يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية والتعرض لمستويات مضبوطة من إجهاد القص والتمدد

1.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65122

⸱

أبريل 21, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية (hSVECs). كما نقدم طرقا مفصلة لإنتاج إجهاد القص والتمدد لدراسة الإجهاد الميكانيكي في hSVECs.

الملخص

جراحة مجازة الشريان التاجي (CABG) هي إجراء لإعادة توعية عضلة القلب الإقفارية. لا يزال الوريد الصافن يستخدم كقناة تحويل مسار الشريان التاجي على الرغم من انخفاض المباح على المدى الطويل مقارنة بالقنوات الشريانية. تؤدي الزيادة المفاجئة في إجهاد الدورة الدموية المرتبط بالشريان الطعم إلى تلف الأوعية الدموية ، وخاصة البطانة ، التي قد تؤثر على انخفاض سالكية طعم الوريد الصافن (SVG). هنا ، نصف عزل وتوصيف وتوسع الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية (hSVECs). تعرض الخلايا المعزولة عن طريق هضم الكولاجين مورفولوجيا الحصاة النموذجية وتعبر عن علامات الخلايا البطانية CD31 و VE-cadherin. لتقييم تأثير الإجهاد الميكانيكي ، تم استخدام البروتوكولات في هذه الدراسة للتحقيق في المحفزين الفيزيائيين الرئيسيين ، إجهاد القص والتمدد ، على SVGs الشريانية. يتم استزراع hSVECs في غرفة تدفق لوحة متوازية لإنتاج إجهاد القص ، مما يدل على المحاذاة في اتجاه التدفق وزيادة التعبير عن KLF2 و KLF4 و NOS3. يمكن أيضا استزراع hSVECs في غشاء سيليكون يسمح بالتمدد الخلوي المتحكم فيه الذي يحاكي التمدد الوريدي (المنخفض) والشرياني (العالي). يتم تعديل نمط F-actin للخلايا البطانية وإفراز أكسيد النيتريك (NO) وفقا لذلك من خلال الامتداد الشرياني. باختصار ، نقدم طريقة مفصلة لعزل hSVECs لدراسة تأثير الإجهاد الميكانيكي الديناميكي للدورة على النمط الظاهري البطاني.

المقدمة

يعد خلل الخلايا البطانية (EC) لاعبا رئيسيا في فشل ترقيع الوريد الصافن1،2،3،4. تؤدي الزيادة المستمرة في إجهاد القص والتمدد الدوري إلى تحفيز النمط الظاهري الالتهابي للخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية (hSVECs) 3،4،5،6. لا تزال المسارات الجزيئية الأساسية غير مفهومة تماما ، وقد تستفيد البروتوكولات الموحدة للدراسات في المختبر من الجهود المبذولة للحصول على رؤى جديدة في المنطقة. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا لعزل وتوصيف وتوسيع hSVECs وكيفية تعريضها لمستويات متغيرة من إجهاد القص والتمدد الدوري ، ومحاكاة ظروف الدورة الدموية الوريدية والشريانية.

يتم عزل hSVECs عن طريق حضانة كولاجيناز ويمكن استخدامها حتى المقطع 8. يتطلب هذا البروتوكول معالجة أقل للسفينة مقارنة بالبروتوكولات الأخرىالمتاحة 7 ، مما يقلل من التلوث بخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية. من ناحية أخرى ، فإنه يتطلب جزءا أكبر من الوعاء لا يقل عن 2 سم للحصول على استخراج EC بكفاءة. في الأدبيات ، تم الإبلاغ عن أنه يمكن أيضا الحصول على ECs من السفن الكبيرة عن طريق الإزالة الميكانيكية 7,8. على الرغم من فعاليته ، إلا أن النهج المادي له عيوب انخفاض إنتاجية EC وتلوث الخلايا الليفية العالي. لزيادة النقاء ، هناك حاجة إلى خطوات إضافية باستخدام الخرز المغناطيسي أو فرز الخلايا ، مما يزيد من تكلفة البروتوكول بسبب الحصول على الخرز والأجسام المضادة 7,8. الطريقة الأنزيمية لها نتائج أسرع وأفضل فيما يتعلق بنقاوة EC وصلاحيتها 7,8.

أكثر الخلايا البطانية استخداما لدراسة الخلل البطاني هي الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). من المعروف أن النمط الظاهري EC يتغير في أسرة الأوعية الدموية المختلفة ، ومن الضروري تطوير طرق تمثل الوعاء قيد التحقيق 9,10. في هذا الصدد ، يعد إنشاء بروتوكول لعزل hSVEC واستزراعه تحت الضغط الميكانيكي أداة قيمة لفهم مساهمة خلل hSVEC في مرض الكسب غير المشروع في الوريد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على أجزاء غير مستخدمة من الأوردة الصافن من المرضى الذين يخضعون لجراحة المجازة الأبهرية التاجية في معهد القلب (InCor) ، كلية الطب بجامعة ساو باولو. أعطى جميع الأفراد موافقة مستنيرة للمشاركة في الدراسة ، والتي تمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية.

1. عزل وثقافة وتوصيف الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية الأولية (hSVECs)

  1. اعداد
    1. الأوتوكلاف زوج من ملقط مستقيم أو منحني ومقص الأنسجة (7-8 سم).
    2. تحضير الجيلاتين المعقم. امزج 0.1 جم (0.1٪ وزن / حجم) أو 3 جم (3٪ وزن / حجم) من جيلاتين جلد الخنزير مع 100 مل من الماء عالي النقاء ، والأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة ، واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يسخن إلى 37 درجة مئوية لتسييله قبل طلاء أطباق وشرائح زراعة الخلايا.
    3. تحضير كولاجيناز معقم (1 مجم / مل) داخل غطاء التدفق الصفحي. تمييع كولاجيناز في برنامج تلفزيوني وتعقيمه مع مرشح 0.2 ميكرومتر.
    4. قم بتغطية طبق زراعة الخلايا 60 مم وشريحة حجرة ذات 8 آبار مع 0.1٪ وزن / حجم جيلاتين لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. إزالة الجيلاتين الزائد قبل بذر الخلايا.
    5. تحضير وسط الخلية البطانية الكامل: الوسط القاعدي لنمو الخلايا البطانية (EBM-2) المكمل بعوامل نمو EGM2.
      ملاحظة: يتم توفير عوامل نمو EGM2 كمجموعة من قبل شركة مدرجة في جدول المواد. لم يتم الكشف عن تركيز العوامل من قبل الشركة.
    6. اصنع 2٪ و 5٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) و 0.1٪ محاليل Triton X-100 ، وكلها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  2. عزلة وثقافة hSVECs
    1. اجمع ما لا يقل عن 2-3 سم من الوريد الصافن لهذا الإجراء.
      ملاحظه. يجب تنفيذ جميع إجراءات زراعة الخلايا في ظل ظروف معقمة وداخل غطاء التدفق الصفحي.
    2. انقل مقطع الوريد إلى طبق بتري مملوء ببرنامج تلفزيوني دافئ مسبقا. أدخل طرف ماصة في أحد طرفي الوريد واغسله برفق باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة كل الدم داخل التجويف. اغسله حتى يصبح تدفق الغسيل واضحا تماما.
    3. أغلق أحد طرفي الوريد بخياطة قطنية معقمة. املأ الوعاء بعناية بمحلول كولاجيناز من النوع الثاني 1 مجم / مل. أغلق الطرف الآخر من الوعاء بخياطة قطنية (الشكل 1 أ). احتضان الوعاء بمحلول كولاجيناز في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. بعد ذلك ، قم بقطع أحد طرفي الوعاء داخل أنبوب سعة 15 مل وجمع محلول الكولاجيناز. قطع الطرف الآخر وشطف سطح اللمعان مع 1-2 مل من PBS لجمع كل ECs منفصلة. ضع كل برنامج تلفزيوني مع محلول كولاجيناز داخل نفس الأنبوب.
    5. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لتكوير الخلايا.
      ملاحظه. بيليه الخلية صغير جدا ويصعب تصوره. إذا لم تتم إزالة الدم بالكامل قبل العلاج بالكولاجيناز (الخطوة 1.2.2) ، فسوف تترسب خلايا الدم أيضا ، وستكون الحبيبات حمراء.
    6. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 3-4 مل من وسط الخلية البطانية الكامل (EBM-2 المكمل بعوامل نمو EGM2) ومحلول هيبارين إضافي (5 وحدة / مل ، التركيز النهائي). ضع الخلايا في طبق زراعة الخلايا 60 مم مطلي مسبقا ب 3٪ وزن / وزن جيلاتين.
      ملاحظة: كان الجيلاتين هو الخيار الأول نظرا لسهولة الوصول إليه وتكلفته المنخفضة. نظرا لأن الطلاء بالجيلاتين يحافظ بنجاح على النمط الظاهري EC ، لم يتم اختبار أي مادة طلاء أخرى. يمكن اختبار الكولاجين والفبرونيكتين في الدراسات التي تهدف إلى التحقيق في تأثير مكونات المصفوفة خارج الخلية المختلفة على التصاق EC والنمط الظاهري.
    7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2 لمدة 4 أيام دون تغيير الوسط. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسائط كل يوم. من هذه اللحظة فصاعدا ، لم تعد مكملات وسائط الخلية الإضافية مع الهيبارين ضرورية. افحص اللوحة تحت المجهر للتأكد من إزالة خلايا الدم الحمراء.
    8. بعد 3-10 أيام بعد الاستخراج ، اعتمادا على حجم وقطر جزء الوريد ، تصور hSVECs بواسطة الفحص المجهري لتباين الطور.
    9. تقييم درجة الالتقاء ومورفولوجيا الحصى في الفحص المجهري لتباين الطور.
    10. استمر في تغيير الوسائط كل 2 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -80٪.
    11. قم بتمرير hSVECs بمحلول 0.25٪ من التربسين -0.02٪ من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA).
      1. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا.
      2. أضف 1 مل من محلول التربسين-EDTA إلى طبق زراعة الخلايا 60 مم. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة أو حتى يتم فصل جميع الخلايا.
      3. أضف 2 مل من وسط الخلية البطانية الكامل لتعطيل التربسين.
      4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في RT.
      5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط الثقافة.
      6. عد تعليق الخلية في 1: 1 تريبان الأزرق (0.4٪) للوحة الخلايا القابلة للحياة.
      7. لتوسيع المزرعة ، قم بطلاء الخلايا في طبق زراعة الخلايا 100 مم مع 10 مل من وسط الخلايا البطانية الكاملة الدافئة مسبقا واستزراعها عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2.
        ملاحظه. في المتوسط ، سيكون بذر 4 × 104 hSVEC / cm2 متقاربا بنسبة 100٪ بعد 48 ساعة.
    12. لحفظ الخلايا بالتبريد ، أعد تعليق الحبيبات من الخطوة 1.2.11.5 في 5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في مصل الجنين البقري (FBS) وتخزينها في النيتروجين السائل.
  3. توصيف hSVECs: تلطيخ قياس التدفق الخلوي ل CD31
    1. انقل 1 × 10 5 hSVECs إلى أنبوب واحد سعة1.5 مل وأجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على 2٪ BSA و CD31-FITC جسم مضاد أحادي النسيلة (1: 100).
    2. تلطيخ الخلايا لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
    3. اغسل الخلايا الملطخة بإضافة 0.5 مل من PBS وطردها مركزيا عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من PBS مع 2٪ BSA.
    4. استخدم hSVECs غير المسمى ، بدون جسم مضاد CD31 ، كعنصر تحكم سلبي.
    5. انتقل إلى تحليل اكتساب مقياس التدفق الخلوي باستخدام ليزر أزرق وقناة FITC (أقصى إثارة / انبعاث [Ex / Em] يبلغ 498/517 نانومتر). إذا تم استخدام الفلوروكرومات الأخرى ، فتحقق مما إذا كان مقياس الخلايا يحتوي على مجموعات مرشحات مناسبة لاكتشافها. افصل الخلايا عن الحطام في وظيفة حجمها ودقتها ، ثم قم ببوابة الخلايا المفردة عن طريق التشتت الأمامي والتشتت الجانبي.
  4. توصيف hSVECs: تلطيخ الفلورسنت ل CD31 و VE-cadherin
    1. لوحة 0.1 × 105 خلايا في شريحة غرفة 8 آبار مغلفة بالجيلاتين. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، للسماح للخلايا بالالتصاق بسطح الثقافة.
    2. قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني.
    3. أضف 0.3 مل / بئر من 4٪ PFA لإصلاح الخلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
    4. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    5. أضف 0.3 مل / بئر من محلول Triton X-100 بنسبة 0.1٪ لاختراق الخلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
    6. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    7. لمنع مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة ، أضف 0.3 مل / بئر من محلول BSA 5٪ إلى الخلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
    8. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    9. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الأولية (CD31 و VE-cadherin ، 1: 100) المخففة في PBS مع 2٪ BSA طوال الليل مع هزاز لطيف عند 4 درجات مئوية. اترك حاضنة واحدة جيدة مع برنامج تلفزيوني مع 2٪ BSA (بدون جسم مضاد أولي) كعنصر تحكم سلبي.
    10. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    11. احتضان الخلايا بأجسام مضادة ثانوية موسومة بالفلورسنت مخففة (1: 500) في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في RT. أضف 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) للتلطيخ النووي إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل.
    12. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    13. قم بإزالة غرفة الوسائط باستخدام الفاصل. ضع قطرة واحدة من الكاشف المتوسط المتصاعد (50٪ جلسرين في PBS) وضع شريحة زجاجية (24 مم × 60 مم) مع تجنب محاصرة الفقاعات.
    14. مراقبة الخلايا تحت المجهر مضان.
      ملاحظة: تم اكتشاف DAPI باستخدام مكعب ضوء DAPI (مثال: 335-379 نانومتر; Em: 417-477 نانومتر) ، ويتم الكشف عن CD31 / VE-cadherin باستخدام مكعب ضوء بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) (على سبيل المثال: 459-481 نانومتر ؛ Em: 500-550 نانومتر). مكعبات الضوء ذات نطاق الطول الموجي للإثارة / الانبعاث مماثلة كافية أيضا لهذه الفلوروكرومات. إذا تم استخدام الفلوروكرومات الأخرى ، فتحقق مما إذا كان المجهر المستخدم يحتوي على مجموعات مرشحات مناسبة لاكتشافها.

2. إجهاد القص على hSVECs

  1. اعداد
    1. قم بتغطية شريحة غرفة التدفق بالجيلاتين 0.1٪ w / v لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. إزالة الجيلاتين الزائد قبل بذر الخلايا.
    2. قم بموازنة الوحدة السائلة ومجموعة التروية المعقمة مع خزانات سعة 10 مل طوال الليل داخل الحاضنة في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
  2. تجربة إجهاد القص
    1. البذور 2 × 105 ECs معلقة في 100 ميكرولتر من وسط EC في شريحة غرفة التدفق المطلية بالجيلاتين. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للسماح للخلايا بالالتصاق بسطح الثقافة.
    2. ضع مجموعة التروية على الوحدة السائلة كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. املأ الخزانات والتروية المحددة في حوالي 12 مل من وسط الخلية البطانية الكاملة التي تم تسخينها مسبقا. قم بإزالة فقاعات الهواء يدويا من مجموعة التروية لموازنة مستوى كلا الخزانين عند 5 مل.
    3. ضع الوحدة السائلة مع مجموعة التروية المثبتة ، بدون شريحة الغرفة ، في الحاضنة وقم بتوصيل الكابل الكهربائي بالمضخة التي ينظمها الكمبيوتر. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء من الخزانات ومجموعة التروية ، وقم بتشغيل بروتوكول محدد مسبقا في برنامج التحكم في المضخة.
      ملاحظه. من المهم جدا إزالة فقاعات الهواء حتى يعمل النظام بشكل صحيح.
    4. خذ الوحدة السائلة مع ضبط التروية المركبة على غطاء التدفق الصفحي وأرفق الشرائح بطبقة أحادية الخلية المتقاربة.
    5. ضع الوحدة السائلة مع التروية المركبة والشرائح مع الخلايا في الحاضنة وقم بتوصيل الكابل الكهربائي بالمضخة.
    6. في برنامج التحكم في المضخة ، قم بإعداد المعلمات التالية: لزوجة الوسط (0.0072) ، ونوع الشريحة ، وعامل معايرة مجموعة التروية ، ومعدل إجهاد القص (20 dyn / cm2) ، ونوع التدفق (أحادي الاتجاه) ، والوقت (72 ساعة) ، وابدأ التدفق (انظر تعليمات الجهاز لمزيد من التفاصيل). حصاد الخلايا المعالجة بنفس الوسائط دون التعرض للتدفق كضوابط ثابتة.
    7. بعد اكتمال التحفيز ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني واستمر في حصاد العينات وفقا للفحص المطلوب. بالنسبة للتلطيخ بالفلورسنت ، انظر الخطوة 2.3.1 ، ولاستخراج الحمض النووي الريبي ، انظر الخطوة 2.3.2.
  3. إثبات فعالية بروتوكول إجهاد القص
    1. تلطيخ الفلورسنت لخيوط الأكتين (F-actin)
      1. إصلاح الخلايا ونفاذها كما هو موضح في الخطوات 1.4.2-1.4.6. استخدم حجم 100 ميكرولتر في شريحة μ.
      2. قم بتلطيخ F-actin باستخدام phalloidin المسمى بالفلورسنت (مخفف عند 1: 200 في PBS) وقم بتلطيخ النواة باستخدام DAPI (التركيز النهائي 1 مجم / مل في PBS) لمدة 2 ساعة في RT ، محمي من الضوء.
      3. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
      4. مراقبة الخلايا تحت المجهر مضان.
        ملاحظة: تم اكتشاف DAPI باستخدام مكعب ضوء DAPI (مثال: 335-379 نانومتر; Em: 417-477 نانومتر) ويتم الكشف عن phalloidin باستخدام مكعب ضوء GFP (على سبيل المثال: 459-481 نانومتر ؛ Em: 500-550 نانومتر). مكعبات الضوء ذات النطاق المماثل من الطول الموجي للإثارة / الانبعاث كافية أيضا لهذه الفلوروكرومات. إذا تم استخدام الفلوروكرومات الأخرى ، فتحقق مما إذا كان المجهر المستخدم يحتوي على مجموعات مرشحات مناسبة لاكتشافها.
    2. التعبير الجيني عن طريق النسخ العكسي الكمي في الوقت الفعلي (RT-qPCR)
      1. اجمع الخلايا من شريحة μ مع 350 ميكرولتر من مخزن تحلل تجاري يحتوي على جوانيدين ثيوسيانات. اعزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعات الاستخراج القائمة على العمود ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
        ملاحظة: نظرا للعدد المحدود من الخلايا المزروعة في شريحة μ ، يوصى باستخدام استخراج الحمض النووي الريبي المستند إلى العمود.
      2. قم بإعداد cDNA باستخدام مجموعة تخليق cDNA مع إنزيم عكسي للنسخ ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      3. تحقق من التعبير عن الجين (الجينات) التي ينظمها إجهاد القص: KLF2 و KLF4 و NOS3. استخدم جين مدبرة المنزل PPIA / cyclophilin لتطبيع النتائج. يتم سرد البادئات المحددة للتفاعل في الجدول 1.
      4. قم بإجراء RT-qPCR باستخدام مجموعة صبغ الحمض النووي الفلوري الأخضر SYBR في ظل ظروف التفاعل التالية: i) 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، ii) 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، iii) 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، iv) 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، v) 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. كرر الخطوات من الثالث إلى الخامس لمدة 40 دورة. أضف خطوة ذوبان في نهاية التفاعل للتحقق من خصوصية التمهيدي.

3. تمتد دوري على hSVECs

  1. اعداد
    1. ضع مادة تشحيم قائمة على السيليكون على قمم وجوانب محطة التحميل المتوازنة ذات 6 آبار مقاس 25 مم.
      ملاحظة: هذا يقلل من الاحتكاك بين غشاء لوحة الاستزراع والمحطة ، مما يسمح بتوزيع أفضل للسلالة الدورية. يجب القيام بهذه الخطوة قبل كل تجربة.
  2. تجربة التمدد الدوري
    1. البذور 4 × 105 خلايا معلقة في 3 مل لكل بئر من ألواح الاستزراع ذات القاع المرن ذات 6 آبار المطلية بالكولاجين I (جدول المواد). خطط للحصول على لوحة (لوحات) في حالة ثابتة كمجموعة تحكم. احتفظ بالخلايا في الحاضنة (37 درجة مئوية في الهواء المرطب مع 5٪ CO2) حتى تصل إلى التقاء 100٪ (عادة بعد 48 ساعة من البذر). قبل بدء بروتوكول التمدد ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا وأضف 3 مل من وسط الاستزراع الطازج لكل بئر.
    2. أدخل الصفيحة الأساسية مع جميع محطات التحميل المشحمة في الحاضنة وقم بتوصيل الأنبوب بشكل مناسب بمعدات التحكم في نظام المفاعل الحيوي لتمديد خلايا التوتر (انظر تعليمات المعدات لمزيد من التفاصيل).
    3. قم بتوصيل كل لوحة ثقافة بحشية حمراء واحدة ، يوفرها نظام المفاعل الحيوي لتمديد خلايا التوتر. ثم ضعها في الصفيحة داخل الحاضنة.
      1. تأكد من تثبيت الألواح بالكامل وضغطها وإغلاقها على الصفيحة الأساسية لتجنب تسرب الهواء أثناء ضخ التفريغ. من المهم أن يكون لديك جميع لوحات الاستزراع الأربعة في الصفيحة الأساسية للحصول على الفراغ المناسب وتحميل التمدد.
      2. في حالة وجود عدد أقل من اللوحات التجريبية ، استخدم لوحة (لوحات) فارغة لإكمال المواضع الأربعة في الصفيحة الأساسية. أضف لوح الأكريليك (المرفق مع الجهاز) أعلى ألواح الاستزراع لتحسين ختم الصفيحة الأساسية. ضع الألواح الثابتة في نفس الحاضنة.
    4. قم بتشغيل معدات التحكم ونظام الكمبيوتر. افتح رمز البرنامج وقم بتكوين النظام المطلوب: حجم محطة التحميل المراد استخدامها ، ونوع الإجهاد ، ونسبة الاستطالة ، وشكل الموجة ، والتردد ، والوقت. للحصول على معلومات مفصلة ، راجع إرشادات الشركة المصنعة. حدد النظام وقم بتنزيله. هنا ، تم استخدام النظام التالي: 1/2 شكل موجة الجيوب الأنفية ، تردد 1 هرتز ، 5 ٪ من الاستطالة (لتقليد التمدد الوريدي) ، و 15 ٪ من الاستطالة (لتقليد التمدد الشرياني) حتى 72 ساعة.
    5. قم بتشغيل نظام الفراغ وانقر فوق ابدأ على شاشة الكمبيوتر لتشغيل التمدد. تحقق مما إذا كان غشاء السيليكون يتحرك ويمتد الخلايا.
    6. بعد اكتمال التحفيز ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني واستمر في حصاد العينات وفقا للفحص المطلوب. هنا ، لإثبات فعالية التمدد الدوري ، اجمع وسط ثقافة hSVEC ، واحتفظ به عند -80 درجة مئوية لمزيد من قياس أكسيد النيتريك (NO) ، وقم بإصلاح الخلايا لتلطيخ الفلورسنت.
      ملاحظه. لا يمكن تخزين الصفيحة داخل الحاضنة عندما لا تكون قيد الاستخدام ؛ خلاف ذلك ، يمكن لدرجة الحرارة تعديل الشكل المسطح وجعله عديم الفائدة.
  3. إثبات فعالية بروتوكول التمدد الدوري
    1. تلطيخ الفلورسنت من F-actin
      1. إصلاح الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.4.3. استخدم حجم 1 مل لكل بئر.
      2. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. حافظ على الخلايا في برنامج تلفزيوني حتى لا تجف أثناء تحضير غشاء السيليكون للخطوات التالية.
      3. استخدم قطعة قطن لإزالة مادة التشحيم الزائدة القائمة على السيليكون من أسفل الغشاء. ثم ، ضع منظف النوافذ أو صابون اليد برفق باستخدام قطعة قطن جديدة. كرر العملية حتى تتم إزالة جميع مواد التشحيم من الغشاء. ثم نظف بالماء منزوع الأيونات.
        ملاحظه. من المهم إزالة مادة التشحيم تماما من غشاء السيليكون للحصول على صور مجهرية ذات نوعية جيدة.
      4. قم بقطع أغشية السيليكون بعناية إلى قطع صغيرة لتناسب شرائح غرفة 8 بئر للتلطيخ. تخلل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.4.5.
      5. بعد خطوات الغسيل ، قم بتلطيخ F-actin باستخدام phalloidin والنواة باستخدام DAPI. انتقل إلى التحليل ، كما هو موضح في الخطوتين 2.3.1.2 و 2.3.1.3. استخدم حجم 0.3 مل لكل غرفة جيدا.
      6. قم بإزالة غرفة الوسائط باستخدام الفاصل. ضع قطرة واحدة من الكاشف المتوسط المتصاعد (50٪ جلسرين في PBS) وضع شريحة زجاجية (24 مم × 60 مم).
      7. مراقبة الخلايا تحت المجهر مضان.
        ملاحظة: تم اكتشاف DAPI باستخدام مكعب ضوء DAPI (مثال: 335-379 نانومتر; Em: 417-477 نانومتر) ويتم الكشف عن phalloidin مع مكعب ضوء البروتين الفلوري الأحمر (RFP) (مثال: 511-551 نانومتر ؛ Em: 573-613 نانومتر). مكعبات الضوء ذات النطاق المماثل من الطول الموجي للإثارة / الانبعاث كافية أيضا لهذه الفلوروكرومات. إذا تم استخدام الفلوروكرومات الأخرى ، فتحقق مما إذا كان المجهر المستخدم يحتوي على مجموعات مرشحات مناسبة لاكتشافها.
    2. لا يوجد قياس مقدر بتراكم النتريت (NO2) في الوسط المكيف hSVEC باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي المختزلة القائمة على يوديد البوتاسيوم
      1. اعداد
        1. قم بإعداد منحنى قياسي من 0.01-10 mM من محلول نتريت الصوديوم (NaNO2 في الماء عالي النقاء).
        2. أضف 5 مل من حمض الأسيتيك و 1 مل من يوديد البوتاسيوم (50 مجم في 1 مل من الماء عالي النقاء) في وعاء التطهير لمحلل أكسيد النيتريك.
      2. لا قياس
        1. أضف 20 ميكرولتر من منحنى NaNO2 القياسي في وعاء التطهير لمحلل أكسيد النيتريك. قم بقياسه وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. أضف 20 ميكرولتر من الوسط المكيف إلى وعاء التطهير لمحلل أكسيد النيتريك. قم بقياسه وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    4. احسب تركيزات NO2 بناء على معايرة المنحنى القياسي. اضبط القيم التي تم الحصول عليها من خلال الحجم الكلي للوسيط المشروط الذي تم تحليله 6,11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عادة ، يمكن ملاحظة ECs الملتصقة بعد 3-4 أيام من الاستخراج. تشكل hSVECs في البداية مجموعات من الخلايا وتعرض مورفولوجيا "مرصوفة بالحصى" نموذجية (الشكل 1 ب). يعبرون عن علامات EC CD31 (الشكل 1C ، D) و VE-cadherin (الشكل 1D). يمكن نشر hSVECs بسهولة على طبق زراعة الخلايا المعالجة غير المطلي ، وتحتفظ بالنمط الظاهري البطاني في الثقافة حتى ثمانية ممرات.

hSVECs ، عند استزراعها تحت إجهاد القص ، محاذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يجب أن يكون جزء الوريد الصافن 2 سم على الأقل لعزل hSVECs بنجاح. يصعب التعامل مع الأجزاء الصغيرة وربط نهايات الوعاء للحفاظ على محلول كولاجيناز لعزل الخلايا. لا تنتج مساحة سطح اللمعية المخفضة خلايا كافية لتوسيع الثقافة. لتقليل مخاطر التلوث بغير ECs ، يجب أن يكون التلاعب بجزء الوريد الصافن لطيفا جدا أثناء الإجراء بأكمله. من المهم توخي الحذر عند إدخال أطراف الماصة في الأسطح اللمعة لإزالة الدم وأثناء إدخال محلول الكولاجيناز. يجب التحكم في التعرض لمحلول الإنزيم بشكل جيد للغاية (لا يزيد عن 1 ساعة) لتقليل تلوث الثقافة بغير ECs. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

يتم دعم JEK بمنح من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 and 2013/17368-0] و Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 و 309179/2013-0). يتم دعم AAM بمنح من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) و Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911 / 2021-9).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ Trypsin-0.02٪ حل EDTAGibco25200072
15 & micro الشريحة I 0.4 Luer نفس المصدر80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571
6-آبار محطة تحميل متساوية المحور من 25 مم شركة فليكسيل الدوليةLS-3000B25. شريحة غرفة VJW
ذات 8 آبار مع بئر قابل للإزالةThermo Fisher Scientific154453
حمض الخليك (الجليدي)Millipore100063
ورقة أكريليك بسمك 1 سمزجاج شبكي
المضاد للجسم المضاد ABCAMab24590
Anti-CD31 ، الجسم المضاد FITCThermo Fisher ScientificMHCD3101
الأجسام المضادة للجسم المضاد للفيرويس كاديرينالخلية2500
لوحة Bioflex الكولاجين IFlexcell International CorporationBF3001C
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA8412
خياطة قطنية EP 3.5 15 × 45 سمBrasutureAP524
Cyclophilin إلى الأمام التمهيديThermo Fisher ScientificCustom صمم
Cyclophilin التمهيدي العكسيThermo Fisher Scientificمصمم
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma-AldrichD4540
EBM-2 المتوسط القاعديLonzaCC3156
EGM-2 مكملات SingleQuotsLonzaCC4176
مصل الأبقار الجنيني (FBS)ثيرمو فيشر العلمي2657-029
نظام الشد Flexcell FX-5000Flexcell International CorporationFX-5000T
Fluoromount متوسط تركيب مائيSigma-AldrichF4680
الجيلاتين من جلد الخنازيرSigma-AldrichG2500
GlycerolSigma-AldrichG5516
الماعز المضاد للفأر IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11001
الماعز المضادة للأرانب IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11008
الهيبارين الصوديوم من الغشاء المخاطي المعوي للخنازير 5000 وحدة دولية / ملBlau Farmac & ecirc ؛ uticaSKU 68027
نظام مضخة Ibidi (مضخة + وحدة موائع)Ibidi10902
KLF2 التمهيدي الأماميThermo Fisher Scientificمصمم
KLF2 التمهيدي العكسيThermo Fisher Scientificمصمم
KLF4 التمهيدي الأماميThermo Fisher Scientificمصمم
KLF4 التمهيدي العكسيThermo Fisher Scientificمصمم
NOA 280 محلل أكسيد النيتريكSievers InstrumentsNOA-280i-1
NOS3 التمهيدي الأماميThermo Fisher Scientificمصمم
NOS3 التمهيدي العكسيThermo Fisher Scientificمصمم
خصيصا Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
طقم التروية 15 سم ، معرف 1.6 مم ، أحمر ، 10 مل خزاناتIbidi10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA12380
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4Thermo Fisher Scientific10010031
يوديدالبوتاسيومSigma-Aldrich221945
QuanTitec SYBR مجموعة PCR الخضراءQiagen204143
QuantStudio 12K flex platform Applied Biosystems4471087
RNeasy micro kit  منزلق Quiagen74004
(24 مم × 60 مم)زجاج التريكوVD12460Y1D.01
نتريت الصوديومSigma-Aldrich31443
SuperScript IV نظام توليف الخيط الأولThermo Fisher Scientific18091200
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Trypan Blue stain 0.4٪Gibco15250-061
النوع الثاني من الكولاجيناز من المطثية النوسجيةسيجما ألدريتشC6885
إشارات محلول خصيصاخصيصاخصيصاخصيصاخصيصاخصيصازجاج

المراجع

  1. Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
  2. Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
  3. Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
  4. Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133(2020).
  5. Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
  6. Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493(2021).
  7. Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
  8. Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
  9. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  10. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413(2020).
  11. Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
  12. Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
  13. Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
  14. Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
  15. Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية والتعرض لمستويات مضبوطة من إجهاد القص والتمدد
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.