Method Article

مراقبة كعب 1 بوساطة Pexophagy

DOI:

10.3791/65010

⸱

May 12th, 2023

 , 
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول تعليمات لتحفيز ومراقبة الكسوفاجي بوساطة Stub1 في الخلايا الحية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن لخلايا الثدييات أن تقلب البيروكسيسومات من خلال البكسوفاجي بوساطة Stub1. من المحتمل أن يسمح المسار بالتحكم الخلوي في كمية ونوعية البيروكسيسومات. خلال هذه العملية ، ينتقل بروتين الصدمة الحرارية 70 و ubiquitin E3 ligase ، Stub1 ، إلى البيروكسيسومات ليتم قلبها لبدء pexophagy. يسمح نشاط Stub1 ligase بتراكم يوبيكويتين والوحدات الأخرى المتعلقة بالالتهام الذاتي على البيروكسيسومات المستهدفة. يمكن أن يؤدي رفع مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) داخل تجويف البيروكسيسومال إلى تنشيط pexophagy بوساطة Stub1. لذلك ، يمكن للمرء استخدام توليد ROS بمساعدة الصبغة لتشغيل هذا المسار ومراقبته. توضح هذه المقالة إجراءات استخدام فئتين من الأصباغ ، البروتينات الفلورية والفلوروفورات الاصطناعية ، لبدء pexophagy داخل مزارع خلايا الثدييات. لا يمكن استخدام هذه البروتوكولات القائمة على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة لاستهداف جميع البيروكسيسومات داخل مجموعة الخلايا على مستوى العالم فحسب ، بل يمكن أن تسمح أيضا بمعالجة البيروكسيسومات الفردية داخل الخلايا المفردة. نصف أيضا كيف يمكن متابعة pexophagy بوساطة Stub1 باستخدام مجهر الخلايا الحية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البيروكسيسومات عضيات أحادية الغشاء موجودة في معظم الخلايا الحقيقية النواة. البيروكسيسومات هي حجرة استقلابية ضرورية لتنفيذ أكسدة بيتا للأحماض الدهنية طويلة السلسلة ، وهدم البيورين ، وتخليق فوسفوليبيد الأثيروحمض الصفراء 1. يتحكم الأسيتيل CoA المشتق من البيروكسيسوم في توازن الدهون عن طريق تنظيم الإشارات المركزية في التمثيل الغذائي2. لذلك ، ليس من المستغرب أن وظائف البيروكسيسومال المعرضة للخطر متضمنة في أمراض مختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية والشيخوخة والسرطانات والسمنة والسكري3،4،5. عملية أساسية....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الخلايا التي تعبر عن diKillerRed أو البروتينات ذاتية الوسم (SLPs) في تجويف البيروكسيسوم

  1. بذر الخلايا المرغوبة على أطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي. بالنسبة للتجربة هنا ، قم بالبذور 2 × 105 خلايا SHSY5Y بشرية في 840 ميكرولتر من وسط الاستزراع (DMEM / F-12 مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) أو 6 × 104 خلايا NIH3T3 للفأر في 840 ميكرولتر من وسط الاستزراع (DMEM مكمل ب 10٪ مصل بقري و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) على طبق استزراع 35 مم مع ميكروويل زجاجي قطره 20 مم.
    ملاحظة: يجب تعديل عدد الخلايا المصنفة بشكل متناسب وفقا لمنطقة microwell الزجاجية عند استخدام أطباق القاع الزجاجي ذات المواصفات ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستفيد مخطط تحريض pexophagy بوساطة Stub1 الموضح هنا من توليد ROS بمساعدة الصبغة داخل تجويف البيروكسيسوم. تتطلب هذه العملية الحد الأدنى من شدة الضوء. وبالتالي ، يمكن إضاءة البيروكسيسومات التي تحتوي على بروتينات أو أصباغ فلورية باستخدام المجاهر البؤرية القياسية للمسح بالليزر. تؤدي الإضاءة البؤرية إلى إنتاج ROS فوري وموضعي داخل البيروكسيسومات الفردية ، كما هو موضح من قبل المراسل الفلوري roGFP2-VKSKL (الشكل 9). لم نقم بتصوير diKillerRed-VKSKL في قياسات roGFP2-VKSKL لتجنب توليد ROS إضافي أثناء ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول كيفية تشغيل pexophagy بوساطة Stub1 داخل مزارع الخلايا عن طريق رفع مستويات ROS البيروكسيسومال بالضوء. نظرا لأن البروتوكول يعتمد على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة ، يحتاج المرء إلى ضمان التعبير الكافي عن diKillerRed-VKSKL أو تلطيخ ليجند SLP المسمى بالصبغة داخل الخلايا محل الاهتمام. بالنظر إلى أن أنواع الخلايا المختلفة أو الخلايا ذات الخلفيات الجينية المختلفة يمكن أن تؤوي البيروكسيسومات ذات الخصائص المختلفة قليلا ، فقد يحتاج المرء إلى ضبط ظروف الإضاءة الدقيقة لضمان تحريض pexophagy. يتمثل .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة بحثية MOST 111-2311-B-001-019-MY3 من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
طبق ثقافة 35 مم مع ميكروويل زجاجي بقطر 20 مم ؛MatTekP35G-1.5-20-C20 مم زجاج ذو قاع
3-أمينو-1،2،4-تريازول (3-AT)سيجما ألدريتشA8056
مصل بقريThermoFisher Scientific16170060
حاضنة زراعة الخلاياNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicaالمصنوع عن طريق إلحاق ثنائي الترادف KillerRed مع PTS1 (VKSKL)
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium / خليط المغذيات F-12 (DMEM / F-12) ThermoFisherScientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1تم استخدام العمود الفقري ل EGFP-C1 لاستنساخ EGFP-Stub1 و EGFP-Hsp70 و EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia Sinicaتم تضخيم جين Hsp70 (HSPA1A) PCR من HeLa cDNA واستنساخه في EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicaتم إنشاؤه عن طريق إدخال جين SQSTM1 البشري (من خلال تضخيم PCR لخلايا HeLa cDNA) في EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicaتم إنشاؤه عن طريق إدخال جين Stub1 للفأر (من خلال تضخيم PCR لإجمالي cDNA لكلية الفأر) في EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
مصل الأبقار الجنينيThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligand PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 ملحقة واستنساخ في العمود الفقري EGFP-C1
HEPESThermoFisher Scientific15630080
مجهر متحد البؤر المقلوب  أوليمبوسFV3000RS405 نانومتر Ex ، 488 نانومتر Ex ، 561 نانومتر Ex ،   مجهر مع حاضنة غرفة TOKAI HIT ومرفق الطبق UNIV2-D35
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W ، 555-570 نانومتر
ليبوفيكتامين 2000   ؛كاشف التعداءThermoFisher Scientific11668
خلية NIH3T3 خليةATCCCRL-1658الملتصقة
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850وسائط مصل مخفضة
البنسلين / الستربتومايسينThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR تضخيم من HeLa cDNA واستنساخها intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicaتم إنشاؤه عن طريق إلحاق eroGFP (مأخوذ من Addgene plasmid 20131) بتسلسل الأحماض الأمينية VKSKL ، واستنساخه في خلية EGFP-C1
SHSY5YATCCCRL-2266

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).
  2. He, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stub1 Mediated PexophagyPeroxisome TurnoverReactive Oxygen SpeciesDye Assisted ROS GenerationUbiquitin E3 LigaseLive Cell MicroscopyFluorescent ProteinsSynthetic FluorophoresAutophagy AdaptersConfocal Microscopy

Related Articles