مقالة منهجية

أنظمة التعبير الخالي من الخلايا: طرق الإنتاج والاستخدام

393 مشاهدات

⸱

يوليو 28, 2023

 ,  , 
1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

في هذه المقالة

الملخص

المقالات التي تمت مناقشتها: < p class = "jove_content" >Grasemann ، L. ، Lavickova ، B. ، Elizondo-Cantú ، M. C. ، Maerkl ، S. J. OnePot نظام خال من الخلايا النقية. مجلة التجارب المتصورة. (172) ، دوي: 10.3791 / 62625 (2021). < p class = "jove_content" > سميث ، بي إي جيه ، سلوكا ، ت. ، داباس ، إم ، أوزا ، جي بي. من الخلايا إلى تخليق البروتين الخالي من الخلايا في غضون 24 ساعة باستخدام سير عمل الحث الذاتي الخالي من الخلايا. مجلة التجارب المتصورة. (173) ، دوي: 10.3791 / 62866 (2021). < p class = "jove_content" > Cooper ، R. M. ، Tonooka ، T. ، Didovyk ، A. ، Hasty ، J. سريع ، وبأسعار معقولة ، وغير معقد إنتاج محللة خالية من الخلايا البكتيرية. مجلة التجارب المتصورة. (176) ، دوي: 10.3791 / 62753 (2021).

Dopp، J.L.، Reuel، N.F. طرق إنزيمية سريعة لتضخيم الحد الأدنى من القوالب الخطية للنماذج الأولية للبروتين باستخدام أنظمة خالية من الخلايا. مجلة التجارب المتصورة. (172) ، دوي: 10.3791 / 62728 (2021). < p class = "jove_content" >McManus، J. B. et al. التوصيف السريع للأجزاء الجينية بأنظمة خالية من الخلايا. مجلة التجارب المتصورة. (174) ، دوي: 10.3791 / 62816 (2021). < p class = "jove_content" >Toh ، M. ، Chengan ، K. ، Hanson ، T. ، Freemont ، P. S. ، Moore ، S. J. مجموعة أدوات النسخ والترجمة المعقدة عالية الإنتاجية للبيولوجيا التركيبية وتطبيقات المنتجات الطبيعية. مجلة التجارب المتصورة. (175) ، دوي: 10.3791 / 63012 (2021).

Dinglasan ، J.L.N. ، Reeves ، DT ، Hettich ، RL ، Doktycz ، M.J. الكروماتوغرافيا السائلة مقترنة بمعامل الانكسار أو الكشف الطيفي الكتلي لتنميط الأيض في الأنظمة الخالية من الخلايا القائمة على المحلل. مجلة التجارب المتصورة. (175) ، دوي: 10.3791 / 62852 (2021).

Drachuk ، I. ، Harbaugh ، S. ، Kelley-Loughnane ، N. ، Chávez ، J. L. تحضير كبسولات دقيقة متعددة الوظائف قائمة على الحرير محملة ببلازميدات الحمض النووي التي تشفر أبتامير الحمض النووي الريبي ومفاتيح الريبو. مجلة التجارب المتصورة. (176) ، دوي: 10.3791 / 62854 (2021).

Jaenes، K. et al. تصميم لدراسة التنفيذ للتطوير والتحقق من صحة المريض لتشخيصات مفتاح إصبع القدم الورقية. مجلة التجارب المتصورة. (184) ، دوي: 10.3791 / 63223 (2022).

افتتاحية

أنظمة التعبير الحر من الخلايا (CFE) هي مجموعة من الأدوات التي تعيد تكوين العمليات الخلوية الرئيسية للنسخ والترجمة والتمثيل الغذائي خارج حدود الخلية1. نمت شعبية هذه الأساليب بسرعة من خلال تقديم تجارب مبسطة عن طريق إزالة أغشية الخلايا وتقليل التعقيد عن طريق إزالة الحمض النووي الجيني والتعقيد المقابل للتفاعلات بين التركيب الجيني والمضيف. تستخدم أنظمة CFE الآن للبحث الأساسي والاستشعار والتصنيع الحيوي والتعليم. تقدم مجموعة الأساليب هذه تسعة أمثلة على طرق جديدة لإنتاج واستخدام أنظمة خالية من الخلايا.

تركز ثلاث طرق على جعل إنتاج الأنظمة الخالية من الخلايا أكثر سهولة. Grasemann et al. يصف طريقة أسهل لصنع نظام PURE ، وهو نظام CFE يعيد تكوين جميع المكونات المطلوبة للنسخ والترجمة ، بدلا من استخدام المحللات الخلوية2. بدلا من التعبير عن كل مكون من مكونات البروتين البالغ عددها 36 ومكونات وتنقيتها ، يقوم المؤلفون بتجميع سلالات التعبير ، ويقدمون إنتاج نظام PURE وظيفي في غضون أسبوع. يقدم سميث وآخرون عملية مبسطة لإنتاج أنظمة CFE القائمة على التحلل باستخدام نهج الزراعة المبسط الذي يقلل من إجمالي سير العمل إلى 24 ساعة ، ويمكن إنجازه خلال ساعات العمل العادية3. Cooper et al. يصف طريقة باستخدام بكتريا قولونية معدلة سلالة تتيح تحلل الخلايا عن طريق التجميد والذوبان ، مما يلغي الحاجة إلى المعدات المتخصصة التي تتطلبها الطرق الأخرى4. تساهم كل هذه الأساليب في اتجاه الجهود المبذولة لجعل إنتاج أنظمة خالية من الخلايا قابلا للتحقيق من خلال مختبرات ذات بنية تحتية أقل وخبرة في البروتوكولات التقليدية المعقدة. مع توفر مجموعات تجارية منافسة ، يمكن لعدد متزايد من المختبرات استكشاف مزايا أنظمة CFE مع القليل من المخاطر. باستخدام طرق مثل تلك المعروضة هنا ، يمكن لهذه المختبرات بعد ذلك اختيار صنع أنظمة CFE الخاصة بها المصممة خصيصا لاحتياجاتها دون استثمار ضخم في المعدات أو الوقت.

تركز طريقتان على مزايا التجربة السريعة وعالية الإنتاجية الممكنة مع أنظمة CFE. Dopp et al. يقدم طريقة لتضخيم قوالب الحمض النووي الخطية للفحص السريع للتركيبات الجينية5. باستخدام نهجهم ، يمكن طلب التصاميم الجينية من شركات تخليق الحمض النووي ثم تضخيمها وفحصها في غضون 24 ساعة. McManus et al. يصف نهجا مشابها حيث يتم تضخيم جين المراسل باستخدام مواد أولية مختلفة ترميز للمكونات التنظيمية المختلفة6. تتيح التكلفة المنخفضة ل oligos المقترنة بأنظمة CFE فحصا سريعا وفعالا من حيث التكلفة للمكونات مثل المروجين. تسلط كلتا الطريقتين الضوء على إمكانات أنظمة CFE للتجريب السريع ، مما يقلل من الجداول الزمنية لتصميم واختبار البناء من أسابيع باستخدام الاستنساخ التقليدي إلى أيام أو حتى ساعات.

توفر الطرق الثلاث التالية أدوات للاستخدامات المتخصصة لأنظمة CFE. Toh et al. يقدم طريقة لإنشاء أنظمة CFE من Streptomyces venezuelae7. تعتمد غالبية بروتوكولات CFE على الإشريكية القولونية ، بما في ذلك جميع الطرق الأخرى في هذه المجموعة. هذه الطريقة الجديدة ل S. venezuelae تجلب مزايا أنظمة CFE إلى كائن حي ذو أهمية واسعة لإنتاج المنتجات الطبيعية. Dinglasan et al. يوفر طريقة لقياس تركيزات المستقلب في التفاعلات الخالية من الخلايا8. تعتبر هذه القياسات حاسمة للتطبيقات في هندسة التمثيل الغذائي الخالية من الخلايا ، حيث يتم استخدام التمثيل الغذائي السليم لأنظمة CFE لإنتاج منتجات غير بروتينية ذات أهمية. ثالثا ، Drachuk et al. يقدم التغليف الدقيق للحمض النووي لإضافته إلى تفاعلات CFE9. يمثل هذا النهج مجموعة من التقنيات التي تمكن من إعادة إدخال مزايا التجزئة بشكل عقلاني في أنظمة CFE بعد إزالة الأغشية الطبيعية أثناء تصنيع أنظمة CFE. كل طريقة من هذه الطرق تنوع مجموعة التطبيقات التي يمكن تطبيق أنظمة CFE عليها.

أخيرا ، يصف Jaenes et al. طرق إنتاج تشخيص حقيقي لفيروس زيكا بناء على أنظمة CFE10. الاختبارات والأجهزة منخفضة التكلفة مقارنة بالتقنيات المنافسة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وقد اختبر المؤلفون تشخيصاتهم بنجاح باستخدام عينات المرضى في بلدان متعددة. يعد هذا العمل مثالا قويا على تطبيقات الاستشعار في نقاط الحاجة ، والتي ربما تكون المنطقة التي تستعد فيها أنظمة CFE لإحداث التأثير الأكثر إلحاحا في العالم الحقيقي.

كمجموعة ، تلتقط هذه الأساليب مجموعة تمثيلية من المجالات الرئيسية للبحث النشط في أنظمة CFE في السنوات الأخيرة. يتم تمثيل الأساليب التي تعمل على تحسين إنتاج أنظمة CFE وتمكين التجارب عالية الإنتاجية بشكل جيد ، وتوجد أمثلة على العديد من الاستخدامات الأكثر تحديدا لأنظمة CFE. تشمل مجالات الاهتمام الأخرى إنتاج البروتينات المعقدة للتطبيقات الطبية ، ودمج الأحماض الأمينية غير الكنسية ، والتحسين للتخزين طويل الأجل ، وتطوير الخلايا الاصطناعية. نتوقع أن يستمر اعتماد أنظمة CFE في التسارع نظرا لانخفاض حاجز الدخول ، وإمكانية التجريب السريع ، ومجموعة واسعة من القدرات ، وكلها ممكنة من خلال طرق مثل تلك المعروضة في هذه المجموعة. تعتمد التحديات المتبقية على مساحة التطبيق. بالنسبة للتصنيع الحيوي ، سيكون خفض التكاليف على نطاق واسع من خلال الانتقال إلى ركائز أرخص وإعادة التدوير المحسنة أمرا بالغ الأهمية. للاستشعار ، هناك حاجة إلى عمل كبير بناء على مثال Jaenes et al. لإظهار أداء قوي في مختلف تطبيقات نقاط الحاجة. على نطاق واسع ، يحتاج المجال إلى الاستمرار في تحسين التقنيات الأساسية مع توسيع ذخيرة ما يمكن القيام به باستخدام أنظمة CFE.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون ببرنامج البحوث التطبيقية لمكتب وزير الدفاع للنهوض بأولويات العلوم والتكنولوجيا لدعم التعاون الذي أدى إلى هذه المجموعة.

المراجع

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Protein SynthesisCell free AutoinductionBacterial Cell free LysateGenetic Parts CharacterizationSynthetic BiologyTranscription translation ToolkitMetabolite ProfilingSilk based MicrocapsulesRNA AptamersRiboswitchesDiagnostics

مقالات ذات صلة