يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحرير فعال لقاعدة الأدينين دون قيود PAM لبناء نموذج دقيق لمرض الزرد باستخدام zSpRY-ABE8e.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحرير قاعدة فعال بدون PAM لنمذجة الزرد للأمراض الوراثية البشرية باستخدام zSpRY-ABE8e
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
زادت تقنية CRISPR / Cas9 من قيمة أسماك الزرد لنمذجة الأمراض الوراثية البشرية ، ودراسة التسبب في الأمراض ، وفحص الأدوية ، لكن قيود الشكل المجاور للفضاء الأولي (PAM) تشكل عقبة رئيسية أمام إنشاء نماذج حيوانية دقيقة للاضطرابات الوراثية البشرية الناجمة عن متغيرات النوكليوتيدات المفردة (SNVs). حتى الآن ، أظهرت بعض متغيرات SpCas9 ذات التوافق الواسع مع PAM كفاءة في الزرد. أتاح تطبيق محرر قاعدة الأدينين المحسن بوساطة SpRY (ABE) ، zSpRY-ABE8e ، و gRNA المعدل صناعيا في الزرد تحويل قاعدة الأدينين والجوانين بكفاءة دون قيود PAM. الموصوف هنا هو بروتوكول لتحرير قاعدة الأدينين بكفاءة دون قيود PAM في الزرد باستخدام zSpRY-ABE8e. عن طريق حقن خليط من zSpRY-ABE8e mRNA و gRNA المعدل صناعيا في أجنة الزرد ، تم بناء نموذج مرض الزرد مع طفرة دقيقة تحاكي موقعا مسببا للأمراض لعامل نضج الريبوسوم TSR2 (tsr2). توفر هذه الطريقة أداة قيمة لإنشاء نماذج دقيقة للأمراض لدراسة آليات المرض والعلاجات.
المقدمة
المتغيرات أحادية النوكليوتيدات (SNVs) التي تسبب طفرات خاطئة أو هراء هي المصدر الأكثر شيوعا للطفرات في الجينوم البشري1. لتحديد ما إذا كان SNV معين مسببا للأمراض ، ولإلقاء الضوء على التسبب فيه ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية دقيقة2. الزرد هي نماذج جيدة للأمراض البشرية ، وتظهر درجة عالية من التماثل الفسيولوجي والجيني مع البشر ، ودورة نمو قصيرة ، وقدرة إنجابية قوية ، وهو أمر مفيد للبحث في الخصائص والآليات المسببة للأمراض ، وكذلك فحص الأدوية3.
تم تطبيق نظام التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / Cas9 على نطاق واسع في تحرير الجينوم لمختلف الأنواع ، بما في ذلك ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت هذه الدراسة في الامتثال الصارم للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والاستخدام بجامعة جنوب الصين للمعلمين.
1. تحضير gRNA المعدل صناعيا و zSpRY-ABE8e mRNA
- تصميم gRNA وفقا للمنشورات السابقة37,38.
- حدد NRN بشكل تفضيلي كتسلسل PAM ، حيث يظهر zSpRY-ABE8e تفضيلا أعلى ل NRN PAM من NYN PAM (حيث R هي A أو G ، و Y هي C أو T)18. تأكد من أن نيوكليوتيد الأدينين المستهدف موجود في نافذة التحرير النشطة للغاية (النوكليوتيدات الثالثة إلى التاسعة على طول الفاصل الأولي).
- اطلب EasyEdit sgRNA (EE gRNA) المعدل ب 2′-O-methyl-3′-....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم الإبلاغ عن طفرة TSR2 لتسبب فقر الدم الماسي Blackfan (DBA) 42. هنا ، تم إنشاء نموذج DBA الزرد مع طفرة tsr2 (M1V) باستخدام استراتيجية i-Silence. تم تحويل الأدينين من كودون البداية من الزرد tsr2 بنجاح إلى الجوانين باستخدام zSpRY-ABE8e (الشكل 3).
أظهر تحليل EditR لنتائج تسلسل سانجر أن هناك تداخلا في A / G في قاعدة الأدينين لكودون بدء tsr2 (الشكل 4).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول بناء نموذج مرض الزرد باستخدام المحرر الأساسي zSpRY-ABE8e. بالمقارنة مع مسار HDR التقليدي لاستبدال القاعدة ، يمكن لهذا البروتوكول تحقيق تحرير أساسي أكثر كفاءة وتقليل حدوث indels. في الوقت نفسه ، يتضمن هذا البروتوكول تنفيذ استراتيجية الضربة القاضية الجينية i-Silence المقترحة مؤخرا في الزرد. مجتمعة ، سيعزز zSpRY-ABE8e تطبيق نماذج الزرد في أبحاث الأمراض.
تعد التأثيرات خارج الهدف مشكلة شائعة في أنظمة CRISPR / Cas9. بالنظر إلى التقييد الأقل ل PAM ، قد يكون التأثير خارج الهدف ل zSp.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر باربرا جاربرز ، دكتوراه ، من Liwen Bianji (Edanz) لتحرير النص الإنجليزي لمسودة هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحث والتطوير في المنطقة الرئيسية لمقاطعة قوانغدونغ (2019B030335001) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFE0106700) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32070819 ، 31970782) ، وبرنامج صندوق البحوث في مختبر مقاطعة قوانغدونغ الرئيسي للبيولوجيا المسببة للأمراض وعلم الأوبئة للحيوانات الاقتصادية المائية (PBEA2020YB05).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5٪ Agarose تستخدم لصنع لوحة حقن |
| الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| أطباق زراعة الخلايا | طقم الاستنساخ Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step | Vazyme | C115 | لاستنساخ التسريب |
| خدمة تحسين الكودون | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | الطول: 32 مم ، السعة: 0.5 مو ؛ L |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Fallps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | تستخدم لكسر meedle |
| Flaming / Brown Micropipette Puller | أداة التلعثم | P-97 | تستخدم لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | تستخدم لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل |
| صندوق مناخ اصطناعي ذكي | TENLIN | PRX-1000A | تستخدم لاستزراع أجنة أسماك الزرد |
| ميثيل السليلوز | سيجما-ألدريتش | M0512 | تستخدم لإصلاح سمك الزرد عند تصوير |
| أطراف ماصة اللودر الدقيق & نب سب. | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| طقم Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit لطفرات الهواء المضغوط |
| ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | ||
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit لتنقية الحمض النووي الريبي |
| خدمة تسلسل Sanger | Sangon Biotech | ||
| ، حبيبات | Sangon | A100173-0500 | هيدروكسيد الصوديوم المستخدمة لاستخراج الجينوم |
| مجهر ستيريو | أوليمبوس & nbsp ؛ | SZX10 | تستخدم لتصوير النمط الظاهري |
| SZ سلسلة تكبير مجهر ستيريو | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit للنسخ في المختبر |
| طقم البلازميد الصغير TIANprep | TIANGEN | DP103-03 | لمجموعة استخراج البلازميد |
| تنقية TIANquick Mini | طقم TIANGEN | DP203-02 | لتنقية البلازميد الخطي |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | يستخدم لتخدير سمك الزرد |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | مكون من Tris & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك المستخدم لاستخراج الجينوم |
| < em>XbaI< / em> | إنجلاند بيولابيس | R0145S | تقييد نوكلياز داخلي يستخدم لخطية البلازميد |
المراجع
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
