مقالة منهجية

مراقبة كعب 1 بوساطة Pexophagy

DOI:

10.3791/65010

⸱

مايو 12, 2023

 , 
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول تعليمات لتحفيز ومراقبة الكسوفاجي بوساطة Stub1 في الخلايا الحية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن لخلايا الثدييات أن تقلب البيروكسيسومات من خلال البكسوفاجي بوساطة Stub1. من المحتمل أن يسمح المسار بالتحكم الخلوي في كمية ونوعية البيروكسيسومات. خلال هذه العملية ، ينتقل بروتين الصدمة الحرارية 70 و ubiquitin E3 ligase ، Stub1 ، إلى البيروكسيسومات ليتم قلبها لبدء pexophagy. يسمح نشاط Stub1 ligase بتراكم يوبيكويتين والوحدات الأخرى المتعلقة بالالتهام الذاتي على البيروكسيسومات المستهدفة. يمكن أن يؤدي رفع مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) داخل تجويف البيروكسيسومال إلى تنشيط pexophagy بوساطة Stub1. لذلك ، يمكن للمرء استخدام توليد ROS بمساعدة الصبغة لتشغيل هذا المسار ومراقبته. توضح هذه المقالة إجراءات استخدام فئتين من الأصباغ ، البروتينات الفلورية والفلوروفورات الاصطناعية ، لبدء pexophagy داخل مزارع خلايا الثدييات. لا يمكن استخدام هذه البروتوكولات القائمة على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة لاستهداف جميع البيروكسيسومات داخل مجموعة الخلايا على مستوى العالم فحسب ، بل يمكن أن تسمح أيضا بمعالجة البيروكسيسومات الفردية داخل الخلايا المفردة. نصف أيضا كيف يمكن متابعة pexophagy بوساطة Stub1 باستخدام مجهر الخلايا الحية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البيروكسيسومات عضيات أحادية الغشاء موجودة في معظم الخلايا الحقيقية النواة. البيروكسيسومات هي حجرة استقلابية ضرورية لتنفيذ أكسدة بيتا للأحماض الدهنية طويلة السلسلة ، وهدم البيورين ، وتخليق فوسفوليبيد الأثيروحمض الصفراء 1. يتحكم الأسيتيل CoA المشتق من البيروكسيسوم في توازن الدهون عن طريق تنظيم الإشارات المركزية في التمثيل الغذائي2. لذلك ، ليس من المستغرب أن وظائف البيروكسيسومال المعرضة للخطر متضمنة في أمراض مختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية والشيخوخة والسرطانات والسمنة والسكري3،4،5. عملية أساسية في الحفاظ على عملية peroxisomal هي pexophagy. Pexophagy هي عملية تقويضية للدوران الانتقائي للبيروكسيسومات عن طريق الالتهام الذاتي. تستخدم الخلايا pexophagy للمساعدة في التحكم في كمية ونوعية البيروكسيسومات ، وبالتالي ضمان وظيفة بيروكسيسومال المناسبة. أظهرت دراسة حديثة أن فقدان البيروكسيسوم الناجم عن الطفرات في عوامل التكوين الحيوي البيروكسيسومالي PEX1 1 و 6 ينتج عن pexophagy6 غير المنضبط. والجدير بالذكر أن 65٪ من جميع مرضى اضطراب التكوين الحيوي البيروكسيسوم (PBD) يعانون من نقص في مركب ATPase AAA البيروكسيسومالي ، المكون من PEX1 و PEX6 و PEX26 في خلايا الثدييات7.

يمكن استخدام عدد من الطرق لبدء ودراسة pexophagy. في الخميرة ، يتم تشغيل pexophagy عندما يتم تحويل العناصر الغذائية الموردة من مصادر الكربون المعتمدة على البيروكسيسوم إلى مصادر الكربون المستقلة عن البيروكسيسوم (لخفض أعداد البيروكسيسوم الخلوية)8. على سبيل المثال ، يؤدي نقل خلايا Pichia pastoris المزروعة بالميثانول من وسط الميثانول إلى وسط الجلوكوز ووسط الإيثانول إلى تحفيز micropexophagy و macropexophagy ، على التوالي8،9،10. قامت عوازل micropexophagy بتجميع البيروكسيسومات للتحلل عن طريق إعادة تشكيل الفجوة لتشكيل أغشية عزل فراغية تشبه الكوب وهيكل يشبه الغطاء يسمى جهاز الغشاء الخاص بالميكروبيكسوفاجي (MIPA). في macropexophagy ، يتم غمر البيروكسيسومات الفردية بواسطة هياكل غشاء مزدوج تعرف باسم pexophagosomes ، تليها الانصهار مع الفجوة للتحلل8،9،10. تعد فسفرة مستقبلات pexophagy ، مثل Atg36p في Saccharomyces cerevisiae و Atg30p في Pichia pastoris ، أمرا بالغ الأهمية للمستقبلات لتوظيف آلات الالتهام الذاتي الأساسية وتسهيل استهداف البيروكسيسومال للجسيمات الذاتية 8,11.

في خلايا الثدييات ، يمكن أن يحدث pexophagy عن طريق الوجود في كل مكان. وضع علامات على بروتينات الغشاء البيروكسيسومالي PMP34 أو PEX3 مع يوبيكويتين على الجانب الخلوي يحفز pexophagy12. يؤدي الإفراط في التعبير عن PEX3 إلى انتشار البيروكسيسوم في كل مكان والتخلص من البيروكسيسوم بواسطة الجسيمات الحالة13. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اندماج PEX5 مع EGFP الطرفي C يضعف تصدير PEX5 أحادي الكل وينتج عنه pexophagy14. من ناحية أخرى ، يمكن أيضا تشغيل pexophagy عن طريق علاج H 2 O2. تنتج البيروكسيسومات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ؛ على وجه التحديد ، لا ينتج إنزيم بيروكسيسومال Acox1 ، الذي يحفز الخطوة الأولى من أكسدة بيتا للأحماض الدهنية طويلة السلسلة (> 22 كربون) ، ليس فقط أسيتيل-CoA ولكن أيضا بيروكسيسومال ROS. استجابة لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية المرتفعة تحت علاج H 2O2 ، تقوم خلايا الثدييات بتنشيط pexophagy لخفض إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية وتخفيف التوتر. تم الإبلاغ عن أن علاج H 2O2 يدفع تجنيد الرنح وتوسع الشعيرات المتحور (ATM) إلى البيروكسيسومات. ثم يقوم ATM بفسفرة PEX5 لتعزيز دوران البيروكسيسومال بواسطة pexophagy15.

نظرا لأن البيروكسيسومات هي مراكز مولدة لأنواع الأكسجين التفاعلية ، فهي أيضا عرضة لتلف أنواع الأكسجين التفاعلية. تجبر إصابات البيروكسيسومال المستحثة ب ROS الخلايا على تنشيط pexophagy لبدء مسارات مراقبة جودة البيروكسيسوم (إزالة البيروكسيسوم التالف عن طريق الالتهام الذاتي). هنا ، نحدد نهجا للتسبب عند الطلب لإصابة بيروكسيسومال المستحثة ب ROS. يستفيد البروتوكول من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء داخل العضيات16،17،18،19،20 (الشكل 1). يتم إضاءة البيروكسيسومات ذات العلامات الصبغية ، مما يؤدي إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل تجويف البيروكسيسومال ، والذي يؤدي على وجه التحديد إلى إصابة البيروكسيسومالي. باستخدام هذا البروتوكول ، تبين أن البيروكسيسومات المجهدة ب ROS تتم إزالتها من خلال مسار تحلل يعتمد على يوبيكوتين. تقوم البيروكسيسومات المجهدة ب ROS بتجنيد ubiquitin E3 ligase Stub1 للسماح بابتلاعها في البلعمة الذاتية لإزالتها الفردية بواسطة pexophagy16. يمكن للمرء استخدام هذا البروتوكول لمقارنة مصير البيروكسيسومات المصابة والصحية داخل نفس الخلية عن طريق الفحص المجهري بفاصل زمني. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإتلاف جميع البيروكسيسومات (في جميع الخلايا) على طبق الاستزراع عالميا ، مما يسمح بالتحليل الكيميائي الحيوي لمسار pexophagy.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الخلايا التي تعبر عن diKillerRed أو البروتينات ذاتية الوسم (SLPs) في تجويف البيروكسيسوم

  1. بذر الخلايا المرغوبة على أطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي. بالنسبة للتجربة هنا ، قم بالبذور 2 × 105 خلايا SHSY5Y بشرية في 840 ميكرولتر من وسط الاستزراع (DMEM / F-12 مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) أو 6 × 104 خلايا NIH3T3 للفأر في 840 ميكرولتر من وسط الاستزراع (DMEM مكمل ب 10٪ مصل بقري و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) على طبق استزراع 35 مم مع ميكروويل زجاجي قطره 20 مم.
    ملاحظة: يجب تعديل عدد الخلايا المصنفة بشكل متناسب وفقا لمنطقة microwell الزجاجية عند استخدام أطباق القاع الزجاجي ذات المواصفات الأخرى.
  2. تنمو الخلايا تحت 5٪ CO2/37 °C لمدة 24 ساعة.
  3. نقل الخلايا مع البلازميدات المطلوبة باستخدام كاشف النقل.
    1. استخدم PMP34-TagBFP لتسمية البيروكسيسومات في الخلايا الحية. استخدم إما diKillerRed-VKSKL الذي يستهدف البيروكسيسوم أو SLP-VKSKL (+ روابط SLP ذات العلامات الصبغية) لتوليد ROS في تجويف البيروكسيسوم (من خلال إنتاج ROS المنشط بالضوء). في هذا البروتوكول ، نستخدم بروتين الملصقات الذاتية HaloTag-VKSKL21. لمراقبة انتقال Stub1 / Hsp70 ، وتراكم البروتينات في كل مكان ، وتشكيل البلعمة الذاتية على البيروكسيسومات المجهدة ب ROS ، فإن نقل EGFP-Stub1 أو EGFP-Hsp70 أو EGFP-Ub أو EGFP-LC3B ، على التوالي. للتحقق من توليد ROS في تجويف البيروكسيسومال ، شارك في نقل diKillerRed-VKSKL مع مسبار الأكسدة والاختزال الفلوري الموضعي البيروكسيسوم roGFP2-VKSKL22.
    2. لنقل الخلايا SHSY5Y ، قم بتخفيف البلازميدات في 55 ميكرولتر من DMEM / F-12 الخالي من المصل ، وقم بتخفيف 1 ميكرولتر من كاشف النقل في 55 ميكرولتر من DMEM / F12 الخالي من المصل. الجمع بين الحمض النووي المخفف مع الكاشف المخفف. تخلط برفق ، وتحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. أضف المركب إلى الميكروويل 20 مم المطلي مسبقا ب 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع ل SHSY5Y بدون مضادات حيوية (DMEM / F-12 مع مصل بقري جنيني 10٪). هز الطبق برفق ذهابا وإيابا.
    4. لنقل الخلايا NIH3T3 ، استبدل وسط المصل المخفض ب DMEM / F-12 الخالي من المصل لتخفيف البلازميدات وكاشف النقل. استبدل وسط زراعة الطلاء ب SHSY5Y بوسط استزراع لخلايا NIH3T3 بدون مضادات حيوية (DMEM مع مصل بقري 10٪).
  4. بعد 2 ساعة من النقل ، قم بإزالة الوسط المحتوي على كاشف النقل ، وأضف 1 مل من وسط الاستزراع الطازج. احتضان خلايا NIH3T3 أو SHSY5Y عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام خطوط الخلايا الأخرى لدراسة البكسفاجي بوساطة Stub1 (على سبيل المثال ، خلايا هيلا).

2. تلطيخ البيروكسيسومات بروابط SLP ذات العلامات الصبغية (لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء)

  1. في 24 ساعة بعد النقل ، قم بإزالة وسط الاستزراع ، وأضف 100 ميكرولتر من 200 نانومتر HaloTag TMR ligand أو 200 نانومتر Janelia Fluor 646 HaloTag ligand على البئر الزجاجي الصغير 20 مم.
    ملاحظة: يجب تخفيف روابط SLP ذات العلامات الصبغية باستخدام وسيط الاستزراع المعني لكل خط خلية. سيؤدي اختيار الروابط التي تحمل علامة Janelia Fluor 646 إلى تحرير القنوات الزرقاء والخضراء والحمراء للتصوير الفلوري في اتجاه مجرى النهر.
  2. انقل الطبقإلى حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 5٪. وصمة عار لمدة 1 ساعة. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة وسط التلوين جيدا ، وأضف 1 مل من وسط الاستزراع الطازج.

3. ضغط ROS للبيروكسيسومات على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر

  1. ضع طبقا ذو قاع زجاجي يحتوي على الخلايا المطلوبة على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مزود بحاضنة على سطح المسرح.
  2. انقر فوق نافذة الأداة ، واختر العين ، وانقر فوق الزر DIA (الشكل 2 أ) لتشغيل الضوء المرسل. اعرض الطبق من خلال عدسة المجهر ، واجعل الخلايا في بؤرة التركيز عن طريق تدوير مقبض التركيز.
  3. اختر LSM ، وانقر على زر تحديد الصبغة والكاشف (الشكل 2 ب). انقر نقرا مزدوجا فوق الأصباغ المطلوبة في النافذة المنبثقة لتحديد إعدادات الليزر والمرشح المناسبة لتصوير الخلايا (الشكل 2C). انقر فوق Livex4 في اللوحة الحية لبدء المسح السريع بالليزر لبدء فحص إشارات التألق للخلايا (الشكل 2D).
  4. حرك المرحلة باستخدام وحدة التحكم بعصا التحكم ، وحدد موقع الخلايا المتوسطة التي تعبر عن diKillerRed-VKSKL- أو SLP-VKSKL لتطبيق ضغط ROS (على البيروكسيسومات). الحصول على صورة للخلية المطلوبة.
  5. انقر فوق نافذة الأداة ، واختر تحفيز LSM (الشكل 2E). انقر فوق الزر الناقص ، وفي نافذة الصورة الحية ، استخدم الماوس لرسم عائد استثمار دائري يبلغ قطره 15 ميكرومتر (الشكل 2F) يحتوي على البيروكسيسومات المرغوبة المكتسبة في الخطوة 3.4 والتي سيتم تطبيق ضغط ROS عليها (انظر الشكل 3 للحصول على مثال).
  6. لتطبيق إجهاد ROS ، استخدم 561 نانومتر للخلايا التي تحتوي على ليجند SLP المسمى diKillerRed-PTS1 أو TMR ، واستخدم 640 نانومتر للخلايا الملطخة ب Janelia Fluor 646 المسمى SLP ligand.
  7. حدد الطول الموجي لليزر لتطبيق إجهاد ROS. أدخل نسبة الليزر المطلوبة والمدة (الشكل 2G).
  8. انقر فوق اكتساب ، وانقر فوق زر التحفيز (الشكل 2H) لبدء المسح بضوء 561/640 نانومتر من خلال عائد الاستثمار لمدة 30 ثانية لكل منهما. هذا يتوافق مع إعداد طاقة الليزر ~ 5٪ لكل من 561 نانومتر و 640 نانومتر على المجهر متحد البؤر المستخدم هنا. ستؤدي هذه العملية إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في البيروكسيسومات.
    ملاحظة: يمكن للمرء تحديد عائد الاستثمار بأحجام مختلفة. يجب على المرء ضبط وقت الإضاءة بشكل متناسب لكل عائد استثمار وفقا لمنطقته.
  9. بعد 30 ثانية من إضاءة الليزر ، ستفقد البيروكسيسومات داخل عائد الاستثمار إشارات diKillerRed-PTS1 / TMR / Janelia Fluor 646. يسمح فقدان الإشارة هذا للمرء بالتمييز بين البيروكسيسومات المضيئة وغير المضيئة (التالفة مقابل السليمة) داخل الخلية.

4. مراقبة pexophagy في الخلايا الحية عن طريق التصوير بفاصل زمني

  1. اتبع نقل Stub1 أو Hsp70 أو Ub أو p62 أو LC3B الموسوم بعلامة EGFP إلى البيروكسيسومات المضيئة / المجهدة ب ROS عن طريق التصوير بفاصل زمني باستخدام فواصل زمنية مدتها 10 دقائق بين الإطارات (على سبيل المثال ، انظر الأشكال 3-7).
    ملاحظة: تبدأ إشارات EGFP-Stub1 أو EGFP-Hsp70 في الظهور بعد 10-20 دقيقة من الإضاءة وتبقى على جميع البيروكسيسومات التالفة حتى ~ 40 دقيقة بعد الإضاءة. تظهر إشارات EGFP-Ub بعد 30 دقيقة من الإضاءة وتستمر لمدة 2-3 ساعات. يظهر إزفاء EGFP-p62 بعد 60 دقيقة من الإضاءة ، وتصبح إشارات EGFP-LC3B مرئية ~ 3 ساعات بعد الإضاءة.
  2. حدد إشارات EGFP على البيروكسيسومات التالفة (من Stub1 أو Ub أو p62 أو LC3B) باستخدام ImageJ. قم بتنفيذ الخطوات التالية لاستخدام ImageJ لتحديد كمية صورة ثلاثية القنوات (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. افتح الصورة ، وقم بتطبيق التحديدات الإهليلجية أو التحديدات اليدوية لإحاطة المنطقة التي تحتوي على جميع البيروكسيسومات المضيئة (إشارة PMP34-TagBFP موجبة وإشارة HaloTag ligand مبيضة ؛ الشكل 8 أ).
    2. انقر فوق تكرار لاختيار قناة PMP34-TagBFP (الشكل 8 أ). قم بتعيين عتبة باستخدام القائمة المنسدلة Image > ضبط عتبة > لتمييز البيروكسيسومات (الشكل 8B).
    3. حدد تحليل > تحليل الجسيمات لتحديد المناطق الدقيقة للبيروكسيسومات المضيئة. تسجل ImageJ مناطق الاهتمام هذه (ROIs) في مدير عائد الاستثمار (الشكل 8C).
    4. انقر فوق تكرار لاختيار قناة EGFP لتحليل إشارة التألق من UB أو p62 أو LC3B المترافق EGFP (الشكل 8D). حدد جميع عائد الاستثمار في مدير عائد الاستثمار (الشكل 8E).
    5. تطبيق القياس في مدير عائد الاستثمار لقياس إشارات EGFP على البيروكسيسومات (الشكل 8E). أوجد قيمة المساحة والكثافة المتكاملة (مجموع كل كثافة البكسل) لكل عائد استثمار في جدول النتائج (الشكل 8E).
    6. للحصول على متوسط شدة مضان EGFP في نقاط زمنية مختلفة بعد الإضاءة ، قسم شدة EGFP المتكاملة على المساحة الإجمالية للبيروكسيسومات المضيئة (إشارة PMP34-TagBFP الموجبة والمناطق السلبية لإشارة HaloTag). للحصول على الإشارة المتراكمة على البيروكسيسومات ، اطرح متوسط الشدة في نقطة زمنية بمتوسط الشدة في الوقت = 0 ، ثم قم بالتطبيع بمتوسط الشدة في الوقت = 0.

5. إتلاف جميع البيروكسيسومات (في كل خلية) على طبق الاستزراع عالميا

  1. نفذ الخطوة 1 (تحضير الخلايا التي تعبر عن ثنائي القاتل الأحمر المستهدف للبيروكسيسوم [diKillerRed-VKSKL] أو SLP [SLP-VKSKL]) والخطوة 2 (تلطيخ البيروكسيسومات باستخدام ليجند SLP [لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء]).
  2. بعد ساعة واحدة من تلطيخ الربيطة المسمى TMR ، قم بإزالة وسط التلوين ، وأضف 1 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 30 mM 3-AT (3-amino-1،2،4-triazole ؛ مثبط الكاتالاز).
    ملاحظة: Catalase هو كاسح ROS يتم التعبير عنه في تجويف البيروكسيسوم ، لذلك يساعد علاج 3-AT على زيادة الضرر التأكسدي الناتج عن الضوء على البيروكسيسومات.
  3. ضع طبق الاستزراع فوق مصباح LED (555-570 نانومتر). إلقاء الضوء على جميع الخلايا بكثافة طاقة 1.8 واط / سم2 لمدة 9 ساعات في حاضنة.
    ملاحظة: لتنفيذ هذه الخطوة خارج الحاضنة ، ضع طبق الاستزراع على طبق تسخين 37 درجة مئوية. أضف 20 mM HEPES إلى الوسط المحتوي على 3-AT ، وقم بتغطية طبق الاستزراع بغشاء شفاف لتقليل تبادل الغازات. HEPES هو عامل تخزين مؤقت يحافظ على درجة الحموضة الفسيولوجية في زراعة الخلايا خارج حاضنة CO2 أثناء إضاءة LED.
  4. تحقق من نجاح الضرر المستمد من LED عن طريق تصوير إشارات EGFP-Ub أو EGFP-p62 أو EGFP-LC3B على البيروكسيسومات. باستخدام حالة الإضاءة الموضحة أعلاه ، عرضت 82٪ من خلايا SHSY5Y التي تعبر بثبات عن HaloTag-VKSKL pexophagy بوساطة Stub1.
  5. حصاد الخلايا للتحليل الكيميائي الحيوي المصب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستفيد مخطط تحريض pexophagy بوساطة Stub1 الموضح هنا من توليد ROS بمساعدة الصبغة داخل تجويف البيروكسيسوم. تتطلب هذه العملية الحد الأدنى من شدة الضوء. وبالتالي ، يمكن إضاءة البيروكسيسومات التي تحتوي على بروتينات أو أصباغ فلورية باستخدام المجاهر البؤرية القياسية للمسح بالليزر. تؤدي الإضاءة البؤرية إلى إنتاج ROS فوري وموضعي داخل البيروكسيسومات الفردية ، كما هو موضح من قبل المراسل الفلوري roGFP2-VKSKL (الشكل 9). لم نقم بتصوير diKillerRed-VKSKL في قياسات roGFP2-VKSKL لتجنب توليد ROS إضافي أثناء ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول كيفية تشغيل pexophagy بوساطة Stub1 داخل مزارع الخلايا عن طريق رفع مستويات ROS البيروكسيسومال بالضوء. نظرا لأن البروتوكول يعتمد على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة ، يحتاج المرء إلى ضمان التعبير الكافي عن diKillerRed-VKSKL أو تلطيخ ليجند SLP المسمى بالصبغة داخل الخلايا محل الاهتمام. بالنظر إلى أن أنواع الخلايا المختلفة أو الخلايا ذات الخلفيات الجينية المختلفة يمكن أن تؤوي البيروكسيسومات ذات الخصائص المختلفة قليلا ، فقد يحتاج المرء إلى ضبط ظروف الإضاءة الدقيقة لضمان تحريض pexophagy. يتمثل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة بحثية MOST 111-2311-B-001-019-MY3 من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق ثقافة 35 مم مع ميكروويل زجاجي بقطر 20 مم ؛MatTekP35G-1.5-20-C20 مم زجاج ذو قاع
3-أمينو-1،2،4-تريازول (3-AT)سيجما ألدريتشA8056
مصل بقريThermoFisher Scientific16170060
حاضنة زراعة الخلاياNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicaالمصنوع عن طريق إلحاق ثنائي الترادف KillerRed مع PTS1 (VKSKL)
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium / خليط المغذيات F-12 (DMEM / F-12) ThermoFisherScientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1تم استخدام العمود الفقري ل EGFP-C1 لاستنساخ EGFP-Stub1 و EGFP-Hsp70 و EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia Sinicaتم تضخيم جين Hsp70 (HSPA1A) PCR من HeLa cDNA واستنساخه في EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicaتم إنشاؤه عن طريق إدخال جين SQSTM1 البشري (من خلال تضخيم PCR لخلايا HeLa cDNA) في EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicaتم إنشاؤه عن طريق إدخال جين Stub1 للفأر (من خلال تضخيم PCR لإجمالي cDNA لكلية الفأر) في EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
مصل الأبقار الجنينيThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligand PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 ملحقة واستنساخ في العمود الفقري EGFP-C1
HEPESThermoFisher Scientific15630080
مجهر متحد البؤر المقلوب  أوليمبوسFV3000RS405 نانومتر Ex ، 488 نانومتر Ex ، 561 نانومتر Ex ،   مجهر مع حاضنة غرفة TOKAI HIT ومرفق الطبق UNIV2-D35
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W ، 555-570 نانومتر
ليبوفيكتامين 2000   ؛كاشف التعداءThermoFisher Scientific11668
خلية NIH3T3 خليةATCCCRL-1658الملتصقة
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850وسائط مصل مخفضة
البنسلين / الستربتومايسينThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR تضخيم من HeLa cDNA واستنساخها intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicaتم إنشاؤه عن طريق إلحاق eroGFP (مأخوذ من Addgene plasmid 20131) بتسلسل الأحماض الأمينية VKSKL ، واستنساخه في خلية EGFP-C1
SHSY5YATCCCRL-2266

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).
  2. He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
  3. Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
  4. Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
  5. Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
  6. Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
  7. Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
  8. Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
  9. Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
  10. Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721(2012).
  11. Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578(2020).
  12. Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
  13. Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
  14. Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
  15. Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
  16. Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267(2020).
  17. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111(2013).
  18. Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345(2021).
  19. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  20. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428(2013).
  21. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  22. Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
  23. Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Stub1 Mediated PexophagyPeroxisome TurnoverReactive Oxygen SpeciesDye Assisted ROS GenerationUbiquitin E3 LigaseLive Cell MicroscopyFluorescent ProteinsSynthetic FluorophoresAutophagy AdaptersConfocal Microscopy

مقالات ذات صلة