مقالة منهجية

Ferritinophagy: تقييم التدهور الانتقائي للحديد عن طريق الالتهام الذاتي في الخلايا الليفية البشرية

2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65110

⸱

فبراير 23, 2024

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لإجراء تقييمات عالية الإنتاجية للفيريتينوفاجي القائمة على التألق المناعي في الخلايا الليفية البشرية الأولية المشتقة من الجلد.

الملخص

الطفرات في جين الالتهام الذاتي WDR45 / WIPI4 هي سبب التنكس العصبي المرتبط بمروحة بيتا (BPAN) ، وهو نوع فرعي من الأمراض البشرية يعرف باسم التنكس العصبي مع تراكم الحديد في الدماغ (NBIA) بسبب وجود رواسب الحديد في أدمغة المرضى. يتم تنظيم مستويات الحديد داخل الخلايا بإحكام من خلال عدد من الآليات الخلوية ، بما في ذلك الآلية الحرجة للفيريتينوفاجي. تصف هذه الورقة كيف يمكن تقييم الفيريتينو فاجي في الخلايا الليفية البشرية الأولية المشتقة من الجلد. في هذا البروتوكول ، نستخدم ظروف تعديل الحديد لتحفيز أو تثبيط الفيريتينوفاجي على المستوى الخلوي ، مثل إعطاء بافيلوميسين A1 لتثبيط وظيفة الليزوزوم وسترات الأمونيوم الحديديك (FAC) أو علاجات ديفيراسيوكس (DFX) لزيادة أو استنفاد الحديد ، على التوالي. ثم تخضع هذه الخلايا الليفية المعالجة للتصوير عالي الإنتاجية وتحليل التوطين الكمي القائم على CellProfiler للفيريتين الداخلي وعلامات البلعمة الذاتية / الليزوزومية ، هنا LAMP2. بناء على مستوى الفيريتين البلعمي الذاتي / الليزوزومي ، يمكن استخلاص استنتاجات بشأن مستوى الفيريتينوفاجي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم الفيريتينوفاجي في الخلايا الليفية الأولية المشتقة من BPAN أو أنواع أخرى من خلايا الثدييات.

المقدمة

بروتينات WIPI (WD-repeat التي تتفاعل مع الفوسفوينوسيتيدس) هي مستجيبات PI3P محفوظة تطوريا مع أدوار مميزة في الالتهام الذاتي1. تطوى بروتينات WIPI البشرية الأربعة (WIPI1 إلى WIPI4) إلى مراوح β ذات سبع شفرات مع منطقتين محفوظتين تطوريا تتجمع فيهما الأحماض الأمينية المتماثلة والثابتة في مواقع متقابلة من المروحة. يتم محاذاة موقع واحد مع منطقة ربط الفوسفوينوسيتيد في شفرة المروحة 5 والشفرة 6. يتماشى الموقع الآخر مع منطقة تفاعل البروتين والبروتين حيث ترتبط WIPIs بأعضاء متميزين من آلية الالتهام الذاتي أو العوامل التنظيميةللالتهام الذاتي 2.

يعمل WIPI4 في التحكم في تنظيم الالتهام الذاتي المدفوع بالطاقة وعلى مستوى التحكم في حجم البلعمة الذاتية الوليدةالمتنامية 3. طفرة في جين WIPI4 ، يشار إليها باسم WDR45 ، هي سبب للتنكس العصبي المرتبط بمروحة بيتا (BPAN) ، وهو تنكس عصبي مع تراكم الحديد في الدماغ (NBIA) في المرضى من البشر والذي يتميز بهالة حديد منخفضة الكثافة في المادة السوداء والكرة الشاحبة4. يؤدي وجود رواسب حديدية غير طبيعية في مرضى BPAN إلى تلف الخلايا العصبية التي تترجم إلى اعتلال دماغي ، وتأخر في النمو العالمي ، ونوبات ، وفي النهاية ، باركنسون ، والخرف ، والتشنج5.

يتم تنظيم توازن الحديد بإحكام بواسطة آليات خلوية متعددة ، مع التحكم في تركيز الحديد الخلوي من خلال مستويات التعبير ووظائف ناقلات الحديد وناقلات الحديد وبروتينات تخزين الحديد6 . تركيز الحديد الخلوي ، بدوره ، يحدد ما إذا كانت مسارات التحلل مثل ferritinophagy7 أو إزالة البروتيازوم من الفيريتينالمؤكسد 8 متورطة.

أثناء الفيريتينوفاجي ، يتم تجنيد الفيريتين بشكل انتقائي إلى البلعمة الذاتية بواسطة مستقبلات البضائع NCOA4 ويستهدف التحلل الليزوزومي استجابة لانخفاض مستويات الحديد داخل الخلايا7. بالنظر إلى دور WIPI4 في تنظيم حجم الأغشية البلعميةالذاتية 3 ، فمن المعقول التنبؤ بأن فقدان هذه الوظيفة المحددة قد يؤثر على العزل الانتقائي للفيريتين في البلعمة الذاتية ، وبالتالي ، ferritinophagy. دراسة هذه الخطوة الرئيسية في استقلاب الحديد قد تفتح الأبواب أمام الخيارات العلاجية لمرضى BPAN. ومع ذلك ، يتم الآن فقط تطوير بروتوكولات شائعة الاستخدام لدراسة ferritinophagy في الخلايا البشرية.

تصف هذه الورقة طريقة عالية الإنتاجية قائمة على التألق لتقييم الفيريتينوفاجي في الخلايا البشرية. يمكن أن يوفر تطبيق هذا الفحص على خلايا BPAN المشتقة من المريض نظرة ثاقبة قيمة حول كيفية اختلاف ferritinophagy مقارنة بالخلايا البشرية السليمة وقد يكون بمثابة معيار لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا المرض البشري النادر.

البروتوكول

1. زراعة وبذر الخلايا الأولية

  1. أحضر القارورة مع الخلايا المجمدة من خزان النيتروجين السائل ، واحتفظ بها على الجليد حتى تصل إلى غرفة زراعة الخلايا. في غطاء معقم مسبقا ، أمسك القارورة في اليد حتى يذوب تعليق الخلية. أعد تعليق الخلايا ، وانقلها إلى صفيحة زراعة خلايا 10 سم مع 9 مل من DMEM المسخن مسبقا مع مصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (FCS) و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (P / S). رج العبوة برفق حتى تتوزع الخلايا بالتساوي على الطبق ، واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2
  2. في صباح اليوم التالي ، انظر إلى الخلايا للتأكد من أنها متصلة. قم بتغيير الوسط إلى DMEM الطازج + 10٪ FCS + 1٪ P / S ، واترك الخلايا تنمو حتى تصل إلى التقاء 80٪.
  3. قم بإزالة وسط الاستزراع ، واغسل 2x باستخدام DPBS ، وأضف 1 مل من التربسين إلى الطبق ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق. أضف 9 مل من DMEM + 10٪ FCS إلى اللوحة ، وأعد تعليق الخلايا.
  4. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. حدد عدد الخلايا يدويا باستخدام غرفة Neubauer ، وقم بتخفيف تعليق الخلية في DMEM + 10٪ FCS حتى يتم تحقيق تركيز خلية يبلغ 40000 خلية / مل.
  5. في صفيحة زجاجية القاع 96 بئر ، بذرة 100 ميكرولتر / بئر من تعليق الخلية. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 لمدة 16 ساعة.

2. العلاجات

  1. قم بإعداد المعالجات التالية وفقا لجدول المواد: وسط التحكم ، وسيط التحكم بالإضافة إلى deferasiox (DFX) لاستخلاب الحديد ، أو وسيط التحكم بالإضافة إلى سترات الأمونيوم الحديديك (FAC) لتحميل الحديد. تحضير جميع العلاجات في كل من وجود وغياب مثبط الليزوزومات (بافيلوميسين A1) لتقييم تدفق ferritinophagy.
  2. قم بإزالة وسط الاستزراع من اللوحة ، واستبدله بالمعالجة المقابلة (100 ميكرولتر / بئر).
  3. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 لمدة 6 ساعات.

3. التثبيت والتلوين

  1. نضح وسط العلاج ، واغسل 2x باستخدام DPBS (جدول المواد).
  2. أضف 100 ميكرولتر من 3.7٪ بارافورمالدهيد (PFA ، جدول المواد) لكل بئر. ثبت الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  3. قم بإزالة PFA ، واغسل الخلايا 2x باستخدام PBS / T (جدول المواد).
  4. كتلة في PBS / T تحتوي على 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  5. تحضير مزيج الجسم المضاد الأساسي (جدول المواد) في PBS / T (الجسم المضاد للفيريتين 1:50 ، الجسم المضاد LAMP2 1:50).
  6. اغسل الخلايا 2x باستخدام PBS / T ، وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لكل بئر. لف الأطباق بالبارافيلم واحتضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  7. في صباح اليوم التالي ، قم بإعداد مزيج الجسم المضاد الثانوي (جدول المواد) (1: 200) في PBS / T.
  8. اغسل الخلايا 2x باستخدام PBS / T ، وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوي لكل بئر. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الظلام.
  9. تحضير محلول 5 ميكروغرام / ميكرولتر 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI ، جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة.
  10. اغسل الخلايا 2x باستخدام PBS / T ، وأضف 100 ميكرولتر / بئر من بقعة DAPI. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  11. اغسل الخلايا 2x باستخدام PBS ، وأضف 50 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر. لف الأطباق بالبارافيلم ، واحفظها على حرارة 4 درجات مئوية في الظلام.

4. التصوير الآلي باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر

  1. استبدل PBS في اللوحة ب 50 ميكرولتر من PBS الطازج في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم واصطحبها إلى غرفة الفحص المجهري.
  3. قم بتشغيل مجهر المسح بالليزر متحد البؤر ، واضبط حامل عينة لألواح 96 بئرا على طاولة المجهر ، وحدد هدفا مناسبا (هنا: 40x). راجع الجدول 1 للحصول على التفاصيل.
  4. اضبط إعدادات التصوير (الجدول 1).
    1. في الإعداد الذكي، حدد الليزر والمرشحات، وقم بتعيينها إلى المسارات (المسارات 1-3) للحصول على أفضل جودة للصورة وسرعتها (الجدول 1).
    2. عند تحديد نوع التجربة ، انقر فوق البلاط لتمكين خيار تحديد وحفظ مواضع X و Y المحددة على اللوحة.
    3. في وحدة إعداد التصوير ، تصور قنوات الاستحواذ ، والمسارات المخصصة لها ، والأطوال الموجية للإثارة والانبعاث (الجدول 1).
    4. في وحدة وضع الاستحواذ، حدد ما يلي: سرعة المسح الضوئي: 6; الاتجاه: ثنائي الاتجاه. المتوسط: 2x; بت لكل بكسل: 8.
    5. في وحدة القنوات ، اضبط طاقة الليزر والثقب والكسب الرئيسي لكل قناة على حدة (الجدول 2). قم بضبط هذه المعلمات للحصول على صور معرضة بشكل صحيح دون الإفراط في تشبعها.
    6. انقر فوق وحدة استراتيجية التركيز .
      1. حدد الجمع بين التركيز البؤري التلقائي للبرنامج والتركيز المحدد.
      2. ضمن القناة المرجعية والإزاحة، حدد القناة الأكثر استقرارا/سطوعا كمرجع (عادة DAPI أو 488 نانومتر).
      3. ضمن تكرار حدث التثبيت وتكراره، حدد قياسي.
    7. في الوحدة النمطية للتركيز البؤري التلقائي للبرامج ، حدد ما يلي: الوضع | قوة; البحث | ذكي; أخذ العينات | غرامة; النطاق النسبي.
    8. انقر فوق وحدة البلاط .
      1. حدد المناصب | وظائف فردية.
      2. ضمن إعداد متقدم ، انتقل عبر اللوحة ، وحدد موضع التصوير ، وانقر فوق الزر + أسفل علامة التبويب إعداد الموضع .
      3. قم بتسمية كل موضع بمعلومات إضافية سيتم تسجيلها على البيانات الوصفية للصورة. للقيام بذلك ، افتح علامة التبويب خصائص ، وانقر فوق رمز العجلة بجوار القائمة المنسدلة الفئة ، وانقر فوق جديد لفتح مربع حوار جديد حيث سيتم إدخال اسم الفئة الجديدة . لتعيين فئة لموضع معين ، حدد الموضع ، وانقر فوق علامة التبويب خصائص ، وانتقل إلى القائمة المنسدلة الفئات ، وحدد التسمية المقابلة.
        ملاحظة: يوصى بإنشاء فئة لكل علاج لتسمية كل موضع بالعلاج الذي تعرضت له الخلايا.
      4. ضمن نموذج الناقل، حدد القاع الزجاجي Multiwell 96-Cellvis #0. انقر فوق معايرة لمعايرة المجهر على سطح اللوحة. اختر بين معايرة 1 نقطة أو 7 نقاط حسب مواصفات النظام.
      5. ضمن خيارات، حدد تداخل تجانب بنسبة 10٪. ضمن السفر في مناطق التجانب، حدد تحرير ونسخ. حدد ما يلي: استخدم سرعة المرحلة من التحكم في المرحلة ، واستخدم تسريع المرحلة من التحكم في المرحلة ، وهرم الصورة أثناء الاستحواذ.
  5. قم بتشغيل الحصول على الصور ، واحفظ نتائج الصور (ملفات czi) والبيانات الوصفية للصورة (ملفات csv) على محرك أقراص ثابت محمول.
  6. تصدير الصور كملفات TIFF.

5. تحليل الصور عالية الإنتاجية

  1. قم بإنشاء ملف جدول بيانات بيانات تعريف منفصل باستخدام الأعمدة التالية: الموضع والبئر والشرط والسلسلة والتعيين. يتم استرداد البيانات المناسبة لملء هذه الأعمدة من ملف البيانات الوصفية الأصلي الذي يأتي من الفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر.
  2. قم بتنزيل البرنامج مفتوح المصدر CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases).
  3. قم بتشغيل CellProfiler 4.2.4 بالنقر المزدوج ، وقم باستيراد خط أنابيب CellProfiler (الملف التكميلي 1) عن طريق السحب والإفلات.
    ملاحظة: ابحث أدناه عن خطوات تجميع خط أنابيب CellProfiler (الملف التكميلي 1) للتعرف الآلي على الخلايا الليفية باستخدام تلطيخ DAPI (الوحدة 1 ، التعرف على النوى ، انظر الجدول 2) ومضان الخلفية في الخلايا المفردة المشتقة من AF488 (الوحدة 2 ، التعرف على الخلايا ، انظر الجدول 2). يتم تحديد التعرف على Puncta (الكائنات المسماة) من خلال حجم puncta وشدة مضان puncta على الخلفية (الوحدة 3 ، التعرف على puncta ، انظر الجدول 2). أخيرا ، وفقا لحدود الخلايا ، يتم تعيين النقاط التي يتعرف عليها البرنامج للخلايا المقابلة (تعيين العلاقات). تم نشر وصف تفصيلي لكيفية تنفيذ خط أنابيب CellProfiler لدراسات الالتهام الذاتيسابقا 9. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي الجدول 2 على إعدادات CellProfiler المستخدمة في هذه الدراسة. علاوة على ذلك ، يعرض الملف التكميلي 2 خط أنابيب CellProfiler (الملف التكميلي 1) مع لقطات شاشة تم التقاطها بترتيب متتالي والإشارة إلى الوحدات المفصلة في الجدول 2.
  4. قبل تكييف خط أنابيب CellProfiler (الملف التكميلي 1)، قم بسحب وإفلات ملفات صور .czi فردية أو مجلد يحتوي على ملفات صور .czi متعددة إلى وحدة الصورة .
  5. تخصيص خط أنابيب التعرف على الصور. في وحدة الأسماء والأنواع ، استبدل رمز c1-c3 برمز يسمح للبرنامج بتحديد وفرز الصور أحادية القناة المراد تحليلها.
  6. قم بضبط إعدادات خط الأنابيب للوحدتين النمطيتين IdentifyPrimaryObjects و IdentifySecondaryObjects عن طريق تحسين الإدخالات الرقمية في الوحدات النمطية. يتم عرض القيم المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 2.
  7. لتتبع التعديلات ، حدد خيار وضع الاختبار بالنقر فوق الزر "بدء وضع الاختبار ". ثم انقر فوق ملف خطوة زر بين الوحدات. انتظر النوافذ المنبثقة (صورة الإدخال الأصلية ، ومخططات التعرف المرسومة فوق الصورة الأصلية ، ونتائج التحليل) التي توضح كيفية تحليل الصورة بالإعدادات التي تم إدخالها للتو.
  8. بمجرد تحسين خط الأنابيب ، قم بإنهاء وضع الاختبار. قم بإجراء التحليل عن طريق تنشيط وضع اختبار الخروج ، متبوعا بالنقر فوق الزر "تحليل الصور ".
  9. بعد اكتمال التحليل ، تحقق من دقة اكتشاف الخلية والنقاط من خلال مقارنة الصور المدخلة بمخرجات التراكب (حدود الخلية ، النقط) التي تم إنشاؤها بواسطة CellProfiler. إذا لم تكن مرضية ، اضبط القيم العددية في الوحدات المختلفة (الجدول 2) حتى تكون نتيجة التحليل دقيقة بما فيه الكفاية.

6. تحليل البيانات

  1. بعد إجراء التحليل ، انتظر حتى يقوم البرنامج بإنشاء مجموعة من الملفات النصية المجدولة بالنتائج. في حالة استخدام خط أنابيب CellProfiler المتوفر (الملف التكميلي 1)، ابحث عن ملفات الإخراج التالية:
    1. ملف CellProfilerOutputCells ، الذي يسرد رقم الصورة المعين بواسطة البرنامج ، ورقم الخلية المعين للخلايا المفردة ، واسم الملف الأصلي ، والمسار الذي يشير إلى مكان تخزين الملفات ، وعدد النقاط (ferritin ، LAMP2) لكل خلية ، ومتوسط منطقة النقاط (ferritin ، LAMP2) لكل خلية.
    2. ملف CellProfilerOutputExperiment ، الذي يوفر معلومات حول التفاصيل الفنية المتعلقة بالتجربة (على سبيل المثال ، إصدار البرنامج ، وقنوات الصورة ، وعلامات البيانات الوصفية).
  2. افتح هذه الملفات كجداول بيانات.
  3. المضي قدما في إجراء التحليل الإحصائي لأعداد النقاط وأرقام التوطين المشترك للنقاط باستخدام برنامج الإحصاء المفضل (جدول المواد).

النتائج

تم تحضير الخلايا الليفية الأولية المشتقة من جلد الإنسان (F-CO-60) من متبرعين أصحاء (الشكل 1 أ) لتقييم الفيريتينو فاجي باستخدام علاج بافلوميسين A1 متبوعا بالتلوين المناعي للفيريتين الداخلي و LAMP2 ، وتحليل الصور الآلي ، والتحليل القائم على CellProfiler (الشكل 1 ب).

زاد التمركز المشترك للفيريتين الداخلي و LAMP2 بعد أن تم حظر التدهور الليزوزومي للفيريتين عن طريق إضافة بافيلوميسين A1 ، بما يتفق مع قدرته على تثبيط إنزيمات V-ATPase الليزوزومية ، وبالتالي منع الفيريتينوفاجي7 (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض التعرف على الخلايا القائم على البرامج ، وكذلك التعرف على الفيريتين و LAMP2 ، كمثال (الشكل 2).

في هذا الصدد ، تجدر الإشارة إلى أن خط أنابيب CellProfiler الموضح هنا متعدد الاستخدامات للغاية ويمكن تكييفه مع قراءات إضافية و / أو بديلة ، مثل تقييم آثار بعض طفرات BPAN على نمو الخلايا أو الميتوكوندريا أو العضيات الأخرى في سياق أنظمة علامات الخلية المفردة الوظيفية.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة تجريبية. تمثيل رسومي ل (أ) عملية الفيريتينوفاجي و (ب) سير العمل التجريبي لتقييم الفيريتينوفاجي في الخلايا الليفية البشرية الأولية المشتقة من الجلد ، كما هو موضح في هذا البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الصور التمثيلية. خضعت الخلايا الليفية البشرية الأولية المشتقة من الجلد في وسط التحكم (ظروف التغذية) في غياب (A) أو (B) وجود بافيلوميسين A1 لتحليل التألق المناعي غير المباشر باستخدام الأجسام المضادة المضادة للفيريتين والمضادة ل LAMP2 ، بينما تم تلطيخ نوى الخلية ب DAPI. يتم عرض صور مضان نموذجية تم الحصول عليها باستخدام أتمتة الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (قضبان المقياس: 10 ميكرومتر). يمكن ملاحظة التغيرات في وفرة الفيريتين و LAMP2 والتمركز المشترك عند تثبيط الليزوزومات عند إعطاء بافيلوميسين A1. يتم أيضا عرض التحليل المستند إلى CellProfiler ، والذي يعرض تراكبات الصور المشتقة من البرامج للتعرف على الخلايا (أرجواني) ، ونوى (أزرق) ، وفيريتين (أخضر) ، و LAMP2 (أحمر) ، وتوطين مشترك ferritin / LAMP2 (أصفر) punكتا. (C) مقاطع الصورة المكبرة (شريط المقياس = 10 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: إعدادات الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: إعدادات CellProfiler العددية المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: خط أنابيب CellProfiler المستخدم في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: عرض خط أنابيب CellProfiler (انظر الملف التكميلي 1) مع لقطات شاشة تم التقاطها بترتيب متتالي (انظر الجدول 2). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تم تصميم هذه الطريقة ، التي تستخدم الفحص المجهري الفلوري الآلي جنبا إلى جنب مع تحليل الصور المستند إلى CellProfiler9 للوصول المفتوح لتقييم التوطين داخل الخلايا لعوامل ferritinophagy الرئيسية ، لتوفير معلومات قيمة حول فعالية تصفية الفيريتين الليزوزومية عن طريق الالتهام الذاتي الانتقائي ، المشار إليه باسم ferritinophagy7. يتيح هذا البروتوكول التعامل مع مجموعات العينات الكبيرة ذات خطوط الخلايا المتعددة والعلاجات في وقت واحد وتقييم القراءات المرغوبة ، مثل أرقام الفيريتين المثقوبة وأرقام الفيريتين المنقطة التي تتزامن مع LAMP2 ، وهي علامة ليزوزومية نموذجية لتقييم تدفق الفيريتينوفاجي. ومع ذلك ، يجب التأكيد هنا على أن تحليل الصور الدقيق والآلي يعتمد على جودة الصورة ، والتي بدورها تعتمد على خصوصية الأجسام المضادة والتصوير الأمثل. لذلك ، يجب إجراء تحليل الصور المستند إلى البرامج فقط باستخدام صور عالية الجودة.

يمكن أن يوفر تعديل مستويات الحديد في الخلايا معلومات قيمة عن الآليات التي يتم تنشيطها لتنظيم الاتزان الداخلي للحديد في سياق المرض. تصف هذه الورقة طريقة لدراسة أمراض BPAN في الخلايا المشتقة من المريض والمعالجة بعوامل تحميل الحديد ومخلب الحديد. Deferasiox (DFX) هو مخلب حديدي معروف يستخدم على نطاق واسع في المجال10. عند التطبيق ، فإنه يحبس الحديد الحر في السيتوبلازم ويؤدي إلى استجابة خلوية لتجويع الحديد. نظرا لأن الهدف من هذه الدراسة كان تقييم الفيريتينوفاجي ، فإن حرمان خلايا الحديد كان طريقة مباشرة لتعزيز تدهور الفيريتين عن طريق الالتهام الذاتي كآلية تعويض لتجديد تجمع الحديد الخلوي. على العكس من ذلك ، يتم استخدام سترات الأمونيوم الحديديك (FAC) لتحميل الخلايا بالحديد. تقوم الخلايا بتنشيط تخليق الفيريتين كرد فعل على تركيزات الحديد الخلوية المفرطة ، وبالتالي السامة11. سترات الأمونيوم الحديديك ، وبالتالي ، يعزز تخليق الفيريتين وانحباس الحديد داخل البوليمرات غير المتجانسة للفيريتين ، والتي بدورها يمكن أن تنشط ferritinophagy.

لدراسة تدفق الفيريتين ، في هذا البروتوكول ، نقوم بشكل انتقائي بتلطيخ اللاعبين الرئيسيين في العملية - الفيريتين والليزوزومات (هنا المميزة ب LAMP2) - وتقييم تمركزهم المشترك. تشير نسبة عالية من التنقيط المشترك إلى التدهور الليزوزومي الفعال للفيريتين. لتعظيم المعلومات المستردة من هذه التجارب ، يمكن استخدام أصباغ إضافية أو أجسام مضادة علامة.

وتجدر الإشارة إلى أن هناك تحديات تقنية متأصلة في هذه الطريقة. قد تتكاثر الخلايا الليفية الأولية المشتقة من متبرعين بشريين مختلفين وتنمو بشكل مختلف في المختبر. ومن ثم ، للحصول على نتائج قابلة للمقارنة ، يجب زرع خلايا مختلفة في نفس الممر. لذلك ، ينصح بإجراء تجربة اختبار قبل الشروع في هذا البروتوكول لفحص أوقات مضاعفة الخلايا أو خطوط الخلايا التي سيتم استخدامها.

لا تقتصر هذه الطريقة على دراسة ferritinophagy. ببساطة عن طريق تغيير العلاجات والأجسام المضادة المستخدمة ، يمكن إعادة توجيهها لتقييم مختلف مسارات الالتهام الذاتي الانتقائية الأخرى ؛ على سبيل المثال ، يمكن فحص الميتوفاجي باستخدام CCCP كمحفز لإجهاد الميتوكوندريا والأجسام المضادة optineurin و LC3 و LAMP2 للتلطيخ12.

بشكل عام ، يشكل الجمع بين الحصول الآلي على الصور وتحليل CellProfiler أداة قوية للتقييم الوظيفي عالي الإنتاجية للخلايا الليفية البشرية المفردة. هذا مهم بشكل خاص لدراسة الأمراض البشرية ، والتي لها أهمية كبيرة في تحليل ومقارنة مجموعات كبيرة من الخلايا المشتقة من المريض والخلايا المشتقة من المتبرعين الأصحاء.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) Project ID 259130777 - SFB 1177 (المشروع E03). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<خطوط الخلايا القوية > < / قوية >
الليفية البشرية المشتقة من الجلد   ؛خزعة الجلد ، متبرع بشري سليم ، عيادة جامعة بيوبانك Tü. بينجن ، الموافقة الأخلاقية 389/2019BO2F-CO-60 ، تمرير 9
<قوي>علاجات زراعة الخلايا< / قوي >< قوي > التركيز النهائي (مركب) < / قوي >
وسيط التحكمDMEM 10٪ FCS(DMSO فقط) وسيط
التحكم + بافيلومايسين A1DMEM 10٪ FCS100 نانومتر بافيلومايسين A1
وسيط التحكم + ديفيراسيوكس (DFX)DMEM 10٪ FCS30 & micro; متوسط التحكم M DFX
+ DFX + bafilomycinA1DMEM 10٪ FCS30 & micro; M DFX ، 100 نانومتر بافيلومايسين A1
وسيط التحكم + سترات الأمونيوم الحديديك (FAC) DMEM10٪ FCS0.05 مجم / مل
FAC وسيط التحكم + FAC + بافيلومايسين A1DMEM 10٪ FCS0.05 مجم / مل FAC ، 100 نانومتر بافيلومايسين A1
<قوي>مادة < / قوي>
الألبومين [BSA] الكسر الخامسAppliChemA1391
Alexa 488 الماعز أ أرنبLife TechnologiesA-11008
Alexa 546 الماعز الفأرLife TechnologiesA-11003
Bafilomycin A1Sigma Aldrich196000
BioLite Cell Culture أطباق 10 سم المعالجةThermo Scientific130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM GlutamaxGibco31966
DMSO AppliChemA3672
DPBS بدون كالسيوم ولا مغنيسيومجيبكو14190094
مصل الأبقار الجنينية (FCS)جيبكو10437-028
سترات الأمونيوم الحديديك (FAC)MerckF5879
Anti-FERRITIN (الطحال البشري)Rockland200-401-090-0100
LAMP2 (H4B4)سانتا كروزSC-18822
بارافورمالدهايد (PFA)سيجما ألدريتش441244
PBS 10x Dulbecco sAppliChemA0965
PenStrep (1،00U / مل بنسلين ، 100 مجم / مل ستربتومايسين)Life Technologies15140-122
Trypsin-EDTA (0.05٪) مع الفينول الأحمرGibco25300
Tween20AppliChemA4974
96 بئر زجاجي القاع # 0 لوحاتCellvisP96-0-N
Solution< / strong>
3.7٪ بارافورمالدهيد (PFA)PFA مذاب في PBS ، درجة الحموضة 7.5   ؛
Bafilomycin A1 مخزون 100 مليBafilomycin A1 مخفف في DMSO
سترات الأمونيوم الحديديك (FAC) 100 مجم / مل مخزونFAC مخفف في الماء المقطر المزدوج المعقم
PBS / TPBS ، مكمل بنسبة 10٪ Tween20 & nbsp ؛
PBS / T + BSAPBS ، مكمل بنسبة 10٪ Tween20 ، 1٪ BSA & nbsp ؛
<قوي>Software
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPad PrismDotmatics
Microsoft Excel الإصدار 16.50مايكروسوفت أوفيس بلس 365
الخلايا من

المراجع

  1. Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
  2. Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
  3. Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).
  4. Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
  5. Wilson, J. A. -O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
  6. Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
  7. Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
  8. Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
  9. Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
  10. Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
  11. Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).
  12. Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CellProfiler LAMP2
Ferritinophagy: تقييم التدهور الانتقائي للحديد عن طريق الالتهام الذاتي في الخلايا الليفية البشرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.