$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تاريخيا ، اعتمد العلماء بشكل كبير على الدراسات التي أجريت على لتحديد ما إذا كان المنتج الطبي (أي الدواء أو الجهاز الطبي) آمنا قبل اختباره على البشر. في حين أن التجارب على لا تزال مبررة في العديد من المواقف ، فإن إيجاد بدائل أمر مرغوب فيه للغاية. مع التطورات الحديثة في العلوم والهندسة ، أصبح تطوير بدائل للتجارب على أكثر جدوى من أي وقت مضى. يعزى التركيز المتجدد على تطوير طرق بديلة بشرية في المختبر لتقييم سلامة القلب جزئيا على الأقل إلى التقدم في تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). يمكن إنشاء خلايا القلب البشرية في المختبر باستخدام عينة دم أو جلد بسيطة من المريض ، مما ينتج عنه خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC-CMs) المستحثة من الإنسان ومناسبة للاختبار القوي عالي الإنتاجية. كما كان التقدم في الهندسة الحيوية للأنسجة ثلاثية الأبعاد ، وتقنيات مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، وتصوير الخلايا الحية ، وغيرها من التقنيات مفيدة أيضا في تطوير البروتوكولات المضمنة في هذه المجموعة.
يطبق البروتوكول الصادر عن Gerges et al.1 طريقة بصرية غير جراحية (MyoBLAZER) لتقييم التغيرات في الانقباض في خلايا عضلة القلب البطينية الأولية البشرية البالغة. الخلايا تسير بخطى كهربائية ، ويقيس تحليل الصورة تقصير الساركومير عبر خلايا متعددة بالتوازي. يمكن لهذه الطريقة جمع منحنيات استجابة التركيز كل 30 دقيقة لكل مركب لكل جهاز ، وتوفر بيانات علاقة الهيكل والنشاط. تساعد هذه الطريقة البصرية غير الغازية في الحفاظ على فسيولوجيا وعلم الأدوية لخلايا عضلة القلب البشرية البالغة أثناء الفحص عالي الإنتاجية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يوفر استخدام خلايا عضلة القلب البشرية البالغة جزءا انتقاليا مهما للتنبؤ بالانقباض.
تقدم المنهجية التي أجراها Lickiss et al.2 تقنية الانقباض والمقاومة الهجينة / إمكانات المجال خارج الخلية (EFP) ، مما يضيف ميزات مهمة مؤيدة للنضج إلى منصة 96 بئرا متوافقة مع معايير الصناعة باستخدام ركيزة زراعة خلوية ناعمة ومرنة قائمة على السيليكون. أثبت النهج نجاحه من خلال إعادة تأسيس الاستجابة الفسيولوجية الإيجابية للنظر العضلي للأيزوبروتيرينول في hiPSC-CMs الصحية المتاحة تجاريا ، والتي تغيب عن قصد في الثقافة القياسية (الركيزة الصلبة) دون الحاجة إلى نظام ثلاثي الأبعاد. يسمح النظام الهجين بالقياس المباشر لقوة الانكماش (mN / mm2) ، ومعدل النبض ، بالإضافة إلى كثافة الخلية أحادية الطبقة وسلامتها. كما أنه يعالج تحديات النظام ثلاثي الأبعاد التقليدي (أي الإنتاجية المنخفضة ، واحتياجات التدريب الكبيرة) ، مما يقلل من الوقت والتكاليف اللازمة لإكمال الفحص.
تتضمن المجموعة أيضا عملا قام به Feaster et al.3 ، الذين أظهروا طريقة غير جراحية في المختبر ، عالية الإنتاجية ، لتقييم علاج تعديل انقباض القلب (CCM) في خلايا عضلة القلب ذات الخلايا الجذعية البشرية ثنائية الأبعاد المطلية على مرتبة Matrigel المرنة ، باستخدام الفحص المجهري القائم على الفيديو الخالي من المسبار. يسلط المؤلفون الضوء على التأثيرات الحادة ل CCM على الخصائص الانقباضية ل hiPSC-CMs الصحية والمريضة. توفر هذه الأداة طريقة منخفضة التكلفة لفهم سلامة أو فعالية CCMs ، ويمكن أن تقلل من الاعتماد على الدراسات التي أجريت على وتساعد في اتخاذ القرار التنظيمي للأجهزة الطبية للفيزيولوجيا الكهربية للقلب.
يصف البروتوكول المكرر بواسطة Schaefer et al.4 امتدادا جديدا لنظام مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة القياسي (MEA) الذي يسجل عادة إمكانات المجال خارج الخلية في hiPSC-CMs ، مما يسمح بتسجيلات جهد الفعل الشبيهة بالخلايا عن طريق فتح أغشية الخلايا بنبضات شعاع ليزر نانو ثانية. لا يشتمل هذا الجهاز على مزايا MEA القياسية فقط (أي مراقبة انتشار الإشارة والتجارب الحادة والمزمنة) ، ولكنه يسمح أيضا بنظرة ثاقبة لشكل جهد الفعل الشبيه بالخلايا دون استخدام نبضات المجال الكهربائي القوية للتثقيب الكهربائي للخلية.
يصف البروتوكول الصادر عن Berry et al.5 منصة جديدة تتيح التصنيع القابل للتكرار لأنسجة العضلات الهندسية ثلاثية الأبعاد (EMTs) لقياسات قوة الانقباض المباشرة. يمكن للأداة اكتشاف تغيرات الميكرونيوتن في قوة الانقباض ، مما يجعلها أداة قوية لفحص المركب المعتمد على الجرعة. يمكن تسجيل الانقباض في أنسجة القلب القائمة على hiPSC ، وكذلك أنسجة عضلات الهيكل العظمي ، في ما يصل إلى 24 نسيجا في وقت واحد ، ويمكن تحليل البيانات طوليا على مدار أسابيع أو أشهر. لذلك ، هناك حاجة إلى الحد الأدنى من المهارات أو التدريب الإضافي للباحثين.
أخيرا ، يصف المنشور الذي أجراه Zhao et al.6 مجموعة من المقايسات الوظيفية (إمكانات المجال خارج الخلية ، وإمكانات الفعل ، والانقباض ، والكالسيوم) المحسنة للاستخدام مع خلايا عضلة القلب التي يمكن إنشاؤها في المنزل بواسطة مختبرات المستخدم. يمكن القيام بذلك باستخدام بروتوكولات التمايز المنشورة سابقا و iPSCs المتاحة من البنك الحيوي لمعهد القلب والأوعية الدموية بجامعة ستانفورد (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html), توفير مجموعة واسعة من "المرضية" وخلايا التحكم. هذه مجموعة كاملة من الطرق لتسجيلات الانقباض القلبي والفيزيولوجيا الكهربية الرئيسية ، بما في ذلك الأساليب القياسية (مشبك التصحيح ، ومصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، ومجسات التألق الحساسة للكالسيوم ، وقياسات الانقباض المستندة إلى الفيديو).
في الختام ، في حين أن مجموعة الطرق الحالية لا تدعي أنها كاملة (وتستمر في النمو) ، إلا أنها بالفعل مجموعة شاملة نسبيا من الأساليب التي توضح العديد من التحديات الحالية في الانقباض والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في خلايا عضلة القلب البشرية. يتضمن بروتوكولات لخلايا عضلة القلب البشرية الأولية1 ، و hiPSC-CMs المتوفرة تجاريا المشتقة من متبرعين أصحاء2،3،4 ، بالإضافة إلى بروتوكولات محسنة للخلايا التي تحمل توقيعا لأمراض القلب الخلقية3،6. تمتد هذه الطرق عبر ظروف زراعة الخلايا المختلفة ، من الخلايا المفردة لتجارب مشبك التصحيح6 ، إلى الطبقات الأحادية التقليدية hiPSC-CM 2D على ركائز صلبة1،4 ، طبقات أحادية من خلايا عضلة القلب ثنائية الأبعاد على ركائز ناعمة ومرنة2،3 ، وأخيرا ، أنسجة القلب المصممة ثلاثية الأبعاد5. تستخدم الطرق المضمنة طرقا مختلفة لتسجيل معلمات فسيولوجيا القلب الأكثر صلة ، مثل الانقباض (يقاس إما بشكل غير مباشر بالمقايسات المستندة إلى الفيديو1،3،6 أو مباشرة بقوة الانقباض2،5) ، جهد الفعل (في خلية واحدة باستخدام مشبك التصحيح6 ، إمكانات المجال البديل خارج الخلية مع MEA4،6، أو باستخدام نهج جديد لتدقين الخلايا لتسجيل تسجيلات شبيهة بإمكانات العمل باستخدام نظام MEA القياسي4) ، وعابرات الكالسيوم (باستخدام مجسات حساسة للكالسيوم6). مجتمعة ، لا توفر هذه الطرق بروتوكولات مفصلة يمكن إعادة إنتاجها في مختبرات أخرى فحسب ، بل توضح أيضا بعض التحديات التي تواجه طرق القلب البشري في المختبر ، مثل: عدم نضج hiPSC-CM ، خاصة عند استخدام ثقافة ثنائية الأبعاد قياسية على الركيزة الصلبة. التأثيرات غير المرغوب فيها للمجسات الحساسة للجهد الفلوري أو الكالسيوم ؛ انخفاض معدل النقل لتسجيلات العمل التقليدية المحتملة ؛ صعوبات في تفسير تسجيلات المدة المحتملة للمجال القياسي؛ ونقص المقايسات لتقييم الأجهزة الطبية (على سبيل المثال ، مقابل الأدوية). من الملهم أن نرى عدد المختبرات التي تعمل على تحسين هذه الأساليب ، مما سيؤدي حتما إلى تكييف واسع لهذه الأساليب في المستقبل.