا مثل الفحص المجهري الضوئي. أدت التطورات الحديثة في تقنيات المجهر الإلكتروني إلى تحسينات كبيرة في جودة الصورة ، بالتزامن مع انخفاض ملحوظ في عبء العمل المرتبط بها. وبالتالي ، فقد لعب المجهر الإلكتروني دورا مهما في تطوير المعرفة العلمية في مجالات متنوعة².

ذبابة الفاكهة هي نموذج حيواني ممتاز لأداء التلاعب الجيني للتحكم بدقة في التعبير المكاني....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم الإبلاغ عن طريقة تحضير عينة المجهر الإلكتروني النافذ المستخدمة في هذه المقالة سابقا¹⁶. من المهم ملاحظة أن اختيار الكواشف وتعديل الجرعة ضروريان اعتمادا على العينة. هناك العديد من الكواشف الكيميائية السامة المستخدمة في عملية تحضير العينات ، لذلك يحتاج المشغل إلى اتخاذ تدابير وقائية معينة ، مثل ارتداء الملابس والقفازات الواقية والعمل في غطاء الدخان.

1. إجراءات التشريح والتثبيت والتنسيب

تشريح
1. تشريح اليرقات المتجولة في وقت متأخر من 3rd instar في محلول يناير والحصول على جدار الجسم بالكامل بناء على الإجراءات القياسية¹⁷. تحضير محلول جان على النحو التالي: 12....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون جدار جسم يرقة ذبابة الفاكهة من 30 ليفة عضلية يمكن تحديدها مرتبة في نمط منتظم وتبدو وكأنها شريحة رقيقة بعد التشريح والتثبيت²¹ (الشكل 1 أ). تظل العينة مسطحة أثناء عملية الجفاف بسبب وجود الشبكات المعدنية (الشكل 1B ، C). يتم دفن عضلة جسم اليرقات في صفيحة رقيقة مصنوعة من راتنجات الايبوكسي (الشكل 1D-G) ، والتي يتم وضعها بسهولة ودقة ولصقها على الكبسول.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تميل عينات يرقات ذبابة الفاكهة إلى الالتفاف أثناء الجفاف ، حيث تكون العينات رقيقة ، مما يجعل من الصعب تحديد موقع الوصلة العصبية العضلية بدقة ، مما يزيد من صعوبة وعبء العمل لإعداد العينة. التحسين التقليدي هو تقصير العينة⁷ ، لكن العينات كانت لا تزال مجعدة بدرجات مختلفة.

في طريقتنا ، هناك خطوتان حاسمتان: أولا ، تظل العينات مسطحة طوال عملية الجفاف بسبب تقييد الشبكات المعدنية. إلى جانب ذلك ، أثناء عملية البلمرة ، يمكن بلمرة العينة عن طريق شطرها بين المنتجات البلاستي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين جرانت 32070811 ، وصندوق اختبار التحليل بجامعة جنوب شرق (الصين) 11240090971. نشكر مختبر المجهر الإلكتروني ومركز التحليل المورفولوجي ، كلية الطب ، جامعة الجنوب الشرقي ، نانجينغ ، الصين.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1،2-إيبوكسي بروبان	شنغهاي لينغ فنغ الكاشف الكيميائي المحدودة	JYJ 037-2015	عامل اختراق
ذبابة الفاكهة الأسهم	بلومنجتون	لا شيء	كانت سلالات ذبابة الفاكهة من النوع البري المستخدمة في هذا البحث كلها W^{1118< / sup> ، وتم تربيتها وفقا لطرق الاستزراع القياسية}
أنابيب اختبار زجاجية مسطحة القاع	Haimen Chenxing Experimental Equipment Company ؛	لا شيء	أنابيب اختبار زجاجية مسطحة القاع (زجاجة) مع سدادة إسفنجية (أو سدادة زجاجة)
K4M cross-linker	؛ Agar Scientific	Cat # 1924B	تعتمد راتنجات التضمين على تركيبة أكريليت وميثاكريلات متشابكة للغاية ؛
راتنج K4M (مونومر B)	Agar Scientific	Lot # 631557	فيلم الراتنج
البولي فينيل	Haimen Chenxing شركة المعدات التجريبية	لا شيء	فيلم البولي إيثيلين الشفاف هو الأفضل ، سمك حوالي 0.2 مم
SPI Chem DDSA	SPI SpI	# 02827-AF	Dodecenyl Succinic Anhydride
SPI-Chem DMP-30 Epoxy	SPI	02823-DA	Accelerator
SPI-Chem NMA	SPI SpI	# 02828-AF	Hardner للإيبوكسي
SPI-PON 812 الايبوكسي	SPI	SPI # 0259-AB	مونومر
الراتنجشبكة فولاذية	Yuhuiyuan Gardening Store (عبر الإنترنت)	لا شيء	شبكة النحاس أو الفولاذ المقاوم للصدأ
المجهر الإلكتروني لنقل	هيتاشي H-7650	11416692	تم تلطيخ جميع الشبكات (التي تم جمع العينات عليها) بسترات الرصاص ولاحظت تحت الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال.
ميكروتوم فائق النحافة	Leica UC7	595915	يتم تنفيذ جميع عمليات التقسيم على ميكروتوم Leica UC7 فائق النحافة باستخدام سكين ماسي

مونومر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Me....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

تحسين عملية تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني النافذ للتقاطعات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة

In This Article

Erratum Notice

Erratum

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles