مقالة منهجية

الأساليب القائمة على قياس الطيف الكتلي لتحليل بنية البروتين ذات الدرجة العالية

647 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64979

⸱

مارس 3, 2023

 , 
1Biologics Development, Bristol Myers Squibb, 2Eli Lilly and Company

في هذه المقالة

الملخص

المقالات التي تمت مناقشتها: < p class = "jove_content" > Espino ، J. A. ، Jones ، L. M. في الجسم الحي بصمة البروتين الجذري الهيدروكسيل لدراسة تفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans. مجلة التجارب المتصورة. (158) ، e60910 (2020).

Chea ، E. E. ، Rinas ، A. ، Espino ، JA ، Jones ، L. M. توصيف البروتينات الخلوية بأكسدة كيميائية ضوئية سريعة للبروتينات داخل الخلية. مجلة التجارب المتصورة. (157) ، e60911 (2020). فئة < p = "jove_content" > Moorthy ، BS ، Iyer ، L. K. ، Topp ، E. M. مناهج القياس الطيفي الكتلي لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في المساحيق المجففة بالتجميد. مجلة التجارب المتصورة. (98) ، e52503 (2015). < p class = "jove_content" > حبيبي ، واي ، ثيبودو ، سي جيه. منصة قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين وديوتيريوم (HDX-MS) للتحقيق في إنزيمات التخليق الحيوي للببتيد. مجلة التجارب المتصورة. (159) ، e61053 (2020).

Kirsch ، Z. J. ، Arden ، BG ، Vachet ، RW ، Limpikirati ، P. وضع العلامات التساهمية مع ثنائي إيثيل بيروكربونات لدراسة بنية البروتين ذات الترتيب الأعلى عن طريق قياس الطيف الكتلي. مجلة التجارب المتصورة. (172) ، e61983 (2021). < p class = "jove_content" > جونسون ، دي ، بونشون سميث ، ب. ، إسبينو ، جيه إيه ، جيرشينسون ، إيه ، جونز ، إل إم حاضنة منصة مع مرحلة XY متحركة: منصة جديدة لتنفيذ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة داخل الخلية للبروتينات. مجلة التجارب المتصورة. (171) ، E62153 (2021).

Haupt، C. et al. الجمع بين الربط الكيميائي المتقاطع وقياس الطيف الكتلي لمجمعات البروتين السليمة لدراسة بنية تجميعات البروتين متعددة الوحدات الفرعية. مجلة التجارب المتصورة. (129) ، e56747 (2017).

Lento، C. et al. قياس الطيف الكتلي لتبادل تبادل الهيدروجين وديوتيريوم بالرش الكهربائي الذي تم حله بمرور الوقت لدراسة بنية البروتين وديناميكياته. مجلة التجارب المتصورة. (122) ، e55464 (2017). < p class = "jove_content" >Weinberger ، S. R. ، Chea ، E. E. ، Sharp ، JS ، Misra ، S. K. بصمة بروتين الهيدروكسيل الجذري الخالي من الليزر لإجراء تحليل هيكلي عالي المستوى للبروتينات. مجلة التجارب المتصورة. (172) ، e61861 (2021).

Misra ، S. K. ، Sharp ، JS. تمكين التعويض في الوقت الفعلي في الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة للبروتينات لتحديد التغيرات في تضاريس البروتين. مجلة التجارب المتصورة. (163) ، e61580 (2020).

Chaihu، L. et al. تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم القائم على الرحلان الكهربائي الشعري للتوصيف التوافقي للبروتينات مع قياس الطيف الكتلي من أعلى إلى أسفل. مجلة التجارب المتصورة. (172) ، e62672 (2021).

افتتاحية

يعد هيكل الترتيب الأعلى (HOS) جانبا مهما من جوانب توصيف البروتين لأنه يرتبط ارتباطا وثيقا بوظيفة البروتين. يعد قياس الطيف الكتلي (MS) أحد الطرق الرئيسية لتقييم البروتين HOS1. على الرغم من أن الأساليب القائمة على التصلب العصبي المتعدد غير قادرة على حل بنية البروتين بدقة ذرية ، إلا أنها تتمتع بمزايا الدقة المكانية المتوسطة إلى العالية ، والخصوصية العالية ، ومتطلبات كمية العينة المنخفضة ، والإنتاجية العالية ، وقدرات البروتينات.

تقوم مناهج بصمة البروتين القائمة على التصلب العصبي المتعدد بتقييم البروتين HOS من خلال تحليل سطح البروتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة المذيبات ، وعادة ما تقترن بأساليب مختلفة لوضع العلامات الكيميائية. تستهدف الملصقات القابلة للانعكاس ، مثل تبادل الهيدروجين والديوتيريوم (HDX) ، هيدروجين الأميد الفقري في البروتين1،2. تستخدم الملصقات التي لا رجعة فيها إما مواد كيميائية تستهدف بقايا أحماض أمينيةمعينة 3 أو الجذور التي تصنف مجموعة متنوعة من المخلفات المختلفة بسرعة تفاعل أعلى1. يعد الربط الكيميائي المتبادل أيضا جزءا من فئة الملصقات التي لا رجعة فيها ، ومع ذلك فإن ميزته ثنائية التكافؤ تسمح بتحديد القيود المكانية بين موقعين متشابكين ، مما يوفر رؤى طوبولوجية فريدة4،5. يمكن الجمع بين كل هذه الأساليب لتشكيل "صندوق أدوات" ، مما يجعل مرض التصلب العصبي المتعدد أداة قيمة لتوضيح البروتين HOS.

قمنا بتنظيم مجموعة الطرق هذه لتقديم التطورات الحديثة في مجال تحليل البروتين القائم على التصلب المتعدد. تتميز المجموعة الأولى من المقالات بأساليب قائمة على HDX. يصف Habibi و Thibodeaux6 نهج HDX-MS الكلاسيكي المستمر نسبيا من أسفل إلى أعلى. من خلال تبادل الهيدروجين والديوتيريوم (H / D) داخل المحلول في أوقات تبادل متعددة متبوعا بهضم البيبسين على العمود ، يمكن تحديد مستوى امتصاص الديوتيريوم على مستوى الببتيد. عند إجراء التجارب التفاضلية (أي الحالات المرتبطة مقابل الحالات غير المرتبطة) ، تمثل الببتيدات التي تظهر زيادة أو انخفاض مستويات امتصاص الديوتيريوم المناطق التي تشهد تغييرات في HOS. يستخدم المؤلفون تركيبات lanthipeptide لتوضيح سير عمل HDX-MS بشكل جيد.

بصرف النظر عن النهج التصاعدي ، يمكن أيضا إجراء HDX-MS بطريقة من أعلى إلى أسفل ، مما يسمح للمحللين بتطبيق استراتيجيات فصل مختلفة على مستوى البروتين السليم. يستخدم Chaihu et al.7 الرحلان الكهربائي الشعري لفصل حالات البروتين المختلفة أو الأشكال البروتينية التي تتعايش في المحلول. تخضع البروتينات لتبادل H / D أثناء الرحلان الكهربائي أثناء الهجرة في الشعيرات الدموية في محلول الإلكتروليت في الخلفية الدوترية ، ويتبع ذلك تحليل التصلب العصبي المتعدد من أعلى إلى أسفل وتجزئة الطور الغازي لتقييم مستويات امتصاص الديوتيريوم على كل من المستوى العالمي والشظاير. أخيرا ، هناك أيضا طريقتان أخريان في هذه المجموعة تبرزان طرقا مختلفة لتبادل H / D ، وهما التبادل للطاقة المجففة بالتجميد8 والتبادل بعد التأين بالرش الكهربائي9.

تغطي المجموعة الثانية من المقالات طريقة وضع العلامات التي لا رجعة فيها. من بينها ، تستخدم الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة للبروتينات (FPOP) الجذور كأنواع وضع العلامات لتمييز سطح البروتين10،11. من الناحية العملية ، يتم تنشيط بيروكسيد الهيدروجين ضوئيا من خلال الليزر لإنتاج جذور الهيدروكسيل ، والتي تعمل كأنواع وضع العلامات النشطة. يقدم ميسرا وشارب12 استراتيجية لقياس الجرعات الجذرية حيث يتم استخدام الأدينين كمراسل للتركيز الجذري ويستخدم نظام قياس الجرعات الجذرية الخطي لمراقبة استجابة الأدينين. يسمح هذا بالتعويض في الوقت الفعلي لتركيزات جذور الهيدروكسيل ، وبالتالي تطبيع ظروف التفاعل لتقديم قراءة دقيقة. بعد ذلك ، تعاون Weinberger و Chea مع مجموعة Sharp لتطوير منصة FPOP13 خالية من الليزر. من خلال استبدال الليزر الخطير بمصدر ضوء البلازما والجمع بينه وبين قياس الجرعات الجذرية المضمن ونظام جمع العينات الآلي ، فإنهم يطورون ويقدمون حلا متكاملا للباحثين الذين يحتاجون إلى توصيف البروتين HOS.

تستكشف المقالات الثلاث التي كتبها مجموعة جونز14،15،16 إمكانية جلب FPOP وبصمة البروتين إلى الدراسات في الجسم الحي . ميزة هذا النهج غير مسبوقة ، لأنه يسمح بتحليل البروتين HOS في البيئة الأصلية. يفتح التطبيق الناجح لبصمة الأقدام في الخلايا14 وفي Caenorhabditis elegans15 إمكانيات جديدة لتتبع HOS للبروتين بأكمله في حالته الأصلية ، مما يسمح بفهم عميق لبروتين HOS الذي لا يمكن تحقيقه من خلال أدوات أخرى.

طريقة أخرى مهمة لوضع العلامات التي لا رجعة فيها تستخدم الكواشف الكيميائية التي تستهدف بقايا معينة من الأحماض الأمينية3. أبلغ Kirsch et al.17 عن سير عمل جيد الاستخدام لبصمة البروتين من خلال وضع العلامات التساهمية. باستخدام ثنائي إيثيل بيروكربونات ككاشف لوضع العلامات ، يفحص المؤلفون التغيرات في البروتين HOS عن طريق وضع علامات على أنواع قليلة من بقايا الأحماض الأمينية على سطح البروتين. من خلال التجارب التفاضلية متبوعة بالهضم المحلل للبروتين وتحليل التصلب العصبي المتعدد من الأسفل إلى الأعلى ، يسمح سير العمل معا بتحديد التغييرات في إمكانية وصول المذيبات ، والتي ترتبط مباشرة بالتغيرات في HOS.

أخيرا ، يعد الربط الكيميائي المتقاطع نهجا مهما آخر يستخدم الكواشف الكيميائية ثنائية التكافؤ لتسمية البروتينات4،5. تستخدم الروابط المتقاطعة الكيميائية لربط بروتينين قريبين مكانيا من بعضهما البعض ، وغالبا ما يشكلان مركبا هيكليا. أبلغ Haupt et al.18 عن بروتوكول يوضح فيه استخدام الروابط المتقاطعة الكيميائية لفهم بنية مجمعات البروتين. يمكن تحليل مركب البروتين المتقاطع على مستويين مختلفين. من خلال الهضم المحلل للبروتين متبوعا بتحديد مرض التصلب العصبي المتعدد ، تكشف ثنائيات الببتيدات المتشابكة عن المواقع المتفاعلة لمركب البروتين. عند تحليل العينة المتشابكة من خلال الكتلة السليمة ، فإن المعلومات المتكافئة عن الوحدات الفرعية للبروتين داخل المجمع متاحة بسهولة.

للتلخيص ، لقد شهدنا تطورا كبيرا في الأدوات القائمة على التصلب العصبي المتعدد لتحليل البروتين HOS على مدى العقود الثلاثة الماضية. البصمة التي لا رجعة فيها والقابلة للانعكاس إلى جانب تحليل التصلب العصبي المتعدد تكمل بعضها البعض ، وتساهم معا بشكل كبير في توصيف البروتين HOS. تمثل الأعمال المدرجة في مجموعة الأساليب هذه طرقا تحديق في مجال تحليل البروتين القائم على التصلب العصبي المتعدد. تعد هذه الدراسات مصدرا قيما للباحثين الذين يحاولون استخدام الأساليب القائمة على التصلب العصبي المتعدد للإجابة على الأسئلة الحرجة. من منظور أوسع ، يعد دمج بيانات البصمة في التنبؤات الهيكلية أمرا بالغ الأهمية لكسر حد الدقة المكانية في الأساليب القائمة على MS. توجد أعمال رائدة توضح جدوى مثل هذا النهج19،20. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تكامل المنصة أمرا بالغ الأهمية أيضا ، حيث أن هذه الأساليب مكملة لبعضها البعض وتوفر رؤى من وجهات نظر مختلفة21،22. توضح الأساليب الواردة في هذه المجموعة قوة هذا التكامل ، وسيكون هناك تطور مستمر في هذا الاتجاه. مع كل هذه التطورات ، نما النهج القائم على التصلب العصبي المتعدد إلى ما هو أبعد من تحديد الوزن الجزيئي ، وسيشهد النمو المستمر في هذا المجال في العقود القادمة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

المؤلفون ليس لديهم أي اعترافات.

المراجع

  1. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: Fundamentals and applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2020).
  2. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224-1234 (2011).
  3. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing protein structure by amino acid-specific covalent labeling and mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (5), 785-815 (2009).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein–protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Leitner, A. Cross-linking and other structural proteomics techniques: How chemistry is enabling mass spectrometry applications in structural biology. Chemical Science. 7 (8), 4792-4803 (2016).
  6. Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes. Journal of Visualized Experiments. (159), e61053(2020).
  7. Chaihu, L., et al. Capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e62672(2021).
  8. Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders. Journal of Visualized Experiments. (98), e52503(2015).
  9. Lento, C., et al. Time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  10. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  11. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  12. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61580(2020).
  13. Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861(2021).
  14. Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911(2020).
  15. Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910(2020).
  16. Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator with movable XY stage: A new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153(2021).
  17. Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983(2021).
  18. Haupt, C., et al. Combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747(2017).
  19. Biehn, S. E., Lindert, S. Accurate protein structure prediction with hydroxyl radical protein footprinting data. Nature Communications. 12 (1), 341(2021).
  20. Biehn, S. E., Lindert, S. Protein structure prediction with mass spectrometry data. Annual Review of Physical Chemistry. 73, 1-19 (2022).
  21. Zhang, M. M., et al. Epitope and paratope mapping of PD-1/nivolumab by mass spectrometry-based hydrogen-deuterium exchange, cross-linking, and molecular docking. Analytical Chemistry. 92 (13), 9086-9094 (2020).
  22. Zhang, M. M., et al. An integrated approach for determining a protein–protein binding interface in solution and an evaluation of hydrogen–deuterium exchange kinetics for adjudicating candidate docking models. Analytical Chemistry. 91 (24), 15709-15717 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Protein InteractionsHydroxyl Radical FootprintingPhotochemical OxidationHydrogen-deuterium ExchangeCovalent LabelingProtein AnalysisElectrospray IonizationChemical Cross-linkingMulti-subunit AssembliesConformational Characterization
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.