يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير الكيميائي المتعامد الحيوي لعملية التمثيل الغذائي للخلايا التي تنظمها الأحماض الأمينية العطرية

1.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65121

⸱

مايو 12, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا لتصور الأنشطة الأيضية مباشرة في الخلايا التي تنظمها الأحماض الأمينية باستخدام المجهر المجهري لتشتت رامان المحفز(DO-SRS) ، والذي يتكامل مع المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PEF).

الملخص

الأحماض الأمينية العطرية الأساسية (AAAs) هي اللبنات الأساسية لتوليف كتل حيوية جديدة في الخلايا والحفاظ على الوظائف البيولوجية الطبيعية. على سبيل المثال ، يعد الإمداد الوفير من AAAs مهما للخلايا السرطانية للحفاظ على نموها السريع وانقسامها. مع هذا ، هناك طلب متزايد على نهج تصوير محدد للغاية وغير جراحي مع الحد الأدنى من تحضير العينات لتصور مباشر لكيفية تسخير الخلايا ل AAAs لعملية التمثيل الغذائي في الموقع. هنا ، نقوم بتطوير منصة تصوير بصري تجمع بين فحص أكسيد الديوتيريوم (D2O) مع تشتت رامان المحفز (DO-SRS) وتدمج DO-SRS مع مضان إثارة الفوتون (2PEF) في مجهر واحد لتصور الأنشطة الأيضية لخلايا HeLa مباشرة تحت تنظيم AAA. بشكل جماعي ، توفر منصة DO-SRS دقة مكانية عالية وخصوصية للبروتينات والدهون المركبة حديثا في وحدات خلايا HeLa المفردة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لطريقة 2PEF اكتشاف إشارات التألق الذاتي للنيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) والفلافين بطريقة خالية من الملصقات. يتوافق نظام التصوير الموصوف هنا مع كل من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي ، وهو مرن للتجارب المختلفة. يتضمن سير العمل العام لهذا البروتوكول زراعة الخلايا ، وإعداد وسائط الثقافة ، ومزامنة الخلايا ، وتثبيت الخلية ، وتصوير العينات باستخدام طرائق DO-SRS و 2PEF.

المقدمة

كونها أحماض أمينية عطرية أساسية (AAAs) ، يمكن أن يمتصها جسم الإنسان من الفينيل ألانين (Phe) والتريبتوفان (Tryp) لتجميع جزيئات جديدة للحفاظ على الوظائف البيولوجية الطبيعية1. هناك حاجة إلى Phe لتخليق البروتينات والميلانين والتيروزين ، في حين أن Tryp مطلوب لتخليق الميلاتونين والسيروتونين والنياسين2،3. ومع ذلك ، فإن الاستهلاك الزائد لهذه AAAs يمكن أن ينظم هدف الثدييات لمسار rapamycin (mTOR) ، ويمنع كيناز البروتين المنشط AMP ، ويتداخل مع استقلاب الميتوكوندريا ، ويغير بشكل جماعي التخليق الحيوي للجزيء الكبير ويؤدي إلى إنتاج السلائف الخبيثة ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا السليمة4،5،6. يعد التصور المباشر لديناميكيات التمثيل الغذائي المتغيرة في ظل تنظيم AAA الزائد أمرا ضروريا لفهم أدوار AAAs في تعزيز تطور السرطان ونمو الخلايا السليمة7،8،9.

تعتمد دراسات AAA التقليدية على كروماتوغرافيا الغاز (GC)10. الطرق الأخرى ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، لها دقة مكانية محدودة ، مما يجعل من الصعب إجراء التحليل الخلوي ودون الخلوي للعينات البيولوجية11. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير الامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) لتوضيح دور AAAs في تخليق الدهون والبروتين في انتشار السرطان باستخدام المؤشرات الحيوية غير الغازية12،13،14. ومع ذلك ، لا تزال هذه التقنية تعاني من أعماق التصوير الضحلة ، وضعف الدقة المكانية ، وإعداد العينات على نطاق واسع. على المستوى الخلوي ، يمكن تتبع النظائر المستقرة غير السامة ، مثل النيتروجين -15 والكربون -13 ، من خلال التصوير متعدد النظائر وقياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي النانوي لفهم اندماجها في الجزيئات الكبيرة. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق مدمرة للعينات البيولوجية الحية15,16. مجهر القوة الذرية (AFM) هو تقنية قوية أخرى يمكنها تصور ديناميكيات التمثيل الغذائي17. من ناحية أخرى ، قد يتسبب المعدل البطيء للمسح أثناء تصوير AFM في تشويه الصورة للنتيجة الناتجة عن الانجراف الحراري.

لقد طورنا طريقة تصوير ثنائية التعامد غير جراحية عن طريق اقتران المجهر بأكسيد الديوتيريوم (D2O) الذي تم فحصه بفحص تشتت رامان المحفز (DO-SRS) والفحص المجهري الفلوري ثنائي الفوتون الخالي من الملصقات (2PEF). تحقق هذه الطريقة دقة مكانية عالية وخصوصية كيميائية عند تصوير العينات البيولوجية18،19،20،21،22،23،24. يقدم هذا البروتوكول تطبيقات DO-SRS و 2PEF لفحص الديناميات الأيضية للدهون والبروتين وتغيرات نسبة الأكسدة والاختزال أثناء تطور السرطان. نظرا لكون D2O شكلا مستقرا من نظائر الماء ، يمكن تمييز الجزيئات الحيوية الخلوية بالديوتيريوم (D) بسبب تعويضه السريع مع إجمالي ماء الجسم في الخلايا ، وتشكيل روابط الكربون والديوتيريوم (C-D) من خلال التبادل الأنزيمي21. يمكن اكتشاف روابط C-D في الجزيئات الكبيرة المركبة حديثا ، بما في ذلك الدهون والبروتينات والحمض النووي / الحمض النووي الريبي والكربوهيدرات ، في المنطقة الصامتة للخلية من طيف رامان20،21،22،25،26،27. مع اثنين من نبضات الليزر المتزامنة ، يمكن عرض روابط C-D للدهون والبروتينات المركبة حديثا على خلايا مفردة عبر التصوير الطيفي (HSI) دون استخراجها أو تمييزها بعوامل سامة للخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفحص المجهري SRS لديه القدرة على بناء نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) لمناطق مختارة ذات أهمية في العينات البيولوجية من خلال التقاط ودمج مجموعة من الصور المقطعية22,26. مع التصوير الحجمي فائق الطيفية و 3D ، يمكن ل DO-SRS الحصول على توزيعات مكانية للجزيئات الكبيرة المركبة حديثا في خلايا مفردة ، إلى جانب نوع العضيات التي تسهل عملية تعزيز نمو السرطان بموجب لائحة AAA22. علاوة على ذلك ، باستخدام 2PEF ، يمكننا الحصول على إشارات التألق الذاتي للفلافين والنيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) بدقة عالية وعمق اختراق عميق وتلف منخفض المستوى في العينات البيولوجية21،23،24. تم استخدام إشارات التألق الذاتي للفلافين و NADH لتوصيف توازن الأكسدة والاختزال وبيروكسيد الدهون في الخلايا السرطانية22,26. على هذا النحو ، لا يوفر اقتران DO-SRS و 2PEF تحليلا تحت خلوي لديناميكيات التمثيل الغذائي التي تنظمها AAA في الخلايا السرطانية ذات التوزيع المكاني العالي ، ومعلومات الخصوصية الكيميائية ، والحد الأدنى من تحضير العينات ، ولكن الطريقة تقلل أيضا من الحاجة إلى استخراج أو تسمية الجزيئات الداخلية بالكواشف السامة. في هذا البروتوكول ، نقدم أولا إجراءات D2O وإعداد الأحماض الأمينية ، وكذلك زراعة الخلايا السرطانية. بعد ذلك ، نعرض بروتوكولات تصوير DO-SRS وتصوير 2PEF. أخيرا ، نقدم النتائج التمثيلية لتصوير SRS و 2PEF ، والتي توضح التغيرات الأيضية التي تنظمها AAA للدهون والبروتين ، وتغيرات نسبة الأكسدة والاختزال في الخلايا السرطانية. يتم تسليط الضوء على توضيح مفصل للعملية في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. قم بإعداد 10 مل من عناصر التحكم و AAAs الزائدة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على 50٪ D2O.
    1. بالنسبة لوسائط التحكم ، قم بقياس وخلط 10 مجم من مسحوق DMEM مع 4.7 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يحتوي مسحوق DMEM على جميع الأحماض الأمينية بتركيزات قياسية. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا. أضف 4.7 مل من D2O ، 0.5 مل من مصل الأبقار الجنينية (5٪ FBS) ، و 0.1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1٪). دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا.
    2. بالنسبة لوسط معالجة 15x Phe ، قم بقياس وخلط 10 ملغ من مسحوق DMEM مع 4.7 مل من ddH2O و 0.5 مل من FBS (5٪) و 0.1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1٪) في أنبوب مخروطي 15 مل. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا. أضف مسحوق Phe الزائد بتركيز 924 مجم / لتر إلى الوسط. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا.
    3. بالنسبة لوسط علاج 15x Tryp ، قم بقياس وخلط 10 ملغ من مسحوق DMEM مع 4.7 مل من ddH2O و 0.5 مل من FBS (5٪) و 0.1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1٪) في أنبوب مخروطي 15 مل. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا. أضف مسحوق تريب الزائد بتركيز 224 مجم / لتر إلى الوسط. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا.
    4. أضف الميثيونين والثريونين عند 30.0 مجم / مل و 95.0 مجم / مل ، على التوالي ، إلى جميع الأنابيب المخروطية في الخطوات السابقة. دوامة تماما وعكس الأنبوب. لا يلزم إضافة بيروفات الصوديوم إلى وسائط الاستزراع.
    5. قم بتصفية وسائط التحكم والمعالجة باستخدام مرشح حقنة مقاس 25 مم مع مرشحات غشاء بولي إيثر سلفون 0.22 ميكرومتر.
    6. أغلق جميع الأنابيب المخروطية المحتوية على الوسائط باستخدام بارافيلم واحفظها على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع. قبل معالجة الخلايا بالوسائط ، قم بتسخين جميع الوسائط إلى 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب قياس المسحوق والكواشف السائلة ودمجها بناء على الحجم الإجمالي لوسائط المعالجة والتحكم.

2. تحضير عينة الخلية

  1. الحفاظ على خلايا سرطان عنق الرحم (HeLa) في دورق مزرعة (أي T10 ، T25 ، إلخ) باستخدام DMEM القياسي المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2).
  2. استزراع خلايا هيلا بنسبة انقسام 1:10 حتى تصل إلى 80٪ أو أعلى من صلاحية الخلية.
  3. بمجرد أن تحقق الخلايا التقاء 80٪ أو أعلى ، انتقل إلى زرع 2 × 10 5 خلايا لكل بئر على صفيحة 24 بئرا باستخدام DMEM المكمل ب0.5 ٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    1. قبل بذر الخلايا ، قم بإعداد صفيحة من 24 بئرا مع أغطية مستديرة معقمة ، بولي دي ليسين ، مغلفة باللامينين ، قطرها 12 مم. اغمر أغطية الغطاء في 70٪ من الإيثانول وجففها برفق باستخدام مناديل خالية من النسالة. ضع أغطية الغطاء النظيفة في الآبار المناسبة للوحة.
    2. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ في الخطوة 2.2 ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) بدون أيونات المغنيسيوم والكالسيوم.
    3. أضف 0.25٪ تربسين لفصل الخلايا الملتصقة عن القارورة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 3 دقائق.
    4. أضف DMEM المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، ماصة بلطف لأعلى ولأسفل ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق.
    5. إعادة تعليق الخلايا في DMEM مع 0.5 ٪ FBS و 1 ٪ البنسلين / الستربتومايسين.
    6. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، والمجهر الضوئي ، وأزرق التريبان ، وزرع كثافة 2 × 105 خلايا لكل بئر من صفيحة 24 بئرا. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام عداد خلية آلي لحساب الخلايا.
    7. أعد الخلايا إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، وهز اللوحة برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي.
  4. بعد 8 ساعات ، استبدل وسائط الثقافة القديمة بنسبة 50٪ D 2 O/ Phe الزائدة أو 50٪ D2O / وسائط Tryp الزائدة. أعد الخلايا إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 36 ساعة.
  5. بعد 36 ساعة ، قم بإصلاح الخلايا على شرائح المجهر.
    1. قبل التثبيت ، قم بإعداد شرائح المجهر بفواصل تصوير قطرها 9 مم ووضع 15 ميكرولتر من 1x PBS مع أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم.
    2. شطف الخلايا مع 1x PBS تستكمل مع أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم.
    3. أضف 0.5 مل من محلول بارافورمالدهايد الخالي من الميثانول (PFA) بنسبة 4٪ واترك اللوحة تحت غطاء السلامة الحيوية لمدة 15 دقيقة تقريبا.
    4. نضح محلول PFA واشطفه باستخدام 1x PBS مكمل بأيونات الكالسيوم والمغنيسيوم مرتين.
    5. أضف 1.5 مل من 1x PBS المكمل بأيونات الكالسيوم والمغنيسيوم في كل بئر.
    6. استخدم ملاقط معقمة لإخراج أغطية الغطاء برفق من كل بئر. اقلب وضع الجانب المحتوي على الخلية من أغطية الغطاء على فواصل التصوير للاتصال ب PBS المعد في الخطوة 2.5.1. تأكد من تعرض الجانب غير المحتوي على خلية للهواء.
    7. باستخدام طلاء الأظافر الشفاف ، أغلق الطبقة الخارجية من غطاء الغطاء باستخدام فاصل التصوير.
  6. قم بتخزين شرائح المجهر عند 4 درجات مئوية عند عدم التصوير.

3. قياس مطيافية رامان التلقائي (الشكل 2)

  1. استخدم مجهر رامان متحد البؤر للحصول على أطياف رامان العفوية (الشكل 2 أ).
  2. قم بتشغيل الليزر عن طريق تحويل المفتاح إلى وضع التشغيل .
  3. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز برنامج LabSpec6 لفتح برنامج الاستحواذ.
  4. حمل العينة البيولوجية على حامل العينة أسفل العدسة الشيئية مباشرة.
  5. في البرنامج ، انقر فوق رمز الكاميرا لتشغيل كاميرا الفيديو.
  6. اضبط مستوى التركيز البؤري لتحديد منطقة الاهتمام باستخدام العدسة الموضوعية بمعدل 50 ضعفا. حرك عصا التحكم للتحكم في ترجمة المسوي لمرحلة XY وقم بتدوير عصا التحكم لتغيير عمق التركيز البؤري.
  7. بعد اختيار موضع القياس ، قم بالتبديل إلى العدسة الموضوعية 100x بقوة 40 ميجاوات من الإثارة. انقر فوق رمز الإيقاف الأحمر لإيقاف تشغيل كاميرا الفيديو.
  8. حدد شبكة 1800 خط / مم ، واضبط نطاق الاستحواذ من 400 سم -1 إلى 3150 سم -1.
  9. اضبط وقت الاستحواذ على 90 ثانية ، والتراكم على 3 ، و Binning على 4 لأقل ضوضاء وطيف أكثر دقة.
    ملاحظة: يمكن تحسين معلمات التصوير هذه لتلائم التجربة.
  10. انقر فوق رمز السهم لتشغيل العرض في الوقت الفعلي.
  11. اضبط إزاحة Raman (cm-1) على القيمة المفضلة لضبط مستوى التركيز البؤري بدقة.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، تم تركيز ليزر رامان على قطرات الدهون ، والتي تحتوي على تركيز عال من روابط CH2 . لذلك ، تم اختيار إزاحة رامان البالغة 2850 سم -1 والتي تتطابق مع أوضاع التمدد لرابطة CH2 لهذا الغرض.
  12. اضبط مستوى التركيز البؤري باستخدام عصا التحكم لتحسين أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء.
  13. بعد اختيار مستوى التركيز ، انقر فوق رمز الإيقاف الأحمر للعرض في الوقت الفعلي.
  14. حدد أيقونة الدائرة لبدء اكتساب الطيف.
  15. بمجرد أخذ المنطقة الخلوية ، استخدم نفس مستوى التركيز لقياس الخلفية باستخدام PBS. اطرح طيف الخلفية من كل طيف مستهدف تحت خلوي باستخدام تطبيق برنامج كمبيوتر منفصل ، مثل Origin (الشكل 1B).

4. تجارب التصوير مع 2PEF و SRS

ملاحظة: يمكن العثور على أوصاف مفصلة لمحاذاة ليزر SRS في تقرير سابق28. يركز هذا البروتوكول على تشغيل نظام تصوير SRS و 2PEF متعدد الوسائط (الشكل 2C ، D).

  1. انقر فوق ابدأ لتسخين الليزر.
  2. اتبع الترتيب لضبط المفاتيح الرئيسية لوحدة التحكم والشاشة على: 1) اضغط على المفتاح الرئيسي لصندوق التحكم IX3-CBH إلى تشغيل ، 2) اضغط على المفتاح الرئيسي لوحدة التحكم في لوحة اللمس إلى تشغيل ، 3) اضغط على المفتاح الرئيسي لمحول التيار المتردد لمصدر الطاقة لجهاز التحكم عن بعد بالليزر LD OBIS 6 المتصل بمجمع الليزر الرئيسي FV31-SCOMB إلى تشغيل، و 4) اضغط على المفتاح الرئيسي لمحول التيار المتردد لمصدر الطاقة لجهاز التحكم عن بعد بالليزر LD OBIS 6 المتصل بمجمع الليزر الفرعي FV31-SCOMB إلى تشغيل.
  3. اضغط على المفاتيح الرئيسية لكاشف الصمام الثنائي الضوئي Si وتشغيل مضخم القفل.
  4. اضبط شعاع ستوكس على 1031 نانومتر ، وعرض النبض عند 6 حصان ، ومعدل التكرار عند 80 ميجاهرتز.
  5. إلى جانب المجهر ، اضبط نظام picoEmerald المزود بحزمة المضخة المتزامنة بطول موجي قابل للضبط من 720-990 نانومتر ، وعرض نبضة من 5-6 حصان ، ومعدل تكرار 80 ميجاهرتز. متوسط قوة الإثارة لكل من المضخة و Stokes هو 450 ميغاواط. تحسين قوة الإثارة لتقليل التلف الضوئي للعينة.
  6. استخدم مكثف زيت ذو فتحة رقمية عالية (NA) (أي 1.4 NA) لجمع Stokes وعوارض المضخة حيث يتم تركيب العينة عن طريق إصدار بضع قطرات على المكثف.
  7. قم بتركيب العينة على الزيت وضع قطرة ماء كبيرة فوق شريحة المجهر حيث يتم تثبيت العينة. هذا هو لعدسة موضوعية الغمر في الماء.
  8. اضبط مضخم القفل على 20 ميجاهرتز. قم بمعالجة الصورة الآن باستخدام وحدة البرامج فائقة الدقة.
  9. حدد 512 بكسل × 512 بكسل و 80 ميكرو ثانية / بكسل لوقت السكون.
  10. بمجرد تركيز المنطقة الخلوية المطلوبة بشكل صحيح ، احصل على الصورة. باستخدام برنامج الحصول على المجهر ، احفظ الصور كملف رسومي أوليمبوس .oir.
  11. احصل على صورة خلفية بحجم 1900 سم -1 واطرحها من جميع الصور الخلوية.
  12. لإجراء تصوير 2PEF ، استخدم نفس ليزر بيكو ثانية القابل للضبط ، واضبط التألق الذاتي الخالي من الملصقات للفلافين و NADH على 800 نانومتر و 780 نانومتر على التوالي.
  13. استخدم مكعب مرشح 460 نانومتر / 515 نانومتر لجمع انبعاث الفلورة الذاتية للفلافين و NADH.
  14. اضبط وقت السكون على 8 ميكرو ثانية / بكسل وحجم البكسل على 512 بكسل × 512 بكسل. اضبط معلمة طاقة مصراع الليزر على 150 ميجاوات.
  15. لإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد ، قم بضبط خسارة رامان المحفزة إلى 2850 سم -1 (797 نانومتر).
  16. بمجرد تحديد الخلايا المفردة المطلوبة ، قم بتسجيل الليزر للمسح من مستوى التركيز العلوي لاكتشاف الطبقات العلوية والسفلية لتلك الخلايا.
    ملاحظة: يتم إنشاء نماذج 3D وحفظها كملفات .oir.

5. تحليل الأطياف والصور

  1. تحليل الأطياف
    1. استخدم برنامج Origin أو التطبيقات الأخرى ذات الصلة لطرح طيف الخلفية من جميع أطياف الهدف تحت الخلوي.
    2. استخدم عمليات النمذجة الرياضية ل MATLAB لمعالجة أطياف Raman باستخدام الوظائف المضمنة في البرنامج. يمكن أيضا استخدام Python لمعالجة الأطياف.
      1. تبدأ المعالجة الطيفية المسبقة بتحويل الملفات إلى مصفوفة. يتم استيفاء الأطياف عند كل سنتيمتر متبادل.
      2. للتحقق من الصحة ، رسم بياني للبيانات الأولية. قم بإجراء تصحيح خط الأساس على الأطياف الخام باستخدام الوظيفة المضمنة msbackadj في MATLAB. باختصار ، تقدر الدالة المضمنة نقاط خط الأساس عند قيم وحدة الفصل التي حددها المستخدمون وترجع المسافة بين النوافذ المجاورة. من نقاط خط الأساس ، قم بتقدير ورسم خط الانحدار. قم بتطبيق التنعيم لتنعيم خط الانحدار لطرح الخط الأساسي من كل طيف خام منفرد.
      3. قم بإجراء التطبيع min-max بقسمة شدة رامان للبروتين عند 2,930 سم -1 على شدة كل نوبة رامان. عادة ما تكون إشارة 2,930 cm-1 هي أعلى كثافة في طيف رامان. مع هذا التطبيع ، يتم تحويل القيمة القصوى إلى 1 بينما يتم تحويل القيمة الدنيا إلى 0. يتم تحويل كل قيمة أخرى إلى رقم عشري بين 0 و 1.
      4. متوسط الأطياف الفردية لنفس الحالة في طيف واحد لتقليل الضوضاء.
    3. بمجرد المعالجة ، استخدم التطبيقات ، مثل Origin ، لعرض جميع الأطياف في وقت واحد. تمثل القمم المعروضة في الأطياف رابطة كيميائية محددة أو مجموعة وظيفية.
  2. تحليل صورة 3D من قطرات الدهون
    1. استخدام برنامج FIJI-ImageJ لمعالجة جميع الصور 3D
    2. أداء وظائف مرشحات ممر النطاق الترددي وتنعيم لمكدسات الصور 3D.
    3. لتحليل الصور 3D ، قم بتعيين كل قطرة دهنية إلى درجة كروية محسوبة عن طريق قياس المسافة بين مركز كتلتها إلى السطح. قارن كل درجة كروية بنتيجة كروية لكرة مثالية على نفس الخطة الإقليدية. تخلص من قطرات الدهون ذات الدرجات الكروية المنخفضة وقم بتقييم قطرات الدهون المتبقية لحجمها وأعدادها.
    4. تحليل حجم وأعداد قطرات الدهون بين المعالجات المختلفة للدلالة الإحصائية على تطبيق برنامج إحصائي مناسب. هنا ، تم استخدام GraphPad Prism.
  3. تحليل الصور الطيفية 2D
    1. استخدم برنامج FIJI-ImageJ لمعالجة جميع الصور الطيفية 2D.
    2. حدد قناة 2,930 cm-1 لعمل صورة قناع تحتوي على قيم 0 و 1. قم بتعيين الخلفية إلى 0 والمنطقة الخلوية إلى 1.
    3. اطرح قناة البروتين المسمى بالديوتيريوم (2,175 سم -1) إلى قناة الخلفية (1,900 سم -1) لإزالة تأثيرات الفلورسنت.
    4. اقسم قناة البروتين الناتجة التي تحمل علامة الديوتيريوم على قناة البروتين (2,930 سم -1) للحصول على صور قياس معدل دوران البروتين.
    5. بعد ذلك ، اضرب صورة القناع التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.3.2 في الصور التناسبية لإزالة أي ضوضاء خلفية متبقية. نتيجة لذلك ، يتم إنشاء خلفية داكنة في كل صورة نسبية.
    6. استخدم أداة التحديد اليدوي في FIJI-ImageJ لتقسيم وحساب كثافة البكسل المعروضة على الخلايا المفردة يدويا. تتوافق شدة البكسل مع تركيزات الرابطة الكيميائية التي يتم تصورها.
    7. تحليل كثافة البكسل للدلالة الإحصائية على تطبيق برنامج إحصائي مناسب. هنا ، تم استخدام GraphPad Prism. كرر هذا التحليل مع التحليل النسبي المتبقي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أدت إضافة AAAs الزائدة بتركيزات 15x إلى وسائط زراعة الخلايا المحتوية على 50٪ D2O إلى إنتاج نطاقات C-D Raman متميزة من الدهون والبروتينات المركبة حديثا في خلايا HeLa (الشكل 2B). أجريت التجارب السابقة بمستويات تركيز مختلفة ، مثل 2x و 5x ، وعلى الرغم من عدم تقديم البيانات ، إلا أن تركيز 15x أنتج نطاقات C-D Raman الأكثر تميزا من الدهون والبروتينات المركبة حديثا. على وجه التحديد ، من خلال التحقيق في قطرات الدهون (LDs) ، لاحظنا أن كلا من 15x Phe و 15x Tryp يسببان الدهون وإشارات البروتين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم تطبيق تصوير DO-SRS و 2PEF للتحقيق في ديناميكيات التمثيل الغذائي في نماذج مختلفة خارج الجسم الحي ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة والأنسجة البشرية 21،22،23،24،26،27،33. تدمج طريقة التصوير المستخدمة في هذه الدراسة الفحص المجهري DO-SRS و 2PEF ، والذي يمكن أن يتفوق على طرق التصوير الأخرى ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور ياجوان لي وأنتوني فونغ على دعمهما الفني ، ومختبر فرالي على خط الخلايا. نحن نعترف بأموال بدء التشغيل من UCSD و NIH U54CA132378 و NIH 5R01NS111039 و NIH R21NS125395 و NIHU54DK134301 و NIHU54 HL165443 وجائزة Hellman Fellow Award.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 مل ماصات مصلية  أفانتور (بواسطة VWR)75816-100https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطيVWR89039-664https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16٪ فورمالديهايد ، خالي من الميثانولThermoFisher Scientific28906https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
لوحة24 بئراFB0112929 فيشربراندhttps://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
فلتر حقنة 25 مم ، 2 & m PESFoxx Life Sciences381-2216-OEMhttps://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 نانومتر مكعب تصفيةأوليمبوسOCT-ET460 / 50M32
محولات التيار المتردد لمصدر الطاقة ل LD OBIS 6 Laser RemoteOlympusإمداد الطاقة إلى مرشح تمرير النطاق الترددي
بالليزر KR ElectronicsKR27248 ميجا هرتز
BNC 50 أوم Terminator دوائر صغيرةSTRM-50
BNC كابلThorlabs2249-Cكابل محوري ، BNC ذكر / ذكر
مرآة عازلة عريضةThorlabsBB1-E03750 - 1100 نانومتر
جهاز
مكثفأوليمبوس
غطاء زجاجيكورنينج2850-25https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
التيار المستمر التيارTopWard6302D
ثنائي اللون جبلThorlabsKM100CL
كاشف ثقافة الخلايا ثنائي ميثيل سلفوكسيدmpbio & nbsp ؛196055https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
النسر المعدل لدولبيكو s متوسط بدون ميثيونين وثريونين وبيروفات الصوديومMilliporeSigma38210000https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
مع بيكربونات الصوديوم وبدون ميثيونين, ثريونين, وبيروفات الصوديوم 
دولبيكو s النسر المعدل s MT10027CVكورنينجhttps://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's٪20Modified٪20Eagle's٪20Medium٪20
FIJI ImageJImageJالإصدار 1.53t 24 أغسطس 2022https://imagej.net/software/fiji/downloads
الماء الثقيل (أكسيد الديوتيريوم)Isotope Laboratories، Inc.7732-18-5https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
خلايا هيلاATCCCCL-2https://www.atcc.org/products/ccl-2
مقياس الدمميليبورسيجماZ359629-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB & gclsrc = aw.ds
High OD Bandpass FilterChroma TechnologyET890 / 220mقم بتصفية شعاع Stokes ونقل شعاع المضخة
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)Cytiva   ؛SH300880340https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25٪ (1x) SolutionCytivaSH30042.02https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
نظام ليزر SRSالمتكامل للفيزياء التطبيقية & شركة الإلكترونياتيوفر picoEMERALDpicoEMERALD نبضة إخراج عند 1031 نانومتر مع عرض نبضة 6 ps ومعدل تكرار 80 ميجاهرتز ، والذي يعمل كشعاع Stokes. يتم استخدام شعاع التردد المزدوج عند 532 نانومتر لزرع مذبذب بارامتري بصري بيكو ثانية (OPO) بشكل متزامن لإنتاج قطار نبض مغلق بالوضع بعرض نبضة خمسة ~ 6 ps (يتم حظر شعاع المهمل ل OPO بمرشح تداخلي). الطول الموجي الناتج ل OPO قابل للضبط من 720 &ndash ؛ 950 نانومتر ، والتي تعمل كشعاع مضخة. يتم تعديل شدة شعاع ستوكس 1031 نانومتر جيبيا بواسطة EOM مدمج عند 8 ميجاهرتز بعمق تعديل يزيد عن 90٪. يتداخل شعاع المضخة مكانيا مع شعاع ستوكس باستخدام مرآة ثنائية اللون داخل picoEMERALD. يتم تحقيق التداخل الزمني بين نبضات المضخة و Stokes من خلال مرحلة تأخير مدمجة ويتم تحسينها بواسطة إشارة SRS ل D2O النقي في المجهر.
مجهر المسح الضوئي بالليزر المقلوبأوليمبوسFV1200MPE
IX3-CBH صندوق التحكمأوليمبوسالتحكم في مجهر المسح بالليزر
مرآة حركية جبلThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 أدوات ضبط سداسية منخفضة
المستوى L-PhenalynineSigmaP5482-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-TryptophanSigmaT8941-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
Labالمواصفات 6Horiba XploRAN / Ahttps://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
قفل في مكبر للصوتZurich InstrumentsN / Ahttps://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
مقسم شعاع ثنائي اللون طويلالتمرير SemrockDi02-R980-25x36980 نانومتر ليزر BrightLine أحادي الحافة ليزر ثنائي اللون مسطح
MATLABMathWorksالإصدار: R2022bhttps://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
شرائح مجهرFisherbrand12-550-003https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
برنامج التصوير المجهريأوليمبوسفلو عرض
MPLN 100x, أوليمبوسأوليمبوسMPLAPONhttps://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[التركيز]=cmsContent11364
MPLN 50x, أوليمبوسأوليمبوسMPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[التركيز]=cmsContent11363
NA مكثف النفطأوليمبوس 6-U130https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
طلاء أظافرمبلل B01EO2G5O4 وايلدhttps://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
OriginOriginLabOrigin 2022b (9.95)https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
ParafilmFisher ScientificS37440https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (محلول ملحي مخزن فوسفات Dulbecco)Thermofischer - Gibco14040117https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
البنسلين / الستربتومايسينThermofischer - Gibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope AssemblyThorlabsRS99يشمل الوحدات العلوية والسفلية ، & Oslash ؛ 1 "آخر ، وشوكة لقط.
نظام picoEmeraldA.P.EN / A
صندوق محمي https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ مع موصلات BNC صندوقألومنيوم Pomona Electronics2902مع غطاء ، كاشف الثنائي الضوئي BNC أنثى / أنثى
Siمنزلي بنيتN / ADYI
رقاقة
Grace Bio-Labs654008https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
التحليل الطيفي التلقائي رامانHoriba XploRAN / Ahttps://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
الفحص المجهري المشتت رامانالمحفز المنزل المبنيN / A
Touch   تحكم لوحةOlympusالتحكم في اتجاه XY لمجهر المسح بالليزر
Trypan Blue 0.4٪ (0.85٪ كلوريد الصوديوم)  لونزا17-942Ehttps://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
ملاقطكافرم - أمازونB07RNVXXV1https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
اثنين من الفوتون إثارة الفحص المجهريالفلوري المنزل المبنيN / A
ورق وزن VWR12578-165https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
برنامج Zurich LabOneQأدواتزيورخ في مكبر الصوت قفل زيورخ
النطاق طرد مركزي الكهربائي متوسط Cambridge من سلسلة فواصل السيليكون تتحكم

المراجع

  1. Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
  2. Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).
  3. Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29(2018).
  4. Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
  5. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  6. Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
  7. Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
  8. Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
  9. Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
  10. Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
  11. Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. The potential of metabolic imaging. Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).
  12. Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
  13. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
  14. Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379(2013).
  15. Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869(2021).
  16. Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378(2016).
  17. Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).
  18. Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501(2020).
  19. Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
  20. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  21. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).
  22. Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702(2021).
  23. Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903(2022).
  24. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017(2022).
  27. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586(2022).
  28. Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547(2022).
  29. Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).
  30. Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501(2019).
  31. Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
  32. Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
  33. Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
  34. Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
  35. Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
  36. Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging. bioRxiv. , (2022).
  37. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  38. Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
  39. Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

HeLa
التصوير الكيميائي المتعامد الحيوي لعملية التمثيل الغذائي للخلايا التي تنظمها الأحماض الأمينية العطرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.