يصف البروتوكول الحالي التصوير الفلوري NAD (P) H لعمر أمعاء الفئران المزروعة المصابة بالطفيلي الطبيعي Heligmosomoides polygyrus ، والذي يسمح للمرء بالتحقيق في عمليات التمثيل الغذائي في كل من الأنسجة المضيفة والطفيلية بطريقة محلولة مكانيا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يصف البروتوكول الحالي التصوير الفلوري NAD (P) H لعمر أمعاء الفئران المزروعة المصابة بالطفيلي الطبيعي Heligmosomoides polygyrus ، والذي يسمح للمرء بالتحقيق في عمليات التمثيل الغذائي في كل من الأنسجة المضيفة والطفيلية بطريقة محلولة مكانيا.
الطفيليات بشكل عام لها تأثير سلبي على صحة مضيفها. وهي تمثل عبئا صحيا ضخما، لأنها تؤثر على صحة الإنسان أو الموبوء على الصعيد العالمي، وبالتالي تؤثر على النتائج الزراعية والاجتماعية والاقتصادية. ومع ذلك ، فقد تم وصف التأثيرات التنظيمية المناعية التي يحركها الطفيليات ، مع الأهمية العلاجية المحتملة لأمراض المناعة الذاتية. في حين أن التمثيل الغذائي في كل من المضيف والطفيليات يساهم في دفاعهم وهو أساس بقاء الديدان الخيطية في الأمعاء ، إلا أنه ظل غير مدروس إلى حد كبير بسبب نقص التقنيات الكافية. لقد قمنا بتطوير وتطبيق التصوير الفلوري NAD (P) H على أنسجة الأمعاء المزروعة أثناء الإصابة بالديدان الخيطية الطبيعية Heligmosomoides polygyrus لدراسة عمليات التمثيل الغذائي في كل من المضيف والطفيليات بطريقة محلية محلية. يعتمد استغلال العمر الفلوري للإنزيمات المساعدة نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) ونيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الفوسفات (NADPH) ، المشار إليها فيما بعد NAD (P) H ، والتي يتم الحفاظ عليها عبر الأنواع ، على حالة ارتباطها وموقع الارتباط على الإنزيمات التي تحفز عمليات التمثيل الغذائي. مع التركيز على الإنزيمات المعتمدة على NAD (P) H الأكثر تعبيرا عنها بكثرة ، تم تمييز مسارات التمثيل الغذائي المرتبطة بتحلل السكر اللاهوائي ، والفسفرة المؤكسدة / تحلل السكر الهوائي ، والانفجار التأكسدي القائم على أكاسيد النيتروجين ، كآلية دفاع رئيسية ، وتم تمييز الحديث الأيضي بين المضيف والطفيلي أثناء الإصابة.
تفرض العدوى الطفيلية عبئا كبيرا على صحة الإنسان1،2. لوحظ وجود علاقة بين ارتفاع أمراض المناعة الذاتية وانخفاض العدوى الطفيلية في البلدان الصناعية. من المعروف أن الطفيليات يمكن أن يكون لها آثار مفيدة عن طريق تثبيط الاستجابات المناعية المفرطة للمضيف. H. polygyrus هو طفيلي طبيعي موجود في الأمعاء في القوارض ، ومن المعروف أن هذا الطفيلي يحفز آليات التنظيم المناعي التي تقلل من الاستجابة المناعية المضادة للطفيليات للمضيف ، من بين آليات أخرى ، تحريض الخلايا التائية التنظيمية (Treg) في المضيف المصاب3،4،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية لحماية وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الألمانية لأخلاقيات لحماية (G0176/16 و G0207/19). يصف البروتوكول الحصول على بيانات التصوير مدى الحياة NAD (P) H وتقييم البيانات ، مما يسمح للمرء بتقييم نشاط التمثيل الغذائي العام والمسارات الأيضية المحددة في كل من الأمعاء المضيفة والطفيليات عند الإصابة بالديدان الخيطية المعوية الطبيعية للفئران ، H. polygyrus. لهذا الغرض ، أصيبت إناث الفئران C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين 10 و 12 أسبوعا ب 200 يرقات من المرحلة 3 (L3). في نقاط زمنية مختلفة من العدوى ، تم التضحية بالفئران المصابة ، وتم استئصال الاثني عشر وإعدادها للتصوير كما هو موضحسابقا 33. تم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
باستخدام إجراء NAD (P) H-FLIMالحالي 28،29،33 جنبا إلى جنب مع طريقة تحليل الفاسور الموصوفة ، تم قياس النشاط الأيضي ومسارات التمثيل الغذائي في الاثني عشر السليمة والمصابة في اليوم 6 واليوم 10 واليوم 12 واليوم 14 بعد الإصابة بالديدان الخيطية المعوية الفئرانية H. polygyrus.
صلاحية الأنسجة المعوية المحفوظة في الاثني عشر المستأصل الذي كشفت عنه NAD (P) H-FLIM
من أجل التحقيق في نش.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تحدث الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول أثناء الإعداد وعند العثور على عائد الاستثمار. تمثل ألياف الطعام المهضوم جزئيا تحديا للتصوير ، ويرجع ذلك أساسا إلى التلألؤ الداخلي للألياف المتداخلة مع مضان NAD (P) H ، ولكن أيضا بسبب إشارة التوليد التوافقية. من الأهمية بمكان العثور على عائد استثمار خال من البراز. كنا نهدف إلى تجنب قياس المناطق التي تحتوي على البراز. تم تجنب الغسيل لأن هذا يؤثر على سلامة الزغابات الهشة ويؤثر على لزوجة المخاط. بالإضافة إلى ذلك ، يفضل أن يستمر إجراء التحضير بأكمله حوالي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
نشكر روبرت غونتر على دعمهم الفني الممتاز. الدعم المالي من مجلس البحوث الألماني (DFG) بموجب المنحة SPP2332 HA2542 / 12-1 (S.H.) ، NI1167 / 7-1 (R.A.N.) ، HA5354 / 11-1 (A.E.H.) ، و RA2544 / 1-1 (S.R.) ، بموجب المنحة SFB1444 ، P14 (R.A.N. ، A.E.H.) ، بموجب المنحة HA5354 / 8-2 (A.E.H.) ، وبموجب المنحة GRK2046 B4 و B5 (S.H. ، S.R.) و HA2542 / 8-1 (S.H.) معترف بها إلى حد كبير. حصل WL على زمالة الدكتوراه من Berliner Hochschule für Technik ، كلية العلوم التطبيقية ، برلين في الفيزياء الطبية / الهندسة الفيزيائية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agarose | Thermo fisher | J32802.22 | فائق النقاء |
| FST أدوات العلوم الدقيقة | 14108-09 | Bluund-blund 14 سم | |
| Bodipy c12 | thermo fisher | D3822 | 1 مجم وحدات تحكم صلبة |
| ، صمام مزدوج ، TCSPC | LaVision Biontech | مخصص | TrimScope II |
| DMSO | ثيرمو فيشر | D12345 | 3 مل |
| مرشحات | Chroma | 755 | 466 & plusmn; 20, 525 ± 25, 593 ± 20, 655 ± 20 نانومتر |
| ورقة فوليودراب | هارتمان | 277500 | |
| قفازات | سيجما ألدريتش | Z423262 | شعلة النتريل |
| هالوجين | لايكا | تم التخلص التدريجي من هذا العنصر ولم يعد متوفرا | KL 1500 LCD |
| hPMT | Hamamatsu, ألمانيا | H7422 | GaAsP |
| Ilastik | Netlify | البرمجيات الحرة | جافا الواجهة الخلفية |
| ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة | البرمجيات الحرة | فيجي - الإضافات القياسية |
| Imspector | LaVision Biontech-Vers | . 208 | |
| المرحلة الحيوية | LaVision Biontech | نظام عدسة | TrimScope II |
| مخصص 20x | Zeiss | مخصص | W-plan-apochom 20x Waterimmersion NA 1.05 |
| شعلة بخار الزئبق | LaVision Biontech | فرشاة مجهرية مخصصة | |
| فيشر علمي | 22-020-002 | 85 مم | |
| مجهر | LaVision Biontech | مخصص | TrimScope II |
| راسم الذبذبات | رود & شوارتز | 1326.2000.22 | |
| PBS | سيجما ألدريتش | AM9624 | 0.5 لتر |
| طبق بتري | سيجما ألدريتش | P5606 | 40 × 15 مم |
| ماصة | ثيرم حراري فيشر | 4651280N | Einkanalpipette |
| نصائح الماصة | فيشر حراري | 94056980 | Spitzen mit Filter |
| PMT | Hamamatsu ، اليابان | H7422 | GaAsP |
| Python | Python Software Foundation | البرمجيات الحرة | Anaconda 3.7 Spyder IDE, المكتبات القياسية مع |
| مجهر KYTE Sterio | Leica | تم التخلص التدريجي من هذا العنصر ولم يعد متاحا | M26 ، تكبير 6.3x |
| Ti: Sa LASER CHAMELION ULTRA II | متماسك ، APE-690-1080 | نانومتر قابل للضبط ، 80 ميجا هرتز | |
| Tissueglue | 3M | 51115053603 | 3 مل |
| ملاقط | FST أدوات العلوم الدقيقة | 11049-10 | blund ، graefe ، ملاقط ملائكة |
| FST أدوات العلوم الدقيقة | 91197-00 | Dumont ، منحني |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً