مقالة منهجية

تنقية مركب الحصاد الضوئي النشط I-Light I من الأنسجة النباتية

DOI:

10.3791/65037

⸱

فبراير 3, 2023

 , 
1School of Molecular Sciences, Arizona State University, 2Biodesign Center for Applied Structural Discovery, Arizona State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول عزل النظام الضوئي الأول (PSI) - مركب حصاد الضوء الأول (LHCI) عن الأنسجة النباتية. PSI جنبا إلى جنب مع PSII مسؤول عن تحويل الضوء إلى طاقة كيميائية في الأكسجين الضوئي وله كفاءة كمية ~ 1 ، مما يجعله هدفا لدراسة نقل الطاقة المدفوعة بالضوء.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم هذه الطريقة لعزل النظام الضوئي الأول (PSI) مع مجمع حصاد الضوء I (LHCI) ، هوائي أصله ، من النباتات. PSI-LHCI عبارة عن مركب بروتين غشائي كبير ينسق مئات عوامل حصاد الضوء ونقل الإلكترون وهو أكثر أنظمة حصاد الضوء كفاءة الموجودة في الطبيعة. يتم نقل الفوتونات التي تمتصها بروتينات هوائي LHCA الأربعة التي تشكل LHCI من خلال التفاعل المثير إلى مركز التفاعل الأساسي PSI وتستخدم لتسهيل فصل الشحنات التي تحركها الضوء عبر غشاء الثايلاكويد ، مما يوفر طاقة وطاقة مخفضة لتثبيت الكربون في الكائنات الحية ذاتية التغذية الضوئية. تجعل الكفاءة الكمومية العالية ل PSI هذا المجمع نموذجا ممتازا لدراسة نقل الطاقة المدفوعة بالضوء. في هذا البروتوكول ، يتم تجانس الأنسجة النباتية ميكانيكيا ، ويتم فصل البلاستيدات الخضراء عن الحطام الخلوي السائب عن طريق الترشيح والطرد المركزي. ثم يتم تحلل البلاستيدات الخضراء المعزولة بشكل تناضحي ، ويتم استعادة أغشية الثايلاكويد عن طريق الطرد المركزي وقابلة للذوبان باستخدام المنظف n-dodecyl-beta-maltoside. يتم تحميل المادة القابلة للذوبان على عمود تبادل الأنيون لجمع معظم المجمعات المحتوية على الكلوروفيل. يتم ترسيب المجمعات الأكبر من المحلول ، وإعادة تعليقها في حجم صغير ، وتحميلها على تدرجات السكروز لفصل المجمعات الرئيسية المحتوية على الكلوروفيل. تتميز كسور تدرج السكروز الناتجة لتحديد النطاق ذي الأهمية الذي يحتوي على PSI-LHCI. يشبه هذا البروتوكول إلى حد كبير البروتوكول المستخدم في بلورة PSI-LHCI النباتي مع بعض التبسيطات ويعتمد على الأساليب التي تم تطويرها على مر السنين في مختبر ناثان نيلسون.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التمثيل الضوئي الأكسجيني أحد أهم التفاعلات الكيميائية على كوكبنا. يحدث تحويل الضوء إلى طاقة كيميائية في مراكز التفاعل لنظامين ضوئيين ، النظام الضوئي الأول (PSI) والنظام الضوئي الثاني (PSII) 1 (الشكل 1 أ). PSI هو مركب كبير متعدد الوحدات الفرعية والبروتين الصبغي الذي تطور منذ أكثر من 3.5 مليار سنة2،3. يسهل هذا المركب ، الذي يحتوي على ما يقرب من 100 جزيء من الكلوروفيل وحوالي 20 كاروتينات ، نقل الإلكترونات عبر غشاء الثايلاكويد من البلاستيوسيانين إلى الفيريدوكسين الذي يعمل كمتقبل للإلكترون النهائي لسلسلة نقل الإلكترون الضوئية1،4،5 (الشكل 1 ب ، ج). في النباتات ، يكون فصل الشحنة المدفوع بالضوء نتيجة للطاقة الضوئية المنقولة من كل من أصباغ الهوائي الأساسية PSI وأصباغ الهوائي المحيطية لمركب حصاد الضوء I (LHCI) إلى مركز تفاعل PSI (الشكل 1 د). LHCI هو مركب هوائي خاص ب PSI داخل غشاء الثايلاكويد يتكون من أربعة بروتينات هوائي LHCA المرتبطةبالكلوروفيل a / b 6،7.

figure-introduction-1
الشكل 1: سلسلة نقل الإلكترون الضوئي والهيكل العام لمركب PSI-LHCI. (أ) تحتوي سلسلة نقل الإلكترون الضوئي على أربعة مجمعات تمثيل ضوئي رئيسية مرتبطة بالغشاء وثلاثة ناقلات إلكترونية قابلة للذوبان. يتم استخدام تدفق الإلكترون (الأسهم الحمراء) عبر سلسلة النقل وضخ البروتون (الأسهم السوداء) في التجويف لإنشاء طاقة مختزلة (NADPH) وإنتاج ATP لتثبيت الكربون37،38،39،40. تم إنشاؤه باستخدام Biorender.com. (ب) هيكل النبات PSI-LHCI من الجانب التجويف. تعد PsaA و PsaB أكبر الوحدات الفرعية ل PSI وتشكلان جوهر المجمع. LHCI هو مركب هوائي حصاد الضوء المرتبط ب PSI ويتكون من أربعة هوائيات ، LHCA1-4. (ج) ينسق مركب PSI-LHCI أكثر من 150 رابطا. تظهر هنا الكلوروفيل (الأخضر) ، والكاروتينات (الوردي) ، والكينونات (الأرجواني) ، والدهون (البرتقالي) ، ومجموعات FeS لمركز التفاعل باللون الأصفر / البرتقالي. (د) ينقسم مركز تفاعل PSI إلى فرعين (A و B) ، بدءا من P700 ، زوج الكلوروفيل الخاص بمركز التفاعل ، وينتقل إلى اثنين من الكلوروفيل الإضافي (A-1A / B) متبوعا بزوج آخر من الكلوروفيل (A0A / B). يتبع هذه الكلوروفيل فيلوكينون (A1A / B أو QA / B في بعض المنشورات) في كل فرع قبل الانضمام معا في مجموعة الحديد والكبريت Fx متبوعة بمجموعتين أخريين ، FA و FB ، بتنسيق من الوحدة الفرعية PsaC. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ألقت العزل الأول ل PSI من النباتات في عام 1966 الضوء على الاختلافات في محتوى صبغة حصاد الضوء بين PSI و PSII ، مما يدل على أن PSI كان غنيا بدرجة عالية في β-كاروتين بالنسبة ل PSII وأن السيتوكرومات f و b6 (جزء من مجمعات السيتوكروم b6f) ليست مرتبطة بإحكام ب PSI ولكنها مرتبطة بشكل فضفاض داخل غشاء الثايلاكويد8. بعد تسع سنوات ، مع التمسخ الجزئي ل PSI المعزول عن طريق معالجة SDS ، تبين أن تفكك الوحدات الفرعية الصغيرة PSI أدى إلى إخماد NADP + الاختزال الضوئي بواسطة PSI ، بينما ظلت إشارة P700 ومعظم الكلوروفيل داخل جسيم PSI ذو الوزن الجزيئي الكبير المتبقي ، مما يحدد ضرورة وجود بعض الوحدات الفرعية الصغيرة ل PSI للوظيفة البيولوجية الكاملة وموقع مركز تفاعلPSI 9. تم نشر البحث في الارتباط بين نواة PSI و LHCI لأول مرة في أوائل الثمانينيات ، عندما لوحظت عزلات لأنواع PSI مختلفة الحجم تحتوي على نسب مختلفة من الكلوروفيل A إلى P700 ، مما يشير إلى ارتباط PSI بنظام هوائي محيطي يحتوي على الكلوروفيل10،11،12،13. ومع ذلك ، لم يتم نشر أول هيكل بلوري للنبات PSI حتىعام 2003. سلط التركيب البلوري للمصنع PSI-LHCI الضوء على الحفظ الملحوظ بين نواة PSI للنباتات والبكتيريا الزرقاء وقدم الصورة الأولى لترتيب الكلوروفيل داخل نواة PSI للنبات وهوائي LHCI ، مما يعزز فهم مسارات نقل الطاقة داخل مركب PSI-LHCIللمصنع 14. على مدار العقد الماضي ، تم تحديد المزيد من هياكل PSI-LHCI النباتية ، مما أدى إلى إضافة تفاصيل المستويات الذرية إلى الوصف الهيكلي للمركب الفائق15،16،17،18،19.

لا تتمتع PSI بكفاءة كمية قريبة من واحد فحسب ، بل تتميز بإمكانات الاختزال الأكثر سلبية في الطبيعة20،21. يعد الفهم الكامل ل PSI-LHCI وخصائصه أمرا ضروريا لفهم نقل الطاقة المدفوعة بالضوء وتطبيق الحلول المستوحاة من الحيوية لتقنية حصاد الضوء المستقبلية. لتعزيز هذا الفهم لكيفية تحقيق PSI-LHCI ووحداتها الفرعية العديدة مثل هذا التحويل الفعال للطاقة ، يجب أن تكون المجمعات المعزولة للدراسة نشطة وكاملة. يسمح هذا البروتوكول بتنقية لطيفة للمركب في هذه الحالة النشطة22،23.

في هذه الطريقة ، يتم تعطيل الأنسجة النباتية ميكانيكيا ويتم عزل البلاستيدات الخضراء التي تحتوي على سلسلة نقل الإلكترون الضوئي عن طريق الطرد المركزي. يتم فصل أغشية الثايلاكويد بعد تحلل البلاستيدات الخضراء منخفضة التوتر ثم يتم إذابتها باستخدام المنظف n-dodecyl-beta-maltoside (β-DDM). يتم فصل مجمعات الغشاء المحتوية على الكلوروفيل المذاب باستخدام كروماتوغرافيا تبادل الأنيون ويتم فصل PSI-LHCI باستخدام الطرد المركزي المتدرج للسكروز. بعد الإزالة من التدرج وبعد التوصيف عن طريق كل من التحليل الطيفي واستخدام الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE) ، يمكن تحضير المركب لمزيد من التجارب. يستخدم هذا الإجراء لتنقية مركب PSI-LHCI من النباتات دون استخدام أي علامات تقارب. مع تعديلات طفيفة ، يمكن تكييفه مع استعدادات المركب من الكائنات الحية الأخرى ، أو تثبيت مجمعات PSI البديلة أو المجمعات الأخرى لسلسلة نقل الإلكترون الضوئي. تم استخدام بروتوكولات مماثلة للحصول على مركب PSI مناسب للتحليل الهيكلي عالي الدقة23،24،25،26،27،28،29،30.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير أغشية الثايلاكويد من أوراق السبانخ

  1. اعمل على الثلج وتجنب التعرض للضوء حيثما أمكن في هذا المستحضر. وتكون بيئة الإضاءة المنخفضة كافية إذا تم الحفاظ على تركيزات عالية من الكلوروفيل، ويتم الحرص على إبقاء العينات مغطاة قدر الإمكان. قم بتنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ما لم ينص على خلاف ذلك.
  2. قم بإزالة السيقان من أوراق السبانخ (500 جم) باستخدام المقص ، واضغط برفق على الأوراق في الخلاط وقم بتغطيتها بالكامل بالسكروز المثلج ، وتريسين ، وكلوريد الصوديوم (STN) (الجدول 1). تجانس الأنسجة النباتية في مخزن STN المؤقت لمدة 10 ثوان مرتين (إجمالي 20 ثانية) ، مع ترك 10 ثوان بين النبضات لمنع ارتفاع درجة الحرارة باستخدام إعداد النبض.
    ملاحظة: النسبة النموذجية للمخزن المؤقت للأوراق هي 1 لتر من مخزن STN المؤقت ل 500 غرام من أوراق السبانخ.
  3. قم بتصفية بقايا الخلية من خلال ثماني طبقات من القماش القطني عن طريق تثبيت طبقات القماش القطني فوق دورق كبير مبرد أو وعاء آخر وصب الخليط المخلوط عبر القماش. استخدم قضيبا زجاجيا أو ملعقة لتقليب بقايا الخلية في الفلتر للسماح للحللة بالتدفق.
  4. البلاستيدات الخضراء الحبيبية من تحلل الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 9 دقائق. أعد تعليق البلاستيدات الخضراء في 1 لتر من المخزن المؤقت منخفض التوتر (الجدول 1). لإعادة تعليق البلاستيدات الخضراء ، استخدم ماصة أو حبيبات دوامة من البلاستيدات الخضراء في مخزن مؤقت وانقلها إلى مطحنة أنسجة أو مغالط مماثل بحجم مناسب.
    ملاحظة: يؤدي التعرض لمحلول منخفض التوتر وإعادة التعليق في مطحنة الأنسجة إلى تحلل البلاستيدات الخضراء.
  5. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 500 × جم لإزالة النشا (تم جمعه على شكل حبيبات بيضاء). أعد تعليق أي مادة خضراء تم تكويبها مرة أخرى في المادة الطافية برفق باستخدام ماصة أو فرشاة طلاء صغيرة مع تجنب إعادة تعليق النشا قدر الإمكان. الطرد المركزي المحلول عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق لتحبيب أغشية الثايلاكويد.
  6. أعد تعليق الأغشية المحببة بكميات قليلة من المخزن المؤقت لإعادة تعليق الملح العالي (الجدول 1) ، بما يكفي فقط لإعادة تعليق الأغشية ، باستخدام ماصة أو فرشاة طلاء صغيرة وتجانسها باستخدام الخالط كما في الخطوة 1.4. جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق.
  7. قم بإعادة التعليق كما كان من قبل بكميات قليلة من المخزن المؤقت STN2 (الجدول 1) ، بما يكفي فقط لإعادة تعليق الأغشية وقياس محتوى الكلوروفيل باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية. حدد تركيز الكلوروفيل عن طريق تخفيف العينة 1/1000 في محلول الأسيتون بنسبة 80٪ وباستخدام طريقة Porra et al.31.
  8. اضبط تركيز الكلوروفيل المطلوب ، عادة 3 مجم / مل ، عن طريق إضافة المخزن المؤقت STN2 ونقل السعر بالتساوي في اثنين أو ثلاثة أنابيب طرد مركزي. يبلغ العائد المتوقع من 500 غرام من الأوراق حوالي 200 مجم من الكلوروفيل ، ولكن من المتوقع حدوث اختلاف بناء على حالة المادة الأولية. جمد عند -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للذوبان الغشائية. الأغشية المجمدة في هذه المرحلة مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل.

2. الذوبان الغشائي

  1. قم بإذابة أغشية الثايلاكويد باستخدام β-DDM. أضف كمية كافية من المنظفات من مخزون 10٪ β-DDM لتحقيق نسبة 6: 1 β-DDM إلى الكلوروفيل. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة. امزج برفق كل 5-10 دقائق عن طريق قلب الأنبوب ببطء عدة مرات.
  2. جهاز طرد مركزي عند 120،000 × جم لمدة 30 دقيقة باستخدام جهاز طرد مركزي فائق لإزالة المواد غير القابلة للذوبان. تخلص من الحبيبات واحتفظ بالمادة الطافية للخطوات اللاحقة.

3. الشطف باستخدام عمود ثنائي إيثيل أمينوإيثيل (DEAE)

  1. قم بإعداد عمود تبادل الأنيون باستخدام حجم طبقة 1.5 مل ل 1 مجم من الكلوروفيل الكلي في العينة القابلة للذوبان. جهز العمود وقم بتشغيله عند 4 درجات مئوية. صب الراتنج في عمود مثبت على حامل حلقي. اسمح للراتنج بالاستقرار أثناء إضافة الماء أو عمود المحلول المنخفض الملح لمنع العمود من الجفاف. تأكد من خلو العمود من الفقاعات وأن الجزء العلوي مسطح ومستو.
  2. اغسل العمود باستخدام مجلدين للعمود (CV) من المخزن المؤقت منخفض الملح للعمود (الجدول 1) وقم بتحميل المادة الطافية من الخطوة 2.2 على العمود. اسمح للطافي بالركض بالكامل في العمود قبل المضي قدما.
  3. اغسل العمود في سيرة ذاتية واحدة من عمود عازل منخفض الملح.
  4. قم بإزالة الألغام باستخدام تدرج خطي كلوريد الصوديوم مع مخازن عمود الملح المنخفض والملح العالي (5-250 ملي كلوريد الصوديوم ؛ الجدول 1) مصنوع بحجم إجمالي قدره ستة سيرة ذاتية (على سبيل المثال ، إذا كان حجم قاع العمود 30 مل ، فاستخدم 90 مل من المحلول المؤقتة منخفضة الملح و 90 مل من المحلول المؤقتة العالي الملح).
    1. املأ كوبين بمخازن الملح المنخفضة والعالية. أثناء تقطير المحلول الملحي المنخفض في العمود ، قم بإنشاء جسر ملح بين مخازن الملح العالية والمنخفضة باستخدام أنبوب مملوء بالماء لخلطها تدريجيا. استخدم قضيب التحريك للتأكد من خلط المخزن المؤقت للملح العالي الذي يتحرك إلى المخزن المؤقت منخفض الملح قبل أن يتم تقطيره في العمود. هذا يضمن أن يكون تدرج كلوريد الصوديوم خطيا. ابدأ في جمع الكسور.
  5. اجمع 4 مل من الكسور (لتجربة نموذجية تبدأ بحوالي 35 مجم من الكلوروفيل) واجمع بين الكسور الخضراء الداكنة التي تدور حول الثلث الأخير من التدرج (الشكل 2 أ).

4. ترسيب البولي إيثيلين جلايكول (PEG)

  1. إلى كسور الكلوروفيل المجمعة ، أضف ببطء PEG6000 إلى التركيز النهائي البالغ 8٪. يمكن أن يختلف تركيز PEG قليلا. إذا لم يشاهد هطول الأمطار بعد الوصول إلى 8٪ ، فقم بزيادة تركيز PEG بزيادات 2٪ حتى يظهر هطول الأمطار (سيصبح المحلول غائما).
  2. جهاز طرد مركزي عند 3,214 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية تماما. تعد الإزالة الكاملة لجميع PEG المتبقية أمرا ضروريا لتحقيق الذوبان الجيد في الخطوة التالية. أعد تعليق الراسب الأخضر في 2-5 مل من المخزن المؤقت لإعادة تعليق العمود (الجدول 1).
  3. للتحقق من أن الثايلاكويدات قد تم غسلها بالكامل من PEG ، قم بتدوير كمية صغيرة من المادة المعلقة في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة عند 18,407 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق للتأكد من أن المادة قابلة للذوبان. الراسب الأخضر الصغير مقبول في هذه المرحلة ، ولكن يجب أن يبقى معظم الكلوروفيل ، إن لم يكن كله ، في المحلول. حافظ على الجزء القابل للذوبان.

5. تحضير تدرجات السكروز

  1. قم بإعداد تدرجات سكروز متقطعة بنسبة 10٪ -30٪ في خمس طبقات (طبقات 10٪ و 15٪ و 20٪ و 25٪ و 30٪) باستخدام عازلة تدرج السكروز (الجدول 1). قم بتجميع تدرجات السكروز عن طريق وضع طبقات من السكروز بعناية في أنبوب طرد مركزي متعدد الألومر ، بدءا من طبقة 30٪ وتنتهي بطبقة 10٪. اضبط حجم كل طبقة بحيث يكون هناك مساحة رأس كافية في الجزء العلوي من الأنبوب لتحميل الحجم المطلوب من العينة.
  2. قم بتحميل عينات من المادة القابلة للذوبان من الخطوة 4.2 إلى تدرجات السكروز. قم بتحميل عينة كافية لتساوي 170 ميكروغرام من الكلوروفيل في أنبوب واحد ، و 420 ميكروغرام من الكلوروفيل في أنبوب آخر للحصول على تدرجات بتركيزات مختلفة لتقييم تجانس كل نطاق (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: كمية العينة المضافة تعسفية ولكن عادة ما يكون النطاق الذي يتراوح بين 150 و 500 ميكروغرام من الكلوروفيل مناسبا.
  3. الطرد المركزي التدرجات عند 100,000 × جم لمدة 16 ساعة لفصل المجمعات المختلفة داخل العينة.

6. إزالة كسور السكروز وهطول الأمطار PEG

  1. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة التدرجات من الدوار والتقط صورا للأنابيب باستخدام كاميرا رقمية أو هاتف محمول. اعزل الكسور عن طريق ثقب الأنابيب الموجودة في الأسفل بإبرة ثم تصريف المحتويات ببطء. اجمع الكسور المختلفة المحتوية على الكلوروفيل في أنابيب الطرد المركزي.
    ملاحظة: يمكن اقتباس العينات وتجميدها لتحليلها لاحقا إذا رغبت في ذلك.
  2. بالنسبة لبعض التطبيقات ، من المستحسن إزالة السكروز. لإزالة السكروز ، استخدم الخطوة الثانية من ترسيب PEG (أو ترشيح الجل). اضبط تركيز كلوريد الصوديوم في جزء PSI-LHCI إلى 120 ملي مولار وأضف PEG6000 إلى التركيز النهائي بنسبة 10٪.
  3. جهاز طرد مركزي العينة في جهاز طرد مركزي على الطاولة عند 18,407 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات الخضراء في 30 ملي مولار Tricine-NaOH درجة الحموضة 8.0 و 50 ملي كلوريد الصوديوم و 0.05٪ β-DDM.
  4. قم بالطرد المركزي للعينة في جهاز طرد مركزي على الطاولة عند 18,407 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لضمان بقاء جميع المواد في المحلول.

7. قياس محتوى P700 من PSI

ملاحظة: يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص PSI بسرعة.

  1. خفف العينات إلى OD680 من 1-1.5 واحتضانها في الظلام مع 10 ملي مولار حمض الأسكوربيك لمدة 1 ساعة لتقليل P700 تماما.
  2. قم بقياس طيف امتصاص العينة باستخدام مطياف UV-Vis. قم بقياس الامتصاص من 650 نانومتر فقط إلى 750 نانومتر بفاصل بيانات 0.50 نانومتر ومعدل مسح 60 نانومتر / دقيقة لفحص محتوى P700.
  3. قم بتعريض العينة للضوء الساطع (350 ميكرومول فوتونات / م2 / ثانية) وقم بقياس الطيف مرة أخرى أثناء التعرض.
  4. اطرح الطيف المظلم من طيف الضوء لملاحظة تبيض P700 عند حوالي 702 نانومتر في النباتات.
  5. حدد محتوى P700 باستخدام الامتصاص عند 700 نانومتر ومعامل انقراض 64 / ملي متر / سم كما هو موضح في Hiyama و Ke32،33،34.
  6. قم بقياس كمية الكلوروفيل الإجمالية (الكلوروفيل أ والكلوروفيل ب) باستخدام الطريقة الموضحة في Porra et al.31. استخدم هذه التركيزات لتحديد نسبة الكلوروفيل إلى P700.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول لعزل وتوصيف PSI-LHCI النشط من الأنسجة النباتية على مدار ثلاثة أيام. يتم تنقية PSI-LHCI عن طريق عزل أغشية الثايلاكويد النباتية أولا والتي يتم إذابتها بعد ذلك باستخدام β-DDM. الغلة النموذجية من مرحلة تحضير الغشاء هي 200 مجم من الكلوروفيل من 500 غرام من الأوراق. يمكن أن يختلف هذا بناء على المواد الأولية المستخدمة.

يستخدم اليومان الثاني والثالث من التجربة كروماتوغرافيا تبادل الأنيون والطرد المركزي المتدرج للسكروز لفصل مجمعات البروتين المختلفة داخل غشاء الثايلاكويد. بعد الذوبا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تنقية مركب PSI-LHCI من الأنسجة النباتية في حالته النشطة. تم استخدام أوراق السبانخ هنا ، ولكن يمكن تطبيق هذه الطرق على الاستعدادات من نباتات مختلفة23،40. في جميع الحالات ، يجب توخي الحذر أثناء تنفيذ هذا البروتوكول لحماية المجمع من التلف. يجب أن يتم هذا التحضير في الظلام أو تحت الضوء الأخضر ، على الجليد مع مخازن مبردة مسبقا ، ويجب تنفيذ جميع خطوات إعادة التعليق برفق.

أثناء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر Y.M. بالدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب الجائزة رقم 2034021 ووزارة الطاقة الأمريكية ، ومكتب العلوم ، ومكتب علوم الطاقة الأساسية ، وقسم العلوم الكيميائية ، وعلوم الأرض ، والعلوم البيولوجية بموجب الجائزة رقم. DE-SC0022956. CG مدعومة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب الجائزة رقم 00036806.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل أنبوب فالكونVWR62406-200يستخدم لتخزين الثايلاكويدات
Bio rad Econo-Column 1.5 × 30 سمbiorad7374153
القماش القطني الصف 50 ، 100٪ قطنArkwright LLCB07D1FZZMBمن قضبان زجاج
أمازون Millipore SigmaBR135825أي قضيب مماثل يكفي
خلاط فيتاميكس 64 أوقيةفيتاميكس
NaClSigma-AldrichS7653
أنابيب الطرد المركزي المفتوحة من البولي ألومرسيتون ساينتفيك5030
أوبتيما XE الطرد المركزي الفائقبيكمان كولترA94471
البولي إيثيلين جلايكول 6,000هامبتون ريسيرشHR2-533
مطحنة الأنسجة بوتر إلفيهجين ، 30 مل.WHEATON358049
السكروزSigma-AldrichS7903
SW 40 Tibeckman coulter331301
TOYOPEARL DEAE-650CTosoh Bioscience7988
TricineSigma-AldrichT0377
& beta ;-DDMGlycon - Biochemicals GmbHD97002مخزنة كمخزون بنسبة 10٪ عند -20 درجة ؛ ج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, N., Junge, W. Structure and energy transfer in photosystems of oxygenic photosynthesis. Annual Review of Biochemistry. 84, 659-683 (2015).
  2. Fischer, W. W., Hemp, J., Johnson, J. E. Evolution of oxygenic photosynthesis. Annual Review of Earth and Planetary Sciences. 44 (1), 647-683 (2016).
  3. Yoon, H. S., Hackett, J. D., Ciniglia, C., Pinto, G., Bhattacharya, D. A molecular timeline for the origin of photosynthetic eukaryotes. Molecular Biology and Evolution. 21 (5), 809-818 (2004).
  4. Busch, A., Hippler, M. The structure and function of eukaryotic photosystem i. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1807 (8), 864-877 (2011).
  5. Rochaix, J. D. Regulation of photosynthetic electron transport. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1807 (3), 375-383 (2011).
  6. Croce, R., Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R. The Lhca antenna complexes of higher plants photosystem I. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1556 (1), 29-40 (2002).
  7. Croce, R., Van Amerongen, H. Light-harvesting in photosystem I. Photosynthesis Research. 116 (2-3), 153-166 (2013).
  8. Anderson, J. M., Boardman, N. K. Fractionation of the photochemical systems of photosynthesis I. Chlorophyll contents and photochemical activities of particles isolated from spinach chloroplasts. Bibliotek for Laeger. 112 (3), 403-421 (1966).
  9. Bengis, C., Nelson, N. Purification and properties of the photosystem I reaction center from chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 250 (8), 2783(1975).
  10. Lam, E., Ortiz, W., Malkin, R. Chlorophyll a/b proteins of Photosystem I. FEBS Letters. 168 (1), 10-14 (1984).
  11. Kuang, T. Y., Argyroudi-Akoyunoglou, J. H., Nakatani, H. Y., Watson, J., Arntzen, C. J. The origin of the long-wavelength fluorescence emission band (77°K) from photosystem I. Archives of Biochemistry and Biophysics. 235 (2), 618-627 (1984).
  12. Mullet, J. E., Burke, J. J., Arntzen, C. J. A developmental study of Photosystem I peripheral chlorophyll proteins. Plant Physiology. 65 (5), 823-827 (1980).
  13. Mullet, J. E., Burke, J. J., Arntzen, C. J. Chlorophyll a/b proteins of Photosystem I. Plant Physiology. 65 (5), 814-822 (1980).
  14. Ben-Shem, A., Frolow, F., Nelson, N. Crystal structure of plant photosystem I. Nature. 426 (6967), 630-635 (2003).
  15. Mazor, Y., Borovikova, A., Nelson, N. The structure of plant photosystem I super-complex at 2.8 A resolution. eLife. 4, 07433(2015).
  16. Qin, X., Suga, M., Kuang, T., Shen, J. R. Photosynthesis. Structural basis for energy transfer pathways in the plant PSI-LHCI supercomplex. Science. 348 (6238), New York, N.Y. 989-995 (2015).
  17. Mazor, Y., Borovikova, A., Caspy, I., Nelson, N. Structure of the plant photosystem I supercomplex at 2.6 resolution. Nature Plants. 3, 17014(2017).
  18. Pan, X., et al. Structure of the maize photosystem I supercomplex with light-harvesting complexes I and II. Science. 360 (6393), New York, N.Y. 1109-1113 (2018).
  19. Wang, J., et al. Structure of plant photosystem I−light harvesting complex I supercomplex at 2.4 Å resolution. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (7), 1367-1381 (2021).
  20. Jensen, P. E., et al. function, and regulation of plant photosystem I. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1767 (5), 335-352 (2007).
  21. Nelson, N. Plant photosystem I - The most efficient nano-photochemical machine. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 9 (3), 1709-1713 (2009).
  22. Amunts, A., Toporik, H., Borovikova, A., Nelson, N. Structure determination and improved model of plant photosystem I. Journal of Biological Chemistry. 285 (5), 3478-3486 (2010).
  23. Gorski, C., et al. The structure of the Physcomitrium patens photosystem I reveals a unique Lhca2 paralogue replacing Lhca4. Nature Plants. 8 (3), 307-316 (2022).
  24. Perez-Boerema, A., et al. Structure of a minimal photosystem I from the green alga Dunaliella salina. Nature Plants. 6 (3), 321-327 (2020).
  25. Toporik, H., et al. The structure of a red-shifted photosystem I reveals a red site in the core antenna. Nature Communications. 11 (1), 5279(2020).
  26. Toporik, H., Li, J., Williams, D., Chiu, P. L., Mazor, Y. The structure of the stress-induced photosystem I-IsiA antenna supercomplex. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 443-449 (2019).
  27. Caspy, I., et al. Structure and energy transfer pathways of the Dunaliella Salina photosystem I supercomplex. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1861 (10), 148253(2020).
  28. Naschberger, A., et al. Algal photosystem I dimer and high resolution model of PSI:plastocyanin complex. Nature Plants. 8 (10), 1191-1201 (2022).
  29. Furukawa, R., et al. Formation of a PSI-PSII megacomplex containing LHCSR and PsbS in the moss Physcomitrella patens. Journal of Plant Research. 132 (6), 867-880 (2019).
  30. Gisriel, C. J., et al. High-resolution cryo-electron microscopy structure of photosystem II from the mesophilic cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (1), 2116765118(2021).
  31. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 12 (2), 103-107 (2004).
  32. Bassi, R., Simpson, D. Chlorophyll-protein complexes of barley photosystem I. European Journal of Biochemistry. 163 (2), 221-230 (1987).
  33. Hiyama, T., Ke, B. Difference spectra and excitation coefficients of P700. Biochimica et Biophysica Acta. 267 (459), 160-171 (1972).
  34. Anderson, J. M. P-700 content and polypeptide profile of chlorophyll-protein complexes of spinach and barley thylakoids. Biochimica et Biophysica Acta. 591 (1), 113-126 (1980).
  35. Caspy, I., et al. Dimeric and high-resolution structures of Chlamydomonas Photosystem I from a temperature-sensitive Photosystem II mutant. Communications Biology. 4 (1), 1-10 (2021).
  36. Caffarri, S., Kouřil, R., Kereïche, S., Boekema, E. J., Croce, R. Functional architecture of higher plant photosystem II supercomplexes. EMBO Journal. 28 (19), 3052-3063 (2009).
  37. Su, X., et al. Structure and assembly mechanism of plant C2S2M2-type PSII-LHCII supercomplex. Science. 357 (6353), 815-820 (2017).
  38. Malone, L. A., et al. Cryo-EM structure of the spinach cytochrome b 6 f at 3.6 Å resolution. Nature. 575 (7783), 535-539 (2019).
  39. Guo, H., Rubinstein, J. L. Structure of ATP synthase under strain during catalysis. Nature Communications. 13 (1), 2-10 (2022).
  40. Mazor, Y., Borovikova, A., Caspy, I., Nelson, N. Structure of the plant photosystem I supercomplex at 2.6 Å resolution. Nature Plants. 3, 17014(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PSI LHCI
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة