$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
حتى قبل منح جائزة نوبل لعام 2017 عن المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) للجزيئات البيولوجية ، كان المجال يولد الإثارة. كانت ثورة الدقة جارية على قدم وساق ، وكان علم الأحياء الهيكلي يتطلع إلى cryoEM كطريقة توصيف تقترب من المعيار الذهبي لعلم البلورات بالأشعة السينية1. في وقت مبكر ، شمل مجال cryoEM بشكل أساسي البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة المجاهر الإلكترونية لنقل التبريد (cryoTEMs). الآن ، مع تقدم المجاهر وأدوات تحضير العينات وطرق تحضير العينات ، أصبحت أنواع البيانات التي تم إنشاؤها أكثر تنوعا. لم يعد CryoEM مخصصا لتوصيف البروتين بواسطة cryoTEM. نما المجال ويضم الآن البيانات التي تم إنشاؤها من المجاهر الإلكترونية للمسح بالتبريد والحزمة الأيونية المركزة (cryoSEM / FIB). يتم الشعور بالتأثير على نطاق أوسع عبر تخصصات متعددة ، بما في ذلك أبحاث التصوير على الجزيئات والخلايا والأنسجة والمواد الاصطناعية مثل الهلاميات المائية.
كان التقدم في قدرات التصوير قوة دافعة في تطوير cryoEM. مهدت التحسينات في الكاميرات وأجهزة الكشف ومعالجة الصور الطريق للتصوير بمدخلات طاقة أقل ، مما يسمح للعينات البيولوجية الحساسة بالبقاء على قيد الحياة في عملية التصوير. في TEMs ، ترجم التعرض للشعاع بجرعة منخفضة إلى تطبيق التصوير المقطعي حيث يتم تصوير عينة واحدة بشكل متكرر بزوايا متعددة لتوليد إعادة بناء ثلاثية الأبعاد2،3. كما أدى التقدم في SEM / FIBs إلى تحسين الدقة مع استخدام طاقة أقل. الأهم من ذلك ، أن هذا أدى إلى تحسين التصوير للعينات غير الموصلة ، مما يترجم إلى تصوير أفضل في SEM / FIBs4،5. طورت هذه التحسينات جميع التصوير المجهري الإلكتروني البيولوجي ، لكنها حسنت بشكل خاص التصوير بالتبريد ، حيث تكون العينات حساسة ولا تحتوي على معادن ثقيلة إضافية مضافة لتحسين التباين.
مع تقدم قدرات التصوير ، تقدمت أيضا أدوات تحضير العينات. في تحضير عينة cryoEM ، تتمثل الخطوة الأولى في التزجيج الناجح للعينات. يتم تجميد العينات المائية لتشكيل جليد غير متبلور ، وبالتالي تجنب الضرر الناجم عن تكوين بلورات الجليد. تتمثل الاستراتيجيات الرائدة في التجميد الغاطس في الإيثان السائل للجزيئات والخلايا الصغيرة أو التجميد عالي الضغط (HPF) للعينات الأكبر التي يصل سمكها إلى بضع مئات من الميكرون. تسمح التطورات في تقنية التجميد الغاطس بالتقاط أفضل للجزيئات في جميع الاتجاهات عن طريق تقليل التجميع الذاتي على طول واجهة الهواء / الماء6. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح التطورات في تقنية HPF بالتحفيز الضوئي والكهربائي للعينات قبل لحظات من التجميد7. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير تقنية HPF جديدة يمكن أن تتفاعل مع مجهر مضان ، مما يسمح بتأخير زمني قصير (<2 ثانية) بين التصوير الفلوري للخلايا الحية وتجميد HPF8.
لقد نشطت التطورات المذكورة أعلاه مجال cryoEM وألهمت تطوير طرق جديدة. كان هناك أيضا تنشيط للتقنيات المعمول بها. نقدم هنا مجموعة من الأساليب التي تركز على تطوير cryoEM بهدف نشر هذه الاستراتيجيات في مجال البحث سريع التوسع.
في حين أن التحسينات في قدرات التصوير وأدوات تحضير العينات كانت قوة دافعة رئيسية وراء التطورات في مجال cryoEM ، إلا أن العقبة الرئيسية في هذا البحث لا تزال تتمثل في التحضير العملي للعينات. يقدم Truong et al.9 طريقة تستفيد من تكوين أحادية الطبقة الدهنية في واجهة الهواء / الماء. تتشكل طبقة دهنية على شبكة TEM وتعمل كسقالة لبروتينات الغشاء ذات الأهمية. بالنسبة لعينات الأغشية متعددة الصفائح أو المكدسة ، يقدم Johnson et al.10 استراتيجية "لتقشير" الطبقات الزائدة ، وترك طبقة واحدة على الشبكة مناسبة لتصوير TEM. في مقال آخر ، يدرك Chang et al.11 أن بعض البروتينات تعتمد على درجة الحرارة وأن البنية ذات الصلة يتم ملاحظتها في درجات حرارة مرتفعة. يصفون طريقة تجميد الغاطس المعدلة التي تسمح بتطبيق العينات على الشبكة في درجات حرارة مرتفعة مع الاستمرار في تحقيق الجليد الزجاجي بعد التجميد الغاطس. لمزيد من التحكم في عملية تحضير شبكة التبريد ، يقدم Kang et al.12 طريقة عالية الإنتاجية لإنتاج رقائق منقوشة دقيقة لشبكات TEM حيث يكون للمسام عمق يمكن التحكم فيه. قد توفر هذه الطريقة متغيرا آخر للتحكم في سمك الجليد غير المتبلور أثناء تحضير الشبكة.
الارتباط بين طرائق التصوير المتعددة مؤثر. يصف Bieber et al.13 سير عمل بالتبريد حيث يتم تصوير شبكة مجمدة في مجهر مضان بالتبريد لتحديد منطقة الفلورسنت ذات الأهمية. ثم يتم نقل الشبكة إلى cryoSEM / FIB ، حيث يتم استخدام الائتمانات لمحاذاة صورة التألق مع صورة SEM ، مما يسمح باستهداف منطقة الفلورسنت لطحن FIB. يتم تخفيف المنطقة المستهدفة إلى بضع مئات من النانومترات ، ثم يتم نقل الشبكة إلى التبريد TEM للتصوير المقطعي في الموقع المستهدف الرقيق. يوضح DiCecco et al.14 وجود علاقة بين TEM السائل و cryoTEM ، وبالتالي يقترب من هدف اقتران بيانات cryoTEM عالية الدقة ببيانات TEM للجزيئات في الحركة الديناميكية.
يعد الاستحواذ الآلي على مجموعات البيانات الكبيرة أيضا مجالا للاهتمام. يجب زيادة الوقت الثمين للأداة إلى أقصى حد ، والأتمتة هي خطوة أساسية. يصف Kumar et al.15 إعداد النقر بنقرة لبرنامج الحصول الآلي على البيانات للتصوير بالتبريد.
مع استمرار تطور مجال cryoEM ، سيظهر المزيد من التطورات في إعداد العينات ، وسيتم الشعور بتأثير cryoEM على نطاق واسع عبر المزيد من التخصصات. لن تتضمن بعض التطورات تقنيات جديدة ولكن تعزيز التقنيات القائمة. ستكون التقنيات أسرع وأسهل وأكثر قوة ، مع إنتاجية أعلى. نظرا لأن الأتمتة تزيد من إخراج البيانات ، ستكون مجالات التطوير الرئيسية في تحليل الصور ومعالجة البيانات. علاوة على ذلك ، سيلعب الذكاء الاصطناعي دورا مهما. يجب أن نتوقع أن نرى انخفاضا في تكاليف الأجهزة والبصمة ، مما سيسمح لهذه التكنولوجيا بأن تصبح متاحة على نطاق أوسع ، على الرغم من أن هذه التطورات قد تكون أبطأ في التحقق.