تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتشريح الأربطة الرحمية العجزية وأنسجة قاع الحوض الأخرى ، بما في ذلك عنق الرحم والمستقيم والمثانة في الفئران ، لتوسيع دراسة الأنسجة التناسلية الأنثوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتشريح الأربطة الرحمية العجزية وأنسجة قاع الحوض الأخرى ، بما في ذلك عنق الرحم والمستقيم والمثانة في الفئران ، لتوسيع دراسة الأنسجة التناسلية الأنثوية.
هبوط أعضاء الحوض (POP) هو حالة تؤثر على سلامة قاع الحوض وهيكله ودعمه الميكانيكي. يتم دعم الأعضاء الموجودة في قاع الحوض بواسطة هياكل تشريحية مختلفة ، بما في ذلك العضلات والأربطة واللفافة الحوضية. الرباط الرحمي العجزي (USL) هو هيكل حامل حرج، وتؤدي إصابة USL إلى زيادة خطر الإصابة بالملوثات العضوية الثابتة. يصف هذا البروتوكول تشريح USLs الفئران وأعضاء قاع الحوض جنبا إلى جنب مع الحصول على بيانات فريدة عن التركيب الكيميائي الحيوي USL ووظيفته باستخدام مطيافية رامان وتقييم السلوك الميكانيكي. الفئران هي نموذج لا يقدر بثمن للبحوث قبل السريرية، ولكن تشريح الفئران USL هو عملية صعبة ومعقدة. يقدم هذا الإجراء نهجا لتوجيه تشريح أنسجة قاع الحوض الفئران، بما في ذلك USL، لتمكين العديد من التقييمات والتوصيف. يهدف هذا العمل إلى المساعدة في تشريح أنسجة قاع الحوض من قبل العلماء والمهندسين الأساسيين، وبالتالي توسيع إمكانية الوصول إلى الأبحاث حول USL وظروف قاع الحوض والدراسة قبل السريرية لصحة المرأة باستخدام نماذج الفئران.
يتأثر ما يقرب من 50٪ من النساء بهبوط أعضاء الحوض (POP)1,2. حوالي 11٪ من هؤلاء النساء يتناسبن مع معايير الخضوع للإصلاح الجراحي ، والتي لديها معدل نجاح ضعيف (~ 30٪) 3,4. يتميز الملوثات العضوية الثابتة بنزول أي من أعضاء الحوض أو جميعها (أي المثانة والرحم وعنق الرحم والمستقيم) من وضعها الطبيعي بسبب فشل USL وعضلات قاع الحوض في توفير الدعم الكافي5. تتضمن هذه الحالة اختلالا تشريحيا واضطرابا في النسيج الضام ، بالإضافة إلى إصابة عصبية عضلية ، بالإضافة إلى العوامل المؤهبة 3,6. يرتبط الملوثات العضوية الثابتة بعوامل متعددة مثل العمر والوزن والتكافؤ ونوع الولادة (أي الولادات المهبلية أو القيصرية). ويعتقد أن هذه العوامل تؤثر على السلامة الميكانيكية لجميع أنسجة قاع الحوض، ويعتقد أن الحمل والتكافؤ هما المحركان الرئيسيان للملوثات العضوية الثابتة5،7،8.
الأربطة الرحمية العجزية (USLs) هي هياكل داعمة مهمة للرحم وعنق الرحم والمهبل وتربط عنق الرحم بالعجز4. إن الأضرار التي لحقت بالمثقفين الجامعيين الطارئين (USLs) تعرض النساء لخطر متزايد للإصابة بالملوثات العضوية الثابتة. ويعتقد أن الحمل والولادة يفرضان ضغطا إضافيا على USL، مما قد يؤدي إلى الإصابة ويزيد من فرص الإصابة بالملوثات العضوية الثابتة. USL هو نسيج معقد يتكون من خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية والليمفاوية موزعة بشكل غير متجانس على طول الرباط ، والتي يمكن تقسيمها إلى ثلاثة أقسام متميزة: عنق الرحم والمنطقة المتوسطة والعجزية9. تستمد السلامة الميكانيكية ل USL من مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) مثل الكولاجين والإيلاستين والبروتيوغليكان5،9،10. من المعروف أن ألياف الكولاجين من النوع الأول هي مكون شد رئيسي حامل للأنسجة الرباطية ، وبالتالي من المحتمل أن تكون متورطة في فشل USL والملوثات العضوية الثابتة11.
وهناك نقص في المعرفة فيما يتعلق بأسباب الملوثات العضوية الثابتة وانتشارها وآثارها على النساء. يعد تطوير نموذج حيواني مناسب للملوثات العضوية الثابتة ضروريا لتعزيز فهمنا لقاع الحوض الأنثوي. للفئران والبشر معالم تشريحية متشابهة داخل الحوض، مثل الحالب والمستقيم والمثانة والمبيضين والأربطة المستديرة9، بالإضافة إلى نقاط تقاطع مماثلة ل USL مع الرحم وعنق الرحم والعجز. وعلاوة على ذلك، توفر الفئران سهولة التلاعب الجيني ولديها القدرة على أن تكون نموذجا يسهل الوصول إليه وفعالا من حيث التكلفة لدراسة الملوثات العضوية الثابتة9.
طورت هذه الدراسة طريقة للوصول إلى USL وأنسجة قاع الحوض المختلفة وعزلها من الفئران الخالية من الحمل (أي التي لم تكن حاملا أبدا). خضعت USLs المستخرجة للهضم الأنزيمي (أي لإزالة الكولاجين والجليكوزامينوجليكان)، وتم اختبارها لتحديد الاستجابة الميكانيكية تحت تحميل الشد، وتم تقييمها للتركيب الكيميائي الحيوي في دراسة إثبات المفهوم. ستسهل القدرة على عزل الأنسجة السليمة المزيد من الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية لمكونات قاع الحوض ، وهي خطوة أولى حاسمة نحو تحسين فهمنا لمخاطر الإصابة المتعلقة بالولادة والحمل والملوثات العضوية الثابتة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم إجراء جميع التجارب والإجراءات على الحيوانات وفقا للبروتوكول # 2705 ، الذي وافقت عليه لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة كولورادو بولدر. تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر ستة أسابيع في الدراسة الحالية. تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. إعداد الحيوان

الشكل 1: مساحة عمل نظيفة مع جميع الأدوات اللازمة لإجراء التشريح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: إزالة الجلد وفتح تجاويف الحوض والصدر في الفأر. أ: تثبيت جميع الأطراف. ب: الشق الأولي. ج: فصل الجلد عن اللفافة الكامنة باستخدام المقص. د: قطع الجلد والتحضير لإزالته. (E-G) سحب الجلد عن طريق الالتفاف حول الماوس. (ح) إزالة الجلد تماما من الجانب الظهري. (ط) الإزالة الكاملة للجلد من الجذع ، وإعادة تثبيت أطراف الفأر. ي: فتح البطن. (ك) منظر للبطن المفتوح. (ل) نقل الأعضاء خارج مجال الرؤية. م: إزالة الدهون. (N) منظر لقاع الحوض النظيف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. حصاد USL

الشكل 3: تنظيف قاع الحوض لتشريح USL. أ: رسم تخطيطي للتشريح. ب: قطع قرني الرحم عند وصلة المبيض. ج: قطع قرون الرحم. د: قطع الحالبين. ه: قطع القولون. (F) رؤية واضحة للمستقيم وUSLs. (ز) وضع الماوس ولوحة التشريح تحت نطاق التشريح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: منظر ل USL والأنسجة المحيطة بها وتشريح USLs . (أ) رسم تخطيطي للمعالم التشريحية المحيطة ب USL. ب: ربط خياطة حول طرفي عنق الرحم. (ج) قطع الأطراف العنقية ل USL. (د) تقطيع USL لاستخدامها في التحليلات الكيميائية الحيوية عند الوصلة المقدسة. ه: قطع عظم الفخذ من عظم الحوض. (و) قطع الطرف القريب من الحوض. (ز) تشريح USL في طبق بتري 35 مم. (H) USL مع الحوض المتصل في طبق بتري 35 مم. (I) USL والمستقيم عند تكبير 0.75x. (ي) إزالة الدهون من USL. (ك) تنظيف USLs عند تكبير 1.0x. شريط المقياس = 2 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
3. حصاد المثانة
4. حصاد المستقيم
5. حصاد عنق الرحم المهبلي المعقد

الشكل 5: تشريح المثانة والمستقيم وعنق الرحم / المهبل. أ: إمساك المثانة بزاوية. ب: قطع المثانة. ج: قطع الوتر الواصل بين عنق الرحم والمستقيم. د: الوتر عند تكبير 1.0x. ه: قطع المستقيم. (و) التمسك بعنق الرحم بالملقط. (ز) القطع في الطرف البعيد من المهبل. (ح) المثانة في طبق بتري 35 مم. (I) المستقيم في طبق بتري 35 مم. (ي) مجمع أنسجة عنق الرحم والمهبل في طبق بتري 35 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. إعداد عينة لتوصيف الأنسجة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يتم تفصيل كل خطوة من خطوات تشريح الماوس من النوع البري في الفيديو المرتبط والأرقام المتعلقة بالبروتوكول. في هذه الدراسة ، تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 6 أسابيع (الجدول التكميلي 1). تم تحليل ثلاث مجموعات عينات مع USLs المعالجة بإنزيمات مختلفة: المجموعة الضابطة (بدون علاج) ، والمجموعات المعالجة بالكولاجيناز ، والمجموعات المعالجة بالكوندرويتيناز. العضلات الملساء والأعصاب والخلايا اللمفاوية في USL محاطة بوحدة تحكم إلكترونية غنية بالكولاجين الليفي والجليكوزامينوجليكان (GAGs)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ولم يدرس تأثير الضرر الهيكلي على الأنسجة التناسلية الأنثوية، وهناك حاجة إلى نموذج حيواني يسهل الوصول إليه لبحوث الملوثات العضوية الثابتة. الفأر هو نموذج فعال من حيث التكلفة يمكن أن يحاكي الدراسات التناسلية البشرية16. بسبب الاهتمام المتزايد بدراسة الجهاز التناسلي للأنثى ، هناك حاجة إلى طرق تساعد في دراسة هذه الأنسجة. لتلبية هذه الحاجة ، في هذا العمل ، تم إنشاء طريقة لتشريح وإعداد أنسجة قاع الحوض الفئران للتحليلات الهيكلية والوظيفية.
لنجاح التشريح ، هناك حاجة إلى الوقت ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من خلال منحة برنامج فرص البحث تحت الأرض الصيفية CU Boulder (UROP) (CB) ، وزمالة أبحاث الدراسات العليا NSF (LS) ، وزمالة شميدت للعلوم (CL) ، وبرنامج منحة البذور للأبحاث والابتكار بجامعة كولورادو (جائزة 2020 إلى VF و SC و KC) ، ومنحة Anschutz Boulder Nexus Seed في جامعة كولورادو (إلى VF و KC). شكر خاص للدكتور تايلر تاتل للمساعدة في تصميم غرفة التحميل وكذلك أعضاء مختبر Calve لإجراء مناقشات مفيدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 11 شفرة | فيشر | 3120030 | شفرة قابلة للإزالة |
| 1x PBS | فيشر | BP399-1 | مخفف من تركيز 10x |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme & nbsp ؛ |
| الكولاجيناز النوع الأول | ورثينجتون إنزيم LS004194 الكيمياء الحيوية | ؛ | |
| مجهر متحد البؤر | Leica | STELLARIS 5 | التكوين المستقيم |
| مجهر تشريح | Leica | S9E | مع الكاميرا |
| Dumont # 5 ملقط | فيشر | NC9626652 | طرف رفيع |
| أنثى C57BL / 6J الفئران | جاكسون سلالة مختبر | #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN خلية تحميل |
| FST ملقط منحني | فيشر | NC9639443 | طرف منحني |
| FST مقص شارب 9 مم ؛ | فيشر | NC9639443 | مقص تشريح |
| صبغ شبح 780 ؛ | Tonbo | 13-0865-T500 | صبغة أمين خالية |
| من Kimwipes | Fisher | 06-666 | علبة من 50 منديل |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | تستخدم للحفاظ على الأنسجة |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | اتبع تعليمات الشركة المصنعة أطباق |
| بتري 35 مم | فيشر | FB0875711A | تستخدم لتشريح |
| الأنسجة متعددة الجلكتين 5-0 خياطة | المخضرم.Sut | VS385VL | بإبرة |
| Renishaw InVia Raman المجهر | Renishaw | PN192 (EN) -02-A | مع أهداف متحدة |
| البؤر منصة هزاز | VWR | 10127-876 | 2 منصة طبقة |
| قفازات جراحية | فيشر | 52818 | للتشريح |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | وصمة عار نووية |
| T- دبابيس | فيشر | S99385 | للتشريح |
| نقل Pipets | Fisher | 13-711-7M | للتشريح |
| Underpads | Fisher | 22037950 | لتغطية وسادة التشريح |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.