يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إجراء متوافق مع GMP لتوليد الخلايا التائية المعدلة جينيا

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65097

⸱

أكتوبر 6, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cell Therapy, Bone Marrow Transplantation Lab, Department of Medicine, University of Patras, 2Protatonce Ltd, Demokritos Science Park

في هذه المقالة

ملخص

يحدد هذا البروتوكول عملية تحويل الخلايا التائية البشرية الأولية بجين مهم ، مما يضمن التوافق مع معايير ممارسات التصنيع الجيدة (GMP).

الملخص

تم إحداث ثورة في مجال العلاج بالخلايا بالتبني (ACT) من خلال تطوير الخلايا المعدلة وراثيا ، وتحديدا الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR). أظهرت هذه الخلايا المعدلة استجابات سريرية ملحوظة في المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الدموية. ومع ذلك ، فإن التكلفة العالية لإنتاج هذه العلاجات وإجراء تقييمات شاملة لمراقبة الجودة قد حدت من إمكانية وصولها إلى مجموعة أوسع من المرضى. لمعالجة هذه المشكلة ، تستكشف العديد من المؤسسات الأكاديمية جدوى التصنيع الداخلي للخلايا المعدلة وراثيا ، مع الالتزام بالمبادئ التوجيهية التي وضعتها الوكالات التنظيمية الوطنية والدولية.

يمثل تصنيع منتجات الخلايا التائية المعدلة وراثيا على نطاق واسع العديد من التحديات ، لا سيما من حيث القدرات الإنتاجية للمؤسسة والحاجة إلى تلبية متطلبات كمية التسريب. ينطوي أحد التحديات الرئيسية على إنتاج ناقلات فيروسية واسعة النطاق بموجب إرشادات ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) ، والتي غالبا ما يتم الاستعانة بمصادر خارجية لشركات خارجية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد تبسيط عملية نقل الخلايا التائية في تقليل التباين بين دفعات الإنتاج ، وخفض التكاليف ، وتسهيل تدريب الموظفين. في هذه الدراسة ، نحدد عملية مبسطة لنقل الفيروسات العدسية للخلايا التائية البشرية الأولية مع علامة الفلورسنت كجين مهم. تلتزم العملية برمتها بالمعايير المتوافقة مع GMP ويتم تنفيذها داخل مؤسستنا الأكاديمية.

المقدمة

أدى ظهور علاجات الخلايا المتبنية (ACT) والخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) إلى إحداث تحول ثوري في الممارسة السريرية الحديثة ، مما أدى إلى إنشاء نموذج جديد للطب الشخصي. على وجه الخصوص ، أظهرت الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التي تستهدف CD19 استجابات سريرية استثنائية وتمثل العلاج بالخلايا التائية الأكثر تقدما لأورام الخلايا البائيةالخبيثة 1،2،3،4،5. ومع ذلك ، فإن علاجات الخلايا التائية المعدلة جينيا التجارية الحالية تعتمد بشكل كبير على النواقل الفيروسية لنقل الجينات. يمثل تنفيذ النواقل الفيروسية في ACT ، خاصة في ظل ظروف ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) في إطار أكاديمي ، تحديات كبيرة بسبب قيود قابلية التوسع ، ومتطلبات المعدات المتخصصة ، والحاجة إلى موظفين ذوي مهارات عالية ، واستخدام الكواشف المتوافقة مع GMP لإنتاج الجسيمات الفيروسية بوساطة البلازميد6،7،8.

وبالتالي ، فإن عملية تصنيع علاجات الخلايا التائية المعدلة جينيا معقدة وتبدأ عادة بعزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) من منتج فصادة الكريات البيض. غالبا ما يتم إثراء الخلايا التائية من تجمع PBMC وتنشيطها باستخدام المجمعات الدقيقة المضادة ل CD3 / CD28 7,9. بعد ذلك ، يتم تعديل الخلايا التائية وراثيا باستخدام ناقلات فيروسية أو غير فيروسية ، والتي يمكن إنتاجها في الموقع أو الاستعانة بمصادر خارجية. للحصول على أعداد الخلايا المطلوبة للتسريب ، يتم توسيع الخلايا المعدلة جينيا قبل الصياغة النهائية و / أو الحفظ بالتبريد. أخيرا ، يجب أن يفي منتج الخلية بمعايير الإطلاق المختلفة بناء على فحوصات مراقبة الجودةالمتعددة 9.

يقدم هذا البروتوكول منهجية شاملة تستخدم تقنيات بسيطة للتلاعب خارج الجسم الحي ل PBMCs الصحية لتصنيع منتج الخلايا التائية المعدلة جينيا في ظل ظروف متوافقة مع GMP. يتضمن البروتوكول استخدام ناقل عدسي فيروسي ، والذي يمكن الاستعانة بمصادر خارجية لشركة إنتاج فيروسي توفر جميع الاختبارات الكمية / الوظيفية والنقاء والسلامة اللازمة (على سبيل المثال ، العيار الفيروسي ، والكشف عن الفيروس العدسي المختص بتكرار الحمض النووي للخلية المضيفة). بالنسبة لهذه الدراسة ، فإن الناقل المستخدم هو ناقل فيروسي عدسي من الجيل الثاني قائم على VSV-g (بروتين فيروس التهاب الفم الحويصلي G) مع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، باعتباره الجين محل الاهتمام ، في التعبير التأسيسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة باتراس ومجلس المراجعة المؤسسية للمستشفى العام الجامعي في باتراس. قبل الحصول على العينات البيولوجية ، تم الحصول على الموافقة المستنيرة من الأفراد الأصحاء. تم إجراء تقييم أهلية المشاركين وفقا للإجراءات المؤسسية وبما يتوافق مع معايير JACIE لفصادة الكريات البيض. إذا كان سيتم تنفيذ هذا البروتوكول في إعداد ACT السريري ، فيجب أن تلتزم جميع الإجراءات بإرشادات ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) وأن يتم تنفيذها في غرف نظيفة متوافقة مع GMP. ومن الضروري اتخاذ احتياطات أمان خاصة عند العمل مع النواقل الفيروسية، وينبغي تنفيذ هذه الإجراءات داخل خزانة مخصصة للسلامة الأحيائية. في هذه الدراسة ، تم إجراء الإجراءات الموصوفة داخل محطة H35 HEPA Hypoxystation التي تم التحقق من صحتها (انظر جدول المواد) لضمان بيئة خاضعة للرقابة والمراقبة. يجب أن يتم تطهير جميع السوائل الخطرة باستخدام محلول تبييض 10٪.

1. عزل PBMC وتنشيط الخلايا التائية (اليوم 0)

  1. اجمع الخلايا من كيس الفصادة المانحة (leukopaks ، انظر جدول المواد) في أنابيب سعة 50 مل ، اعتمادا على الحجم الأولي.
  2. قم بإجراء غسلتين من كيس الخلية عن طريق غرس 15 مل من الوسائط المكونة للدم الكاملة (+5٪ HSA ، وسائط مكونة للدم تجارية خالية من المصل ، انظر جدول المواد).
  3. إجراء الطرد المركزي المتدرج للكثافة القائم على السكريات عند تخفيف 1: 2 (الكاشف: عينة). جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع فترات راحة (A / D ، 9/0).
  4. باستخدام ماصة صغيرة ، اجمع PBMCs في أنبوب نظيف سعة 50 مل.
  5. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1x PBS ، وملء ما يصل إلى 50 مل لكل غسلة (400 × جم ، 10 دقائق ، درجة حرارة الغرفة). أعد تعليق الخلايا في 5 مل من الوسائط الكاملة.
  6. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق باستخدام مقياس الدم القياسي أو عداد الخلايا الآلي (انظر جدول المواد).
  7. تمييع الخلايا مع وسائط كاملة لتحقيق تركيز 2 × 106 خلايا / مل.
  8. قم بتنشيط 20 × 106 PBMCs عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من كاشف تحفيز الخلايا التائية (انظر جدول المواد) لكل 2 × 106 خلايا بدء.
    ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لتنشيط 20 × 106 PBMCs ولكن يمكن ضبطه لأرقام الخلايا الأكبر حسب الحاجة.
  9. أضف rhIL-2 (20 وحدة / مل) (انظر جدول المواد) ، واخلطه برفق ، وانقل الخليط إلى وعاء مناسب (على سبيل المثال ، لوحة ذات 6 آبار).
  10. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة.

2. نقل الخلايا التائية الفيروسية (اليوم 3)

  1. نقل ثقافة الخلية إلى وعاء مناسب ، مثل أنبوب مخروطي 50 مل. تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لإزالة كاشف التنشيط. تخلص بعناية من المادة الطافية تماما وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسط الكامل.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، من الممكن إذابة الفيروس على الجليد.
  2. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق.
  3. أعد تعليق الخلايا في وسط كامل لتحقيق تركيز يسمح بطلاء 0.5 × 106 خلايا بحجم إجمالي قدره 400 ميكرولتر لكل بئر في لوحة 24 بئرا. أضف rhIL-7 (155 وحدة / مل) و rhIL-15 (290 وحدة / مل) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تأكد من حساب حجم الفيروسات المراد إضافتها. راجع الخطوة 2.4.
  4. في أنبوب منفصل ، أضف Vectofusin-1 (انظر جدول المواد) إلى وسط Opti-MEM بتركيز 10 ميكروغرام / مل ، مع حجم يساوي الحجم الفيروسي المراد استخدامه.
    ملاحظة: ضع في اعتبارك الحجم الكلي لثقافة الخلية عند حساب تركيز Vectofusin-1. راجع الخطوة 2.3. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Vectofusin-1 GMP ككاشف من درجة GMP.
  5. يمزج الفيروس المركز عند تعدد العدوى (MOI) من 40 مع خليط Vectofusin-1 / Opti-MEM (نسبة 1: 1) ويخلط جيدا. أضف هذا الخليط إلى ثقافة الخلية واضبط الحجم الكلي إلى 400 ميكرولتر لكل بئر باستخدام وسيط كامل ، إذا لزم الأمر.
  6. ضع الغطاء على اللوحة ، وأغلقها بغشاء البارافين ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 2 ساعة عند 32 درجة مئوية. بعد ذلك ، احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.

3. إزالة الفيروس وتوسيع الخلايا التائية (اليوم 4)

  1. اجمع الخلايا وجمعها في وعاء مناسب ، مثل أنبوب سعة 50 مل.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 × غرام في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية تماما بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسائط الكاملة.
  3. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق. أعد تعليق الخلايا في وسائط كاملة بتركيز 1 × 106 خلايا / مل. أضف rhIL-7 (155 وحدة / مل) و rhIL-15 (290 وحدة / مل) (انظر جدول المواد).
  4. نقل الخلايا إلى وعاء مناسب ، مثل قارورة T25 ، بتركيز 0.3-0.5 × 106 خلايا / سم2 واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، لمدة يومين.
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى عدد أكبر من الخلايا ، فيمكن زراعة الخلايا (1: 2) في وجود rhIL7 و rhIL-15 كل يومين ، باتباع نفس ظروف الحضانة المذكورة أعلاه ، حتى يتم تحقيق أعداد الخلايا المطلوبة.

4. الحفظ بالتبريد (اليوم 14)

ملاحظة: سيطلب من الثلج نقل المبردات إلى موقع التخزين خلال هذه الخطوة. يعتمد توقيت الحفظ بالتبريد على أرقام الخلايا المطلوبة. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتم إجراء الحفظ بالتبريد في اليوم 14 بعد تحقيق توسع بمقدار 25 ضعفا.

  1. بمجرد الوصول إلى رقم الخلية المطلوب ، قم بحصاد الخلايا ونقلها إلى أنابيب سعة 50 مل (اضبط عدد الأنابيب بناء على الحجم الكلي).
  2. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 400 × غرام في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية تماما بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من الوسائط. إذا لزم الأمر ، قم بتجميع الخلايا من أنابيب متعددة.
  3. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق. احتفظ بقسمة من 1 × 106 خلايا لكل اختبار لمراقبة الجودة (راجع القسم 5) لتقييم رقم نسخة المتجه وكفاءة النقل.
  4. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 400 × غرام لمدة 10 دقائق في RT. في هذه المرحلة ، قم بتسمية cryovials وفقا لذلك.
  5. قم بإزالة المادة الطافية تماما وأعد تعليق الحبيبات في محلول الحفظ بالتبريد الذي يتكون من 50٪ HSA و 40٪ HBSS بتركيز 1 × 107 خلايا لكل مل لكل تبريد. انقل معلق الخلية إلى العدد المناسب من cryovials وأضف 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى كل cryovial.
  6. ضع المبردات على الثلج وانقلها على الفور إلى مجمد معدل متحكم فيه للحفظ بالتبريد. بعد الحفظ بالتبريد ، انقل المبردات إلى خزان نيتروجين سائل مراقب للتخزين طويل الأجل.

5. مراقبة الجودة (اليوم 14)

ملاحظة: لاختبار الإطلاق ، خضع المنتج لعدة اختبارات ، بما في ذلك اختبارات العقم لنمو الميكروبات ، وتقييم مستوى السموم الداخلية. أجريت هذه الاختبارات في مختبرات معتمدة في مستشفى جامعة باتراس العام وجامعة باتراس. تم تحديد وجود الميكوبلازما داخليا باستخدام مقايسة الكشف الكيميائي الحيوي وقياسها على مقياس الإنارة باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). تم تقييم النمط الظاهري للخلية (الشكل 1) بالإضافة إلى عدد الخلايا وصلاحيتها داخليا عن طريق قياس التدفق الخلوي (انظر القسم 5.1) وعداد الخلية الآلي (انظر جدول المواد) ، على التوالي. تم وضع معايير الإطلاق بناء على البيانات المنشورة والتوصيات10,11 لمنتجات الخلايا المنتجة من GMP (الجدول 1).

  1. إجراء تلطيخ قياس التدفق الخلوي بكفاءة النقل (اليوم 14)
    ملاحظة: سيتم تلطيخ حصة من 1 × 106 خلايا من أجل الصلاحية (7-AAD) وعلامة CD32 لتقييم كفاءة النقل (انظر جدول المواد). إذا كان الجين محل الاهتمام ، كما هو الحال في خلايا CAR T ، يحتاج إلى اكتشاف ، فيجب أن يكون الجسم المضاد المحدد بلون مختلف عن لون علامة CD3 و 7-AAD لتجنب التعويض. يجب أن تؤخذ عينات التحكم المناسبة في الاعتبار.
    1. ضع العينة في أنبوب FACS وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
    2. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 400 × جم في RT لمدة 5 دقائق.
    3. تخلص تماما من المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحبيبات في محلول مخفف بنسبة 1: 5 من المخزن المؤقت CD3: FACS (انظر جدول المواد).
    4. دوامة العينة واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
    5. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. أجهزة الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق (RT).
    6. تخلص تماما من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في محلول مخفف 1:20 من المخزن المؤقت 7-AAD: FACS (انظر جدول المواد).
    7. دوامة العينة واحتضانها لمدة 10 دقائق على الجليد في الظلام.
    8. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وقم بتحليل العينة باستخدام مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تقييم كفاءة النقل
تم تقييم الخلايا المحولة للتعبير عن الجين محل الاهتمام (GFP) باستخدام قياس التدفق الخلوي. النتائج التمثيلية موضحة في الشكل 1. في اليوم 14 ، كان أكثر من 95٪ من الخلايا CD3 + ، مما يشير إلى نجاح تنشيط الخلايا التائية وتوسعها. تم قياس كفاءة النقل داخل مجتمع CD3 + بنسبة 58.7٪ (TD ، الشكل 1C) مقارنة بالخلايا غير المحولة (UNTD ، الشكل 1B) التي أظهرت كفاءة نقل بنسبة 0.5...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعتبر ناقلات الفيروسات العدسية كمركبات لتوصيل الجينات أدوات مهمة في مجال العلاج بالخلايا والجينات بسبب قدرتها على تحويل كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة12. ومع ذلك ، لا يزال الإنتاج الواسع النطاق للنواقل الفيروسية العدسية باستخدام طرق متوافقة مع GMP يمثل تحديا بسبب المعلمات المختلفة ، مثل طرق النقل وخطوات التنقية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى تباين في دفعات الفيروس العدسي. غالبا ما تحصل المراكز الأكاديمية على مخزونات فيروسية من شركات التكنولوجيا الحيوية للإنتاج الفيروسي ، والتي توفر وثائق حول وظائف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

طور ن. س. البروتوكول وكتب المخطوطة التي راجعها وأشرف عليها أ. س. أجرى K.S.، G.A. تجارب إضافية. قدم D.K.، M.L. دعما قيما في التجارب وجنبا إلى جنب مع V.Z.، N.T. في عملية المراجعة. N.T. هي عضو في ProtATonce المحدودة. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا البحث من قبل الاتحاد الأوروبي والصناديق الوطنية اليونانية من خلال البرنامج التشغيلي للقدرة التنافسية وريادة الأعمال والابتكار ، تحت دعوة RESEARCH - CREATE - INNOVATE (رمز المشروع: T2EDK - 00474). نود أيضا أن نعرب عن امتناننا لمؤسسة Choose Life لتقديم الدعم المستمر لمختبر GMP "ديميتريس لويس" التابع لمعهد العلاج الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
24 بئر TC المعالجة لوحةCorning353047
5 مل أنبوب FACS  كورنينج352054
50 مل أنابيب فالكونGreiner biomedica227261
لوحة معالجة ب TC 6 آبارCorning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
Cell Counter   ؛كورنينج سيل سيتوسمارتJ21E0081
CryovialsGreiner biomedica122263
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD2438
Dulbecco s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (D-PBS)Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS ، 0.5٪ BSA ، 2 ملي مولار EDTA)-
برنامج FlowJo v10.6.2 & nbsp ؛TreeStarInc-Gibco
CTS Opti-MEM I متوسطThermoFisher ScientificA4124801
GMP rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
هانكس s محلول الملح المتوازن (HBSS)Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 HypoxystationDon Whitley ScientificHA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)BaxterB05AA01
Junior LB 9509 مقياس الإضاءة المحمولBerthold Technologies6506
Lenti-X Provirus Quantitation KitTakara Bio631239
تقنيات الخلايا الجذعيةالليمفاوية7811
MACS GMP الخلايا التائية TransactMiltenyi Biotec170-076-156
Mouse Anti-Human   CD3 (استنساخ: UCHT-1)BD Biosciences557706
MycoAlert Plus DetectionKit Lonza BioscienceLT07-703
Parafilm شريط إغلاق فائق التوسيع 5 سم × 75 مD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB (كيس فصادة)جهازBiomed SC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 قواريرGreiner biomedica658175
Trypan blue ، محلول 0.4٪InvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVOTM 15 خلية مكونة للدم خالية من المصل متوسطةلونزا بيوساينسA1048501

المراجع

  1. Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
  2. Brentjens, R., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).
  3. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  4. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  5. Schuster, S. J., et al. Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas. Blood. 126 (23), 183(2015).
  6. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  7. Wang, X., Rivière, I. Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy. Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).
  8. Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting. Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).
  9. Kaiser, A. D., et al. Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy. Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).
  10. Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells. European Medicines Agency. , EMA/CAT/GTWP/671639/2008 Rev. 1 - corr., Committee for Advanced Therapies (CAT) (2020).
  11. Castella, M., et al. Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial. Frontiers in Immunology. 11, 482(2020).
  12. Naldini, L. Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells. Current Opinion in Biotechnology. 9 (5), 457-463 (1998).
  13. Ausubel, L. J., et al. Production of CGMP-grade lentiviral vectors. Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).
  14. Van der Loo, J. C. M., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R42-R52 (2016).
  15. Rad, S. M. A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells. PLoS One. 15 (7), e0232915(2020).
  16. Sandrin, V., et al. Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates. Blood. 100 (3), 823-832 (2002).
  17. Costello, E., et al. Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors. Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).
  18. Radek, C., et al. Vectofusin-1 improves transduction of primary human cells with diverse retroviral and lentiviral pseudotypes, enabling robust, automated closed-system manufacturing. Hum Gene Therapy. 30 (12), 1477-1493 (2019).
  19. Hanenberg, H., et al. Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells. Nature Medicine. 2 (8), 876-882 (1996).
  20. Lamers, C. H. J., et al. Retronectin-assisted retroviral transduction of primary human T lymphocytes under good manufacturing practice conditions: tissue culture bag critically determines cell yield. Cytotherapy. 10 (4), 406-416 (2008).
  21. O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).
  22. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  23. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  24. Ghassemi, S., et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).
  25. Wang, R. -N., et al. Optimized protocols for γδ T cell expansion and lentiviral transduction. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1471-1480 (2019).
  26. Yuan, W., et al. Comparative analysis and optimization of protocols for producing recombinant lentivirus carrying the anti-Her2 chimeric antigen receptor gene. The Journal of Gene Medicine. 20 (7-8), e3027(2018).
  27. Zhu, F., et al. Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T cells using the CliniMACS Prodigy device at an academic medical center. Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).
  28. Mock, U., et al. Automated manufacturing of chimeric antigen receptor T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy. Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

العلاج الخلوي التبنييخلايا CAR Tالتنحي اللينتي الفيروسيتنشيط الخلايا التائيةقياس التدفق الخلويعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطيمحلول الحفظ بالتجميدالأورام الدموية الخبيثة
إجراء متوافق مع GMP لتوليد الخلايا التائية المعدلة جينيا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.