يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحسين عملية تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني النافذ للتقاطعات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64934

⸱

سبتمبر 15, 2023

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

يقدم هذا التقرير إجراء جديدا لإعداد العينات لتصور الوصلات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة . هذه الطريقة أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية وهي مفيدة بشكل خاص لتحليل البنية التحتية للوصلات العصبية العضلية ذبابة الفاكهة .

الملخص

برز تقاطع ذبابة الفاكهة العصبي العضلي (NMJ) كنظام نموذجي قيم في مجال علم الأعصاب. يتيح تطبيق الفحص المجهري متحد البؤر في ذبابة الفاكهة NMJ للباحثين الحصول على معلومات متشابكة ، تشمل كلا من البيانات الكمية حول وفرة المشابك العصبية والرؤى التفصيلية في مورفولوجيتها. ومع ذلك ، فإن التوزيع المنتشر والنطاق البصري المحدود ل TEM يمثلان تحديات للتحليل البنيوي الفائق. تقدم هذه الدراسة طريقة مبتكرة وفعالة لإعداد العينات تتجاوز النهج التقليدي. يبدأ الإجراء بوضع شبكة معدنية في قاعدة زجاجة مسطحة القاع أو أنبوب اختبار ، يليه وضع عينات اليرقات الثابتة على الشبكة. يتم وضع شبكة إضافية فوق العينات ، مما يضمن وضعها بين الشبكتين. يتم تجفيف العينات الثابتة تماما واختراقها قبل الشروع في إجراء التضمين. ثم يتم تضمين العينات في راتنجات الايبوكسي بطريقة ورقة مسطحة ، مما يسمح بإعداد العضلات لتحديد المواقع والتقسيم. بالاستفادة من هذه الخطوات ، يمكن تصور جميع عضلات يرقات ذبابة الفاكهة تحت المجهر الضوئي ، مما يسهل تحديد المواقع والتقسيم لاحقا. تتم إزالة الراتنج الزائد بعدتحديد موقع العضلات 6 و 7 من أجزاء الجسم A2 و A3. يتم إجراء التقسيم التسلسلي الرقيق للغايةللعضلة 6 أو 7.

المقدمة

يعد المجهر الإلكتروني أحد أكثر الطرق مثالية لدراسة البنية التحتية للمواد البيولوجية التي يمكنها إظهار البنية الداخلية للخلايا بصريا وبدقة على المستوىالنانوي 1. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد عملية تحضير العينة والتكلفة العالية ، فإن المجهر الإلكتروني ليس شائعا مثل الفحص المجهري الضوئي. أدت التطورات الحديثة في تقنيات المجهر الإلكتروني إلى تحسينات كبيرة في جودة الصورة ، بالتزامن مع انخفاض ملحوظ في عبء العمل المرتبط بها. وبالتالي ، فقد لعب المجهر الإلكتروني دورا مهما في تطوير المعرفة العلمية في مجالات متنوعة2.

ذبابة الفاكهة هي نموذج حيواني ممتاز لأداء التلاعب الجيني للتحكم بدقة في التعبير المكاني والزماني للجينات المستهدفة3. إلى جانب ذلك ، تتمتع ذبابة الفاكهة بمزايا فترة نمو قصيرة وتربية سهلة مقارنة بنماذج الثدييات. لذلك ، يستخدم ذبابة الفاكهة على نطاق واسع في أبحاث التشكل4،5.

في يرقات ذبابة الفاكهة ، يتم توزيع عراوات الوصلة العصبية العضلية (NMJ) على نطاق واسع في العضلات 6,7 ، ويمكن أن يوفر التلوين المناعي ل NMJ بسهولة معلومات عن كمية المشبك العصبي والتشكل 8,9. إن عروات NMJ الموجودةفي العضلات 6 / 7 من المقاطعA 2 وA 3 مناسبة تماما للبحث الكمي والمورفولوجي باستخدام المجهر الضوئي. هذا بسبب حجمها ووفرتها10,11. لذلك ، تعتبر يرقات ذبابة الفاكهة NMJs نموذجا مفيدا لأبحاث علم الأعصاب12.

ومع ذلك ، من الصعب مراقبة البنية التحتية ل NMJ bouton بواسطة TEM. نظرا لأن نافذة المسح للمجهر الإلكتروني النافذ ضيقة ، فمن الصعب وضع عروات NMJ الموزعة على نطاق واسع13. السبب الآخر هو أن جدار جسم ذبابة الفاكهة عرضة للتجعيد أثناء خطوة تجفيف الكحول في بروتوكول تحضيرالعينة 7.

عادة ما تختار الدراسات التقليدية عرواتبين العضلات 6 و 7 من الجزأينA 2 وA 3 كمواد عينة بسبب وفرتها وحجمها14,15. العضلات 6 و 7 من الأجزاءA 2 و A3 أكبر من العضلات الأخرى وتحتوي على المزيد من العروات. ومع ذلك ، عندما تم تحضير العينات للمجهر الإلكتروني ، تميل العينات الثابتة إلى أن تصبح رقيقة وعرضة للتجعيد ، مما يؤدي إلى وضع غير صحيحللعضلات 6 و 7 من الجزأين A2 وA 3.

نبلغ بموجب هذا عن إجراء معالجة جديد أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية لإعدادالعينات 7,16 ، من خلال السماح للعينات بالبقاء مسطحة أثناء الجفاف اللاحق ، وبالتالي تسهيل وضع أفضل للتقاطعات العصبية العضلية ليرقات ذبابة الفاكهة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم الإبلاغ عن طريقة تحضير عينة المجهر الإلكتروني النافذ المستخدمة في هذه المقالة سابقا16. من المهم ملاحظة أن اختيار الكواشف وتعديل الجرعة ضروريان اعتمادا على العينة. هناك العديد من الكواشف الكيميائية السامة المستخدمة في عملية تحضير العينات ، لذلك يحتاج المشغل إلى اتخاذ تدابير وقائية معينة ، مثل ارتداء الملابس والقفازات الواقية والعمل في غطاء الدخان.

1. إجراءات التشريح والتثبيت والتنسيب

  1. تشريح
    1. تشريح اليرقات المتجولة في وقت متأخر من 3rd instar في محلول يناير والحصول على جدار الجسم بالكامل بناء على الإجراءات القياسية17. تحضير محلول جان على النحو التالي: 128 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2 مللي مول KCl ، 4 مللي مول MgCl2 ، 35 مللي مول سكروز ، 5 مللي مول HEPES ، درجة الحموضة 7.4
      ملاحظة: يشير جدار جسم يرقات ذبابة الفاكهة إلى الغطاء الخارجي أو تكامل المرحلة اليرقية لذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة. وهذا يشمل البشرة وخلايا البشرة والأنسجة الكامنة التي تشكل الهيكل الخارجي لليرقات. يوفر جدار الجسم الدعم والحماية الهيكلية ويعمل كحاجز بين جسم اليرقات والبيئة الخارجية17.
  2. تثبيت
    1. ثبت جدار جسم اليرقات في غرفة التشريح عند 4 درجات مئوية طوال الليل باستخدام المثبت. لتحضير المثبت، اخلطي 2٪ جلوتارالدهيد و2٪ فورمالديهايد في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 متر (درجة الحموضة 7.4)
    2. شطف العينات عدة مرات مع العازلة كاكوديلات الصوديوم.
    3. تحضير 1٪ OsO4 في المخزن المؤقت cacodylate. ثبت العينات في 1٪ OsO4 لمدة 2 ساعة ، متبوعة بعدة شطف في الماء المقطر.
      ملاحظة: يوفر التثبيت المزدوج مع الألدهيدات و OsO4 حماية أفضل للبنية الخلوية الفائقة. إلى جانب ذلك ، يمكن ل OsO4 تلطيخ أنسجة العينة ، مما يسمح للتباين بين الضوء والعينة أن يكون أكثر وضوحا18.
    4. قم بتلطيخ عينات الوصلة العصبية العضلية لذبابة الفاكهة بأسيتات يورانيل مشبعة بنسبة 2٪ لمدة ساعتين ، متبوعة بعدة شطف بالماء منزوع الأيونات (الشكل 1 أ).
  3. وضع العينة
    1. قطع قطعتين مستديرتين من شبكة معدنية من نفس الحجم (حجم المسام 270 ميكرومتر) بالمقص.
    2. ضع شبكة معدنية (270 ميكرومتر) في قاعدة زجاجة مسطحة القاع مسبقا.
    3. ضع عينات اليرقات الثابتة على الشبكة ثم ضع شبكة أخرى عليها بحيث يتم وضع العينات بين الشبكتين.

2. الجفاف

ملاحظة في هذا البحث ، تم استخدام طريقة تجفيف تدرج الإيثانول.

  1. قم بتجفيف العينات في تدرج تركيز متزايد من الإيثانول بالتتابع (50٪ ، 70٪ ، 85٪ ، 95٪ مرة واحدة لكل منها ، 100٪ مرتين) ، كل منها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  2. اشطف العينات مرتين بأكسيد البروبيلين في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في كل مرة (الشكل 1 ج).

3. التسلل

ملاحظة: التسلل هو أحد الخطوات الضرورية لإعداد عينة TEM. يسمح التسلل بالاستبدال التدريجي لوسط التجفيف بوسط التضمين في العينة للسماح بملء خلالي الخلية بوسطالتضمين 19.

  1. ضع العينات في محلول مختلط من أكسيد البروبيلين وراتنجات الايبوكسي بنسبة 1: 1 و 1: 2 لمدة ساعة واحدة لكل منهما ، متبوعا براتنجات الايبوكسي النقية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

4. التضمين

  1. قم بإعداد فيلم بولي إيثيلين وقطعه إلى مربع كبير (حوالي 5 × 5 سم) ودعم مستطيل صغير مجوف (حوالي 2 × 2 سم). الغراء مربع صغير مع مربع كبير.
  2. قبل وضع راتنجات الايبوكسي الكافية في وسط المربع الكبير.
  3. ضع العينات في راتنجات الايبوكسي الموضوعة مسبقا بحيث يكون جانب العضلات متجها لأعلى. استخدم مجسم.
  4. أضف عدة قطرات من الراتنج إلى العينات ثم قم بتغطيتها بفيلم PE (أكبر قليلا من الفاصل) (الشكل 1D-E).
  5. بلمرة العينات عند 37 درجة مئوية و 42 درجة مئوية و 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على التوالي (الشكل 1F).

5. إجراءات التقسيم

  1. قم بإزالة الأجزاء الزائدة من جدار جسم اليرقات بشفرة حادة واحتفظ بشبه منحرف ، بما في ذلك الجزءA 2 / A3 .
    ملاحظة: يجب أن يكون الخط العلوي بالقربمن العضلة 13 ، ويجب أن يكون خط الأساس بعيدا عن العينة إلى راتنجات الايبوكسي. يبلغ الارتفاع بين الخط العلوي وخط الأساس حوالي 5-8 مم.
  2. قم بإزالة شبه المنحرف من بقية العينة وألصقه بالكبسولة المملوءة بالراتنج باستخدام غراء A / B.
  3. قم بتأكيدموضع العضلات 6 و 7 من الأجزاء A2 وA 3 تحت المجهر الضوئي (الشكل 1G) والحفاظ على مستوى الظل الموازيللعضلة السادسة.
  4. اقطع خمس العينة على طول جانبي القطعة A3 .
    ملاحظة: قم بإزالةمعظم العضلات السادسة ، واحتفظ ب 1/3 منعرض العضلة السابعة.
  5. باستخدام ميكروتوم فائق النحافة ، قم بإعداد قسم فائق النحافة من العينة بدءامن العضلة 6.
    ملاحظة: يبلغ سمك كل شريحة حوالي 90 نانومتر.
  6. تعلق أكبر عدد ممكن من الشرائح على كل شبكة نحاسية.
  7. إجراء المجهر الإلكتروني انتقال كما هو موضح سابقا16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتكون جدار جسم يرقة ذبابة الفاكهة من 30 ليفة عضلية يمكن تحديدها مرتبة في نمط منتظم وتبدو وكأنها شريحة رقيقة بعد التشريح والتثبيت21 (الشكل 1 أ). تظل العينة مسطحة أثناء عملية الجفاف بسبب وجود الشبكات المعدنية (الشكل 1B ، C). يتم دفن عضلة جسم اليرقات في صفيحة رقيقة مصنوعة من راتنجات الايبوكسي (الشكل 1D-G) ، والتي يتم وضعها بسهولة ودقة ولصقها على الكبسول...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تميل عينات يرقات ذبابة الفاكهة إلى الالتفاف أثناء الجفاف ، حيث تكون العينات رقيقة ، مما يجعل من الصعب تحديد موقع الوصلة العصبية العضلية بدقة ، مما يزيد من صعوبة وعبء العمل لإعداد العينة. التحسين التقليدي هو تقصير العينة7 ، لكن العينات كانت لا تزال مجعدة بدرجات مختلفة.

في طريقتنا ، هناك خطوتان حاسمتان: أولا ، تظل العينات مسطحة طوال عملية الجفاف بسبب تقييد الشبكات المعدنية. إلى جانب ذلك ، أثناء عملية البلمرة ، يمكن بلمرة العينة عن طريق شطرها بين المنتجات البلاستي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين جرانت 32070811 ، وصندوق اختبار التحليل بجامعة جنوب شرق (الصين) 11240090971. نشكر مختبر المجهر الإلكتروني ومركز التحليل المورفولوجي ، كلية الطب ، جامعة الجنوب الشرقي ، نانجينغ ، الصين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-إيبوكسي بروبانشنغهاي لينغ فنغ الكاشف الكيميائي المحدودةJYJ 037-2015عامل اختراق
ذبابة الفاكهة الأسهمبلومنجتونلا شيءكانت سلالات ذبابة الفاكهة من النوع البري المستخدمة في هذا البحث كلها W1118< / sup> ، وتم تربيتها وفقا لطرق الاستزراع القياسية
أنابيب اختبار زجاجية مسطحة القاعHaimen Chenxing Experimental Equipment Company   ؛لا شيءأنابيب اختبار زجاجية مسطحة القاع (زجاجة) مع سدادة إسفنجية (أو سدادة زجاجة)
K4M cross-linker  ؛ Agar ScientificCat # 1924Bتعتمد راتنجات التضمين على تركيبة أكريليت وميثاكريلات متشابكة للغاية   ؛
راتنج K4M (مونومر B)  Agar ScientificLot # 631557فيلم الراتنج
البولي فينيلHaimen Chenxing شركة المعدات التجريبية  لا شيءفيلم البولي إيثيلين الشفاف هو الأفضل ، سمك حوالي 0.2 مم
SPI Chem DDSASPI SpI# 02827-AFDodecenyl Succinic Anhydride
SPI-Chem DMP-30 EpoxySPI02823-DAAccelerator
SPI-Chem NMASPI SpI# 02828-AFHardner للإيبوكسي
SPI-PON 812 الايبوكسيSPISPI # 0259-ABمونومر
الراتنجشبكة فولاذية Yuhuiyuan Gardening Store (عبر الإنترنت)لا شيءشبكة النحاس أو الفولاذ المقاوم للصدأ
المجهر الإلكتروني لنقلهيتاشي H-765011416692تم تلطيخ جميع الشبكات (التي تم جمع العينات عليها) بسترات الرصاص ولاحظت تحت الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال.
ميكروتوم فائق النحافةLeica UC7595915يتم تنفيذ جميع عمليات التقسيم على ميكروتوم Leica UC7 فائق النحافة باستخدام سكين ماسي
مونومر

المراجع

  1. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
  2. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  3. Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
  4. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  5. Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
  6. Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753(2021).
  7. Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
  8. Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19(2020).
  9. Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
  10. Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
  11. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
  12. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
  13. Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
  14. Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
  15. McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
  16. Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
  17. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107(2009).
  18. Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
  19. Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
  20. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
  21. Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
  22. Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
  23. Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
  24. Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
  25. Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
  26. Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

الوسوم

الوصلة العصبية العضلية في ذبابة الفاكهة (Drosophila)التقطيع فائق الرقةالتضمين في راتنج الإيبوكسيالمجهر البؤريتحديد موضع العضلاتتقنية الشبكة المعدنيةجدار جسم اليرقةالبنية التشابكية
تحسين عملية تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني النافذ للتقاطعات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.