Method Article

سير عمل "التقاط سطح الخلية" للقياس الكمي الخالي من الملصقات لبروتين سطح الخلية

DOI:

10.3791/64952

⸱

March 24th, 2023

 ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, 2Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay, 3Deptartment of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 4Chan Zuckerberg Biohub

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف سير عمل البروتينات لتوصيف بروتين سطح الخلية لأنواع الخلايا المختلفة. يتضمن سير العمل هذا إثراء البروتين على سطح الخلية ، وإعداد العينة اللاحق ، والتحليل باستخدام منصة LC-MS / MS ، ومعالجة البيانات باستخدام برامج متخصصة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقد الماضي ، مكنت البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي من التوصيف المتعمق للأنظمة البيولوجية عبر مجموعة واسعة من التطبيقات. يعتبر بروتين سطح الخلية ("surfaceome") في الأمراض البشرية ذا أهمية كبيرة ، حيث أن بروتينات غشاء البلازما هي الهدف الأساسي لمعظم العلاجات المعتمدة سريريا ، فضلا عن كونها سمة رئيسية يمكن من خلالها التمييز تشخيصيا بين الخلايا المريضة والأنسجة السليمة. ومع ذلك ، ظل التوصيف المركز للبروتينات الغشائية والسطحية للخلية يمثل تحديا ، ويرجع ذلك أساسا إلى تعقيد المحللات الخلوية ، التي تخفي البروتينات ذات الأهمية بالبروتينات الأخرى عالية الوفرة. للتغلب على هذا الحاجز التقني وتحديد بروتين سطح الخلية بدقة لأنواع مختلفة من الخلايا باستخدام بروتينات قياس الطيف الكتلي ، من الضروري إثراء محللة الخلية لبروتينات سطح الخلية قبل التحليل على مطياف الكتلة. تقدم هذه الورقة سير عمل مفصلا لتصنيف بروتينات سطح الخلية من الخلايا السرطانية ، وإثراء هذه البروتينات من محللة الخلية ، وإعداد العينة اللاحقة لتحليل قياس الطيف الكتلي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >تعمل البروتينات كوحدات أساسية يتم من خلالها تنفيذ غالبية الوظائف الخلوية. يعد توصيف بنية ووظيفة البروتينات ذات الصلة خطوة أساسية لفهم العمليات البيولوجية. على مدار العقد الماضي ، أتاحت التطورات في تقنية قياس الطيف الكتلي وبرامج التحليل وقواعد البيانات من الكشف الدقيق عن البروتينات وقياسها على نطاق واسع على مستوى البروتين< فئة sup = "xref">1. يمكن استخدام البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي في مجموعة متنوعة من التطبيقات ، من تحليل العلوم الأساسية للمسارات الكيميائية الحيوية ، إلى تحديد أهداف الأدوية الجديدة في بيئة انتقالية ، إلى تشخيص ومراقبة الأمراض في العيادة < فئة sup = "xref" >2. عند فحص أهداف الدواء الجديدة ، يكون توصيف بروتين سطح الخلية مهما بشكل خاص ، حيث يستهدف أكثر من 65٪ من الأدوية البشرية المعتمدة حاليا بروتينات سطح الخلية < فئة الدعم = "xref" >3. يعتمد مجال العلاج المناعي للسرطان أيضا كليا على مستضدات سطح الخلية الخاصة بالسرطان لاستهداف الخلايا السرطانية والقضاء عليها على وجه التحديد< فئة الدعم = "xref">4. وبالتالي يمكن أن تكون البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي بمثابة أداة واعدة لتحديد بروتينات سطح الخلية الجديدة نحو التدخلات العلاجية.

ومع ذلك ، هناك العديد من القيود عند استخدام طرق البروتينات التقليدية لمسح الخلايا السرطانية لأهداف بروتين سطح الخلية الجديدة. الشاغل الأساسي هو أن البروتينات السطحية تشكل جزءا صغيرا جدا من إجمالي جزيئات البروتين في الخلية. لذلك ، يتم إخفاء شظايا هذه البروتينات بوفرة عالية من البروتينات داخل الخلايا عند إجراء تحليل قياس الطيف الكتلي لمحللة الخلية بأكملها < فئة sup = "xref" >5. يجعل هذا القيد من الصعب توصيف بروتين سطح الخلية بدقة باستخدام سير عمل البروتينات التقليدية. لمواجهة هذا التحدي ، من الضروري تطوير طرق لإثراء بروتينات سطح الخلية من محللة الخلية بأكملها ، قبل التحليل على مطياف الكتلة. تتضمن إحدى هذه الطرق الأكسدة ووضع العلامات البيوتين على بروتينات سطح الخلية الغليكوزيلية في الخلايا السليمة ، والتخصيب اللاحق لهذه البروتينات الحيوية من المحللة باستخدام سحب النيوترافيدين ، وهي عملية أطلق عليها اسم "التقاط سطح الخلية" < فئة sup = "xref" >6. نظرا لأن ~ 85٪ من بروتينات سطح الخلية الثديية يعتقد أنها جليكوزيل < فئة sup = "xref" >7 ، فإن هذا بمثابة طريقة فعالة لإثراء بروتين سطح الخلية من محللة الخلية بأكملها. تصف هذه الورقة سير عمل كامل ، بدءا من الخلايا المستنبتة ، لوضع العلامات على البيوتين على سطح الخلية ، وإعداد العينة اللاحقة لتحليل قياس الطيف الكتلي (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1). على مدى عدة تكرارات ، توفر هذه الطريقة تغطية قوية لبروتين سطح الخلية لعينة معينة. يمكن أن يؤدي استخدام هذه الطريقة لتوصيف بروتين سطح الخلية لكل من الخلايا السرطانية والخلايا السليمة إلى تسهيل اكتشاف مستضدات سطح الخلية الجديدة لتحديد أهداف العلاج المناعي المحتملة< فئة الدعم = "xref">8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم استخدام خلايا ورم البلازما AMO1 في تجربة البروتين على سطح الخلية هذه. يمكن استخدام نفس البروتوكول لأنواع الخلايا الأخرى أيضا ، بما في ذلك مجموعة واسعة من خطوط الخلايا المعلقة والملتصقة < فئة sup = "xref" >9 ، بالإضافة إلى أنواع مختلفة من العينات الأولية < فئة الدعم = "xref" >10. ومع ذلك ، يجب عادة تحسين أرقام الخلايا (المواد الأولية للتجربة) لتغطية البروتين المكافئة. للحصول على تفاصيل تتعلق بالمواد والمعدات، راجع جدول المواد. للحصول على تفاصيل تتعلق بالمخازن المؤقتة وحلول الكاشف وتكوينها، انظر الجدول 1.

< p class = "jove_title" >1. وضع العلامات على سطح الخلية بالبيوتين

  1. عد الخلايا المستنبتة والحبيبات حوالي 3.5 × 107 خلايا حية عن طريق الطرد المركزي (5 دقائق عند 500 × جم ، 24 درجة مئوية).
    ملاحظة: تم تمرير خلايا ورم البلازما AMO1 بوسائط جديدة كل 3 أيام قبل الحصاد.
  2. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات عن طريق إضافة 1 مل من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات (D-PBS) (بدون كالسيوم ولا مغنيسيوم) ، وسحب العينة برفق لأعلى ولأسفل.
  3. قم بتكبيل الخلايا مرة أخرى (كما في الخطوة 1.1) وكرر خطوة الغسيل (الخطوة 1.2) مرة أخرى (غسلتان في المجموع).
  4. بعد الغسيل الثاني ، قم بتكسير الخلايا (كما في الخطوة 1.1) وأعد تعليقها في 990 ميكرولتر من D-PBS البارد عن طريق سحب العينة برفق.
  5. قم بإعداد محلول مخزون من 160 ملي مولار من ميتابريدات الصوديوم (NaIO4) مسبقا. تقسم إلى 50 ميكرولتر وتخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. أضف 10 ميكرولتر من محلول ميتا بريدات الصوديوم 160 ملي مولار إلى تعليق الخلية في الخطوة 1.4 ، واخلطه جيدا ، واحتضنه على دوار من طرف إلى طرف لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. بعد اكتمال الحضانة ، قم بتكبيل الخلايا (كما في الخطوة 1.1) ، وصب المادة الطافية ، وإعادة تعليقها في 1 مل من D-PBS البارد. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين (ثلاث غسلات في المجموع). بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخلايا في 989 ميكرولتر من D-PBS.
  7. قم بإعداد محلول مخزون من هيدرازيد 100 ملي مولار من هيدرازيد البيويسيتين مسبقا. تقسم إلى 50 ميكرولتر ، وتخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. أضف 1 ميكرولتر من الأنيلين و 10 ميكرولتر من 100 ملي مولار هيدرازيد بيويسيتين إلى تعليق الخلية في الخطوة 1.6 ، واخلطها جيدا ، واحتضانها على دوار من طرف إلى طرف لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. بعد اكتمال الحضانة ، قم بتكبيل الخلايا (كما في الخطوة 1.1) ، وصب المادة الطافية ، وإعادة تعليقها في 1 مل من D-PBS البارد. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين (ثلاث غسلات في المجموع).
  9. بعد الغسيل الثالث ، قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة ، وقم بتجميد حبيبات الخلية عن طريق وضع الأنبوب في السائل N2. ضع الحبيبات المجمدة عند -80 درجة مئوية ، حتى تصبح جاهزة للمضي قدما في التحلل والسحب.
فئة

2. تحلل الخلية وسحب البيوتين

  1. قم بإذابة حبيبات الخلية المجمدة على الجليد.
  2. أضف 500 ميكرولتر من 2x المخزن المؤقت للتحلل إلى الحبيبات ، واخلطها جيدا ، ودوامة لمدة 30 ثانية < / > ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى سحب ماصة ودوامة قوية لتحلل الحبيبات بالكامل. بعض الحطام غير القابل للذوبان (أي الحمض النووي) مقبول ، حيث يتم إزالته في خطوة الصوتنة اللاحقة.
  3. قم بتحلل الخلية على الجليد (ثلاث رشقات نارية ، 20 ثانية لكل منها ، دورة عمل 60٪).
  4. جهاز الطرد المركزي للمحللة لحبيبات أي حطام متبقي (10 دقائق عند 17,200 × جم عند 4 درجات مئوية).
  5. أثناء قيام المحللة بالطرد المركزي ، أضف 100 ميكرولتر من حبات راتنج الاغاروز النيوترافيدين إلى عمود الترشيح. قم بتوصيل العمود بمشعب فراغ ، وقم بتطبيق مكنسة كهربائية لطيفة ، واغسل الخرزات عن طريق تدفق 3 مل من محلول الغسيل 1 فوقها.
  6. قم بإزالة عمود الترشيح من مشعب الفراغ ، وقم بتغطية الجزء السفلي ، وأضف محللة الخلية الموضحة إلى العمود بالخرز. قم بتغطية الجزء العلوي من العمود ، واحتضان المحللة بالخرز على دوار من طرف إلى طرف لمدة 120 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: عند تغطية الجزء العلوي من العمود ، أمسك الغطاء السفلي بإحكام في مكانه ، وإلا فقد يتم إزاحته وقد يتسرب محلل الخلية أثناء الحضانة.
  7. قم بإعداد مخازن الغسيل 1 و 2 و 3 (حوالي 5 مل من كل مخزن غسيل لكل عينة ، راجع الجدول 1) ، وضعها في حمام مائي 42 درجة مئوية
  8. بعد انتهاء الحضانة ، ضع عمود الترشيح مرة أخرى على مشعب الفراغ ، وقم بتطبيق مكنسة كهربائية لطيفة ، واغسل الخرزات عن طريق تدفق 5 مل من محلول الغسيل العازل 1 فوقها.
    ملاحظة: يمكن استخدام أكثر من 5 مل من مخازن الغسيل للغسيل ؛ قد يقلل الغسيل الإضافي من الخلفية ، والارتباط غير المحدد بالخرز.
  9. كرر خطوة الغسيل مع 5 مل من محلول الغسيل 2.
  10. كرر خطوة الغسيل مع 5 مل من محلول الغسيل 3.
  11. بمجرد تدفق مخزن الغسيل النهائي بالكامل عبر الخرزات ، قم بإزالة العمود من المشعب. أضف 100 ميكرولتر من محلول "Lyse" إلى الخرزات وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين سعة 1.7 مل باستخدام ماصة. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لتسوية الخرزات ، وقم بإزالة 50 ميكرولتر من المحلول دون إزعاج الخرزات المستقرة.
    ملاحظة: تستخدم الكواشف في هذه الخطوة وجميع الخطوات اللاحقة مجموعة أدوات تحضير عينة البروتينات المتوفرة تجاريا. توفر المجموعة سير عمل محسن ومبسط لإعداد العينة. ومع ذلك ، يمكن أيضا تنفيذ هذه الخطوات بشكل مستقل عن المجموعة ، باستخدام سير عمل البروتينات التقليدي كما هو موضح في Verma et al.9. إذا ظلت الخرزات عالقة على جانب أو أسفل العمود ، اترك الخرزات التي تم نقلها إلى الأنبوب تستقر ، واستخدم محلول "Lyse" إضافي في الأنبوب لنقل الخرز المتبقي.
  12. ضع الأنبوب على كتلة حرارية / شاكر عند 65 درجة مئوية ، ورجه عند 1,000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق < / > ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة للحد من بقايا السيستين وألكلتها قبل الهضم.
< ص الفئة = "jove_title" >3. هضم البروتين

  1. أعد تعليق التربسين المجفف (أنبوب "Digest" في المجموعة ، المخزن عند -20 درجة مئوية) عن طريق إضافة 210 ميكرولتر من محلول "Resuspend". قم بتحريك المحلول لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان تعليق كل التربسين المجفف.
  2. بعد اكتمال الحضانة ، أضف 50 ميكرولتر من محلول التربسين المعلق إلى الخرز. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية ، مع رجه عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة على الأقل لهضم البروتين.
  3. بمجرد اكتمال عملية الهضم ، انقل المحلول الذي يحتوي على الخرزات إلى عمود دوران ، وأدخل العمود في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين سعة 1.7 مل. قم بتدوير الأنبوب (500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة [RT]) لفصل محلول الببتيد المهضوم عن الخرز.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إجراء معالجة PNGase على الخرزات بمجرد فصلها عن محلول الببتيد ، لإزالة شظايا الببتيد الحيوي من حبات الستربتافيدين. يمكن بعد ذلك نقل عينة الببتيد هذه إلى الأمام خلال ما تبقى من سير العمل كعينة ببتيد ثانوية منفصلة يمكن تحليلها ومقارنتها بالعينة الأولية من التربسين على الخرز. من المرجح أن يوفر نهج PNGase بيانات تكميلية للتربسين على الخرزة ، بالنظر إلى الخصوصية الإضافية للاسبارجين N-glycosylated الذي تم التقاطه بناء على تعديل السلسلة الجانبية القابل للكشف عن MS < فئة sup = "xref" >12. ومع ذلك ، فإن عيب نهج الشطف المتسلسل هذا هو متطلبات ضعف وقت أداة مطياف الكتلة لكل تحليل عينة.
  4. أضف 100 ميكرولتر من محلول "Stop" لإيقاف تفاعل الهضم وتحمض محلول الببتيد.
< p class = "jove_title" >4. تحلية الببتيد

  1. باستخدام محول أنبوبي ، ضع عمود تحلية المياه في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين سعة 1.7 مل. أضف محلول الببتيد المحمض بالكامل إلى العمود. قم بتدوير العمود (3,800 × جم لمدة 3 دقائق) بحيث يتدفق المحلول عبر العمود. ترتبط الببتيدات الآن بالعمود. تجاهل التدفق.
  2. أضف 200 ميكرولتر من محلول "اغسل 1" إلى العمود وقم بالدوران (3,800 × جم لمدة 3 دقائق ، RT). تجاهل التدفق.
  3. أضف 200 ميكرولتر من محلول "Wash 2" إلى العمود وقم بالتدوير (3,800 × جم لمدة 3 دقائق ، RT). تجاهل التدفق.
  4. انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين سعة 1.7 مل مسمى 1.7 مل. أضف 100 ميكرولتر من محلول "Elute" إلى العمود وقم بالدوران (3,800 × جم لمدة 3 دقائق ، RT). أضف 100 ميكرولتر أخرى من محلول "Elute" إلى العمود وقم بالدوران (3,800 × جم لمدة 3 دقائق ، RT). يتم الآن مسح الببتيدات من العمود إلى الأنبوب.
  5. ضع محلول الببتيد في جهاز طرد مركزي مفرغ واتركه يجف طوال الليل. ضع الببتيدات المجففة عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للقياس الكمي ، وتحليلها على مطياف الكتلة.
< p class = "jove_title" >5. إعادة تعليق الببتيد والقياس الكمي

  1. أعد تعليق الببتيدات المجففة في 20 ميكرولتر من المذيب A (0.1٪ حمض الفورميك ، 2٪ أسيتونيتريل).
  2. الطرد المركزي الببتيدات المعلقة (17,200 × جم لمدة 10 دقائق) لحبيبات أي حطام غير قابل للذوبان.
  3. قم بإعداد معايير الببتيد لمقايسة القياس الكمي للببتيد اللوني.
    1. ضع 5 ميكرولتر من محلول مخزون الببتيد 1,000 مجم / مل في بئر واحد من لوح 96 بئر.
    2. قم بإجراء تخفيف تسلسلي من سبع خطوات في اللوحة بالماء منزوع الأيونات (DI) ، على النحو التالي ، مع 5 ميكرولتر من كل معيار لكل بئر: 1,000 مجم / مل ، 500 مجم / مل ، 250 مجم / مل ، 125 مجم / مل ، 62.5 مجم / مل ، 31.25 مجم / مل ، و 15.625 مجم / مل. ضع 5 ميكرولتر من ماء DI في بئر ثامن للفراغ.
  4. ضع 4 ميكرولتر من ماء DI في ثلاثة آبار منفصلة من الصفيحة المكونة من 96 بئرا. أضف 1 ميكرولتر من محلول الببتيد المعلق إلى كل بئر ، ليصبح الحجم الإجمالي 5 ميكرولتر < br / > ملاحظة: عند سحب محلول الببتيد للقياس الكمي، قم بسحب الأنبوب بعناية من أعلى المحلول لمنع إزعاج أي حطام مستقر.
  5. احسب مقدار كاشف العمل المطلوب (45 ميكرولتر مطلوب لكل بئر). تحضير الحجم المطلوب من كاشف عمل الفحص اللوني ؛ دوامة كاشف العمل لضمان الخلط السليم للمكونات.
  6. أضف 45 ميكرولتر من كاشف العمل إلى كل من الآبار القياسية والعينات.
    ملاحظة: اجعل المعايير مكررة ، واستخدم ماصة متعددة القنوات لضمان الحد الأدنى من الاختلاف في توقيت إضافة الكاشف إلى الآبار.
  7. غطي اللوحة بورق الألمنيوم واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  8. قم بتحليل اللوحة على قارئ لوحة آلي. استخدم قيم الامتصاص المسجلة للعينات القياسية لإنشاء منحنى قياسي خطي. حدد معادلة المنحنى القياسي وقيمة R2. إذا كانت قيمة R2 معقولة (≥0.95) ، فاستخدم المنحنى القياسي لتحديد تركيز الببتيدات المعلقة ، مع احتساب التخفيف الخمسة أضعاف في لوحة الفحص اللوني.
< p class = "jove_title" >6. تحليل قياس الطيف الكتلي الترادفي للكولوماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) للببتيدات المهضومة

  1. اضبط تركيز عينات الببتيد إلى 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر عن طريق إضافة المذيب A ، ونقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب ربط منخفض البروتين سعة 0.6 مل.
  2. ضع الأنبوب في جهاز أخذ العينات الآلي LC.
  3. قم بتعيين معلمات LC و MS / MS ، وفقا ل <الفئة القوية = "xfig" >الشكل 2 و <فئة قوية = "xfig" >الشكل 3.
  4. حقن 5 ميكرولتر (1 ميكروغرام) من عينة الببتيد في إعداد LC-MS / MS للتحليل.
    ملاحظة: إعدادات LC-MS/MS الموضحة هنا تمثل الرسوم التوضيحية فقط. اعتمادا على توفر أداة LC و MS ، يمكن للمستخدمين تعديل إعدادات تدرج LC ومعلمات MS / MS للحصول على تغطية بروتيوم عميقة. بالنسبة لهذه الورقة ، تم إجراء تحليل بيانات MS باستخدام MaxQuant https://www.maxquant.org/ ، وتم إجراء تحليل البيانات الثانوي باستخدام Perseus https://maxquant.net/perseus/ ، وتحليل المسار باستخدام https://reactome.org/.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه التجربة ، قمنا بتمييز بروتين سطح الخلية لخط الخلايا السرطانية عن طريق تسمية بروتينات الغشاء N-glycosylated للخلايا السليمة بالبيوتين ، وإثراء هذه البروتينات المصنفة من محللة الخلية بأكملها باستخدام سحب النيوترافيدين (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1). علاوة على ذلك ، أجرينا تحليل البروتين باستخدام LC-MS / MS لتوصيف بروتينات سطح الخلية المخصبة. على عكس تحليل بروتين الخلية الكاملة ، كان الهدف هنا هو توصيف بروتينات سطح الخلية فقط. ومن ثم ، بدأنا بمدخلات عينة من 3.5 × 107 خلايا ورم البلازما AMO-1. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي هي أداة قوية مكنت من التوصيف غير المتحيز لآلاف البروتينات غير المعروفة على نطاق مستحيل سابقا. يسمح لنا هذا النهج بتحديد البروتينات وقياسها ، بالإضافة إلى جمع مجموعة من الأفكار حول القدرات الهيكلية والإشارات للخلايا والأنسجة ، من خلال توصيف مجموعة متنوعة من البروتينات الموجودة في عينة معينة. بالانتقال إلى ما هو أبعد من التنميط العالمي للبروتين في العينة ، يسمح لنا قياس الطيف الكتلي بتوصيف العديد من تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) على هذه البروتينات ، مما يوفر لمحة أعمق عن مراحل مسارا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور كمال ماندال (قسم الطب المخبري ، UCSF) للمساعدة في إعداد تشغيل LC-MS / MS ، و Deeptarup Biswas (BSBE ، IIT Bombay) للمساعدة في تحليل البيانات ، والدكتورة أودري ريفز (قسم الطب المخبري ، UCSF) للمساعدة في تحليل البيانات. العمل ذي الصلة في A.P.W. مختبر مدعوم من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 CA226851 و Chan Zuckerberg Biohub. تم عمل الشكل 1 والشكل 2 ب باستخدام BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< قوية > مجموعات < / قوية>
96X iST طقمPreOmicsP.O.00027طقم تحضير عينة البروتينات. يتضمن كواشف للاختزال والألكلة والهضم. وتشمل أيضا أعمدة وكواشف تحلية المياه.
الببتيد الكمي Pierce Quantimetric Colorimetric PeptideThermo23275. يتضمن معايير الببتيد ومكونات الكواشف العاملة.
<قوي > كواشف < / قوي >
أسيتونيتريلفيشرA955-1
بيكربونات الأمونيومميليبور سيجما09830-1 كجم
بيوسيتين هيدرازيدبيوتيوم90060
D-PBS (بدون أملاح الكالسيوم والمغنيسيوم)مرفق زراعة الخلايا UCSFCCFAL003-225B01
حمض الفورميكهانيويل94318
وقف البروتياز ومثبط الفوسفاتيز كوكتيل حراري للاستخدام مرة واحدة1861280
عالي السعة نيوترافيدين راتنج الاغاروزالحراري29204
بالمحلول الملحي للفوسفاتCCFAL001-22J01
RIPA Lysis Buffer ، 10xMillipore Sigma20-188
كلوريد الصوديومفيشرBP358-212
ميتابريدات الصوديومألفا إيسار13798
صبغة زرقاء تريبان (0.4٪)جيبكو15250-061
فائق النقاء 0.5 متر EDTA ، درجة الحموضة 8.0Invitrogen15575-038
اليوريا (درجة البروتينات) VWRM123-1KG
< قوي > المعدات < / قوي>
TC20 عداد الخلايا الآليBio-Rad1450102
PrismR الطرد المركزيالصغير Labnet InternationalC2500-R-230V
SonicatorVWRبرانسون سونيفاير 240
فراغ المشعبPromega PromegaVac-Man
اهتزاز HeatblockEppendorf EppendorfThermomixer C
طرف إلى طرف دوارLabnetمسدس قابل للتعديل
LCThermoUltimate 3000 HPLC و UHPLC
Q Exactive Plus Hybrid رباعي الأقطاب Orbitrap مطياف الكتلةThermoIQLAAEGAAPFALGMBDK
قارئ صفيحةدقيقة BiotekBiotek Synergy 2 & nbsp;
مكثف الفراغLabconco7810010
<قوي> الإمدادات< / قوي>
1.5 مل أنابيب البروتين LoBindEppendorf22431081
1.7 مل أنابيب
أعمدة الترشيحBio-Rad7326008
SpinColumn Thermo69725
تحضير عينة طقم قياس مرفق زراعة الخلايامن الطرد المركزي الدقيقة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  2. Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
  3. Bausch-Fluck, D., et al. The in silico human surfaceome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 10988-10997 (2018).
  4. Takahashi, Y., et al. Research advance in tumor specific antigens: A narrative review. AME Medical Journal. 6, 35(2021).
  5. Li, Y., Qin, H., Ye, M. An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling. Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).
  6. Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).
  7. Chandler, K. B., Costello, C. C. Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities. Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).
  8. Ferguson, I. D., et al. The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance. Nature Communications. 13 (1), 4121(2022).
  9. Karcini, A., Lazar, I. M. The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications. Scientific Reports. 12 (1), 10847(2022).
  10. Köhnke, T., et al. Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML. Biomarker Research. 10 (1), 43(2022).
  11. Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (177), e61786(2021).
  12. Leung, K. K., et al. Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).
  13. Nix, M. A., et al. Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL. Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).
  14. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  15. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  16. Hosen, N., et al. The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).
  17. Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery. Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).
  18. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).
  19. Itzhak, D. N., et al. A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons. Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).
  20. Kirkemo, L. L., et al. Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells. eLife. 11, 73982(2022).
  21. Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows. Current Protocols. 1 (3), 85(2021).
  22. Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).
  23. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  24. Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One. 10 (3), 0121314(2015).
  25. Griss, J., et al. ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).
  26. Waas, M., et al. SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates. Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).
  27. Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
  28. van Oostrum, M., et al. Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps. Nature Communications. 10 (1), 5734(2019).
  29. Berg Luecke, L., Gundry, R. L. Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies. Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Surface ProteomeSurfaceome AnalysisCell Surface CaptureMass Spectrometry ProteomicsMembrane Protein EnrichmentPlasma Membrane ProteinsLabel Free QuantificationLiquid ChromatographyPeptide QuantificationTargeted Proteomics

Related Articles