مقالة منهجية

طرق تصور العضيات داخل الخلايا

DOI:

10.3791/64966

⸱

مارس 3, 2023

 , 
1Chan Zuckerberg Biohub, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 3Programs in Human Genetics and Biological Sciences, University of California, San Francisco

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقالات التي تمت مناقشتها:

Aishwarya، R. et al. تصور التوطين تحت الخلوي لبروتين في القلب باستخدام وضع العلامات المناعية بوساطة النقاط الكمومية متبوعا بالفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. مجلة التجارب المتصورة.(187) ، e64085 (2022).

Liu، B. et al. تصور الانقسام مع الأصباغ الفلورية للميتوكوندريا والليزوزوم. مجلة التجارب المتصورة.(189) ، e64647 (2022). < p class = "jove_content" >Liu ، CY ، Zhu ، J. ، Xie ، Z. تصور عضيات الخميرة بعلامات البروتين الفلورسنت. مجلة التجارب المتصورة.(182) ، e63846 (2022). فئة

Zhao ، X. ، Guo ، S. مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لتتبع الالتقام الخلوي Notch / Delta أثناء الانقسام غير المتماثل لأسلاف الخلايا الدبقية الشعاعية لأسماك الزرد. مجلة التجارب المتصورة. 65030 (2022).

Park ، S. ، Zhuang ، Y. ، Shi ، X. يتيح الفحص المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM) التصوير فائق الدقة ووضع العلامات عالية الكفاءة. مجلة التجارب المرئية.(188) ، e63793 (2022).

افتتاحية

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطورت جميع الكائنات متعددة الخلايا على الأرض ، بما في ذلك والنباتات ، من حقيقيات النوى أحادية الخلية ~ 1.7 مليار سنة منذ1. تختلف الخلايا حقيقية النواة عن بدائيات النوى البدائية ، وتحتوي على نواة مرتبطة بالغشاء والعديد من العضيات المحاطة بالغشاء داخل السيتوبلازم ، بما في ذلك الميتوكوندريا ، وجهاز جولجي ، والشبكة الإندوبلازمية (ER) ، والليزوزومات ، والحويصلات. تشكل هذه العضيات مقصورات يتم فيها توطين الوظائف البيولوجية المتخصصة والأنشطة الأيضية عالية الكفاءة. نظرا للدقة المحدودة للفحص المجهري الضوئي ، تحتوي معظم العضيات داخل الخلايا على هياكل وظيفية تقع تحت حد حيود الضوء ، مما يجعل تصورها أمرا صعبا2. بدأت تقنيات وضع العلامات المجهرية والبيولوجية المبتكرة في تمكين التصور عالي الدقة للبنى فائقة الدقة والديناميكيات في الجسم الحي للعضيات. تجمع هذه المجموعة بين الأساليب الحديثة التي نجحت في تصنيف وتصوير عضيات مختلفة داخل الخلايا عبر أنواع مختلفة ، وبالتالي عززت فهمنا للتنظيم الزماني المكاني لبيولوجيا العضية.

في العقود الأخيرة ، سهل تطوير أجهزة استشعار الفلورسنت ووضع العلامات على البروتينات في الخلايا الحية بشكل كبير فهمنا لديناميكيات الشبكات داخل الخلايا ، ونقل الإشارات ، والتفاعلات بين الخلية والخلايا. باستخدام طرق تركيبية غير عضوية متقدمة ، تم اختراع بلورات نانوية لأشباه الموصلات الفلورية ذات الحجم النانوي ، والمعروفة أيضا باسم النقاط الكمومية أو QD ، كفئة جديدة من المراسلين البصريين. عادة ما تكون جزيئات QD في حدود 2-10 نانومتر ولها حساسية عالية للضوء واستقرار وسمية خلوية منخفضة للخلايا. ظهرت جزيئات QD كبدائل للأصباغ العضوية وبروتينات الفلورسنت لتصوير العمليات داخل الخلايا بدقة عالية. في البروتوكول الذي أعده Aishwarya et al. ، يصف المؤلفون وضع العلامات المناعية بوساطة QD متبوعا بالتصوير باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) 3. من خلال إجراء وضع العلامات والتصوير QD المستهدف للأجسام المضادة تحت TEM بدقة فائقة ، نجح المؤلفون في تصور توطين Sigmar1 على عضيات خلوية متعددة في خلايا قلب الفأر البالغة وسلطوا الضوء على إثرائها على الجسيمات الحالة وأغشية الميتوكوندريا. بالإضافة إلى التأكيد على الدقة العالية والحساسية العالية ل QD-TEM ، يذكر المؤلفون أيضا العديد من عيوب الأساليب. على سبيل المثال ، فإن رابع أكسيد الأوزميوم المستخدم في وضع العلامات المناعية بوساطة QD يدمر خصائص العينة بشكل لا رجعة فيه ، ويعد تحسين خطوات التثبيت وكشف المستضد عنصرا رئيسيا ولكنه صعب لضمان صور عالية الجودة.

بصرف النظر عن QD ، تم تطبيق العديد من الأصباغ المختلفة الأخرى بنجاح لوضع العلامات على العضيات في الخلايا الحية. سهلت هذه الطرق التصوير الحي لعملية التحول أو الإزاحة لعضيات الخلية في الجسم الحي. في بعض الأحيان ، يتم استخدام أصباغ متعددة خاصة بالعضية لتصور أنواع مختلفة من العضيات في وقت واحد. في البروتوكول الذي قدمه Liu و Li et al.4 ، يقدم المؤلفون بروتوكولا مفصلا للتلوين الحي والتصوير لكل من الميتوكوندريا والجسيمات الحالة في خلايا الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEF) باستخدام صبغتين مختلفتين: MitoTracker Green و LysoTracker Red4. في هذه الدراسة ، أظهرت كلتا الصبغتين حساسية عالية للفلورسنت واستقرار خاص بالميتوكوندريا والليزوزومات ، على التوالي. علاوة على ذلك ، نجح المؤلفون في ملاحظة وتسجيل العملية الخلوية الحرجة في الجسم الحي للانقسام الناجم عن فينيل هيدرازون الكربونيل -4 (ثلاثي فلورو ميثوكسي) (FCCP) في خلايا MEF باستخدام البروتوكول. في المناقشة ، ذكر المؤلفون أنه يمكن تطبيق البروتوكول على خطوط خلايا أو خلايا مختلفة من الأنسجة عن طريق تحسين تركيز الصبغة ووقت التلوين.

من خلال الاستفادة من تركيبات المراسل المكونة من بروتينات خاصة بالعضية مدمجة مع علامات الفلورسنت ، يمكن للمرء أن يلاحظ ديناميكيات العضية في الجسم الحي وأنماط التعبير دون وضع العلامات المناعية. في البروتوكول الذي أعده Liu و Zhu et al.5 ، يقدم المؤلفون بروتوكولا مفصلا لتصوير معظم أنواع العضيات تحت الخلوية في الخميرة الناشئة الحية ، Saccharomyces cerevisiae5. بالنسبة للمبتدئين الذين يعملون مع الخميرة الناشئة ، يعد هذا البروتوكول مفيدا لتعلم كيفية تحديد توطين البروتين تحت الخلوي وتتبع العضيات ذات الأهمية باستخدام التصوير بفاصل زمني. يتمثل أحد قيود البروتوكول في أن معظم التركيبات المستخدمة في البروتوكول لا يمكن استخدامها لوضع العلامات على العضيات في الأنواع الأخرى. بالنسبة لأنواع مختلفة من الخلايا حقيقية النواة ، ستظل الأنماط الخاصة بالعضية من البروتينات الفلورية بحاجة إلى التحقق من صحتها عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة للمناعة.

تم تطوير مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لأول مرة من أجل وضع العلامات الحية المحددة لإشارات الشق / دلتا الداخلية في سلائف الأعضاء الحسية ل ذبابة الفاكهة نوتوم6. نظرا للطبيعة الحساسة للجرعة لإشارات Notch / Delta ، فإن التعبير عن بنية المراسل داخل الخلايا غير مناسب لتصور إشارات Notch / Delta في الجسم الحي ، نظرا لأن نسخة إضافية من الجين المنصهر بالمراسل ستقطع الإشارات العادية ، وبالتالي مصير الخلية. في البروتوكول الذي كتبه Zhao و Guo7 ، يطبق المؤلفون اختبار امتصاص الأجسام المضادة لتصوير الاتجار الداخلي Notch / Delta في أسلاف الخلايا الدبقية الكعبرسية لدماغ الزرد النامي7. في البروتوكول ، بعد الحقن الدقيق للأجسام المضادة المقترنة المضادة ل DeltaD-Atto647N بدقة في البطين الخلفي الجنيني 24 حصانا (ساعة بعد الإخصاب) ، يتم تسجيل العملية الكاملة للاتجار الداخلي باستخدام الجسم المضاد المضاد المضاد DeltaD-Atto647N الداخلي في جميع أنحاء انقسام أسلاف الخلايا الدبقية الكعبرية. في الدراسة ، وجد أن مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لا تتداخل مع إشارات Notch / Delta. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتصور إشارات مستقبلات الترابط الغشائي الأخرى ، بالنظر إلى توفر جسم مضاد للمجال خارج الخلية للبروتين محل الاهتمام.

مكنت التطورات الأخيرة في الفحص المجهري التوسعي (ExM) ، والتي تتضمن توسيع العينة فيزيائيا داخل هيدروجيل قابل للانتفاخ ، من استخدام المجاهر متحد البؤر التقليدية للتصوير فائق الدقة. منذ اختراعها ، تم اختبار ExM مع العديد من الأنواع المختلفة من العينات البيولوجية8. يتمثل أحد التحديات الرئيسية ل ExM في فقدان إشارة الفلورسنت أثناء خطوات البلمرة والهضم. لقد حل ExM للاحتفاظ بالملصقات المطور مؤخرا مشكلة المراسي ثلاثية الوظائف9. في البروتوكول الصادر عن Park et al.10 ، يصف المؤلفون كيفية إجراء ExM للاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM) مع مجموعة من المراسي ثلاثية الوظائف10. يعمل البروتوكول على تحسين التصوير المجهري التوسعي ليس فقط عن طريق منع فقدان الإشارة ولكن أيضا عن طريق تعزيز وضع العلامات عالية الكفاءة باستخدام علامات SNAP أو CLIP. في دراستهم ، نجح المؤلفون في إظهار LR-ExM متعدد الألوان لمجموعة متنوعة من الهياكل تحت الخلوية وحققوا دقة جزيئية واحدة عند الجمع بين LR-ExM والفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي فائق الدقة (STORM).

مع التطور السريع للفحص المجهري فائق الدقة وظهور تقنيات وضع العلامات الفلورية الجديدة ، يمكننا توقع المزيد من التحسينات في طرق وبروتوكولات تصور العضيات داخل الخلايا بدقة غير مسبوقة. تستعد هذه الجهود لتحقيق اختراقات جديدة في فهم ديناميكيات ووظائف العضيات داخل الخلايا.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، ورقم المنحة R01NS120218 ، وجائزة UCSF Mary Anne-Kimble Seed للابتكار ، و Chan Zuckerberg Biohub.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooper, G. The Cell: A Molecular Approach. Second edition. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2000).
  2. Myers, K., Janetopoulos, C. Recent advances in imaging subcellular processes [version 1; peer review: 2 approved. F1000Research. 5, F1000 Faculty Rev 1553(2016).
  3. Aishwarya, R., et al. Visualizing subcellular localization of a protein in the heart using quantum dots-mediated immuno-labeling followed by transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (187), e64085(2022).
  4. Liu, B., et al. Visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome. Journal of Visualized Experiments. (189), e64647(2022).
  5. Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. Journal of Visualized Experiments. (182), e63846(2022).
  6. Le Borgne, R., Schweisguth, F. Unequal segregation of neuralized biases Notch activation during asymmetric cell division. Developmental Cell. 5 (1), 139-148 (2003).
  7. Zhao, X., Guo, S. Antibody uptake assay for tracking Notch/Delta endocytosis during the asymmetric division of zebrafish radial glia progenitors. Journal of Visualized Experiments. , e65030(2023).
  8. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: Principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  9. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).
  10. Park, S., Zhuang, Y., Shi, X. Label-retention expansion microscopy (LR-ExM) enables super-resolution imaging and high-efficiency labelin. Journal of Visualized Experiments. (188), e63793(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

VisualizationIntracellular OrganellesQuantum DotsImmuno labelingTransmission Electron MicroscopyMitophagyFluorescent DyesMitochondriaLysosomeYeast OrganellesFluorescent Protein MarkersNotch Delta EndocytosisAsymmetric DivisionZebrafish Radial Glia ProgenitorsLabel retention Expansion MicroscopySuper resolution Imaging

مقالات ذات صلة