مقالة منهجية

توحيد مقايسة حبة القياس الخلوي على أساس الأجسام المضادة لصفار البيض

DOI:

10.3791/65123

⸱

مايو 19, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول منهجية لإعداد حبات اللاتكس للمقايسات باستخدام الأجسام المضادة IgY للكشف عن المستضد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقايسات المناعية هي اختبارات مهمة للكشف عن العديد من الأهداف الجزيئية. من بين الطرق المتاحة حاليا ، اكتسب فحص حبة القياس الخلوي أهمية في العقود الأخيرة. يمثل كل كرة مجهرية يقرأها الجهاز حدثا تحليليا لقدرة التفاعل بين الجزيئات قيد الاختبار. تتم قراءة الآلاف من هذه الأحداث في اختبار واحد ، وبالتالي ضمان دقة عالية في الفحص وقابلية الاستنساخ. يمكن أيضا استخدام هذه المنهجية في التحقق من صحة المدخلات الجديدة ، مثل الأجسام المضادة IgY ، لتشخيص الأمراض. يتم الحصول على هذه الأجسام المضادة من خلال تحصين الدجاج بالمستضد محل الاهتمام ثم استخراج الغلوبولين المناعي من صفار بيض الحيوانات. لذلك ، هذه طريقة غير مؤلمة ومثمرة للغاية للحصول على الأجسام المضادة. بالإضافة إلى منهجية للتحقق عالي الدقة من قدرة التعرف على الأجسام المضادة لهذا الفحص ، تقدم هذه الورقة أيضا طريقة لاستخراج هذه الأجسام المضادة ، وتحديد أفضل ظروف اقتران للأجسام المضادة وخرز اللاتكس ، وتحديد حساسية الاختبار.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من بين تقنيات المقايسة المناعية التي تهدف إلى تشخيص الأمراض ، ظهر فحص حبة القياس الخلوي كنهج حساس للغاية وموثوق ، لأنه يسمح بتحليل آلاف الجسيمات في اختبار واحد1. هذه التقنية ، بالإضافة إلى الإنتاجية العالية والسماح باستخدام كميات أصغر من العينات ، تقدم أيضا مرونة كبيرة ، لأنها تسمح باكتشاف العديد من الجزيئات ، مثل السيتوكينات وجزيئات الالتصاق والأنماط المتماثلة للأجسام المضادة والبروتينات 2,3.

يتم استخدام جزيئات مختلفة لتطوير هذه المقايسات ، من بينها حبات اللاتكس ، والتي تعد مدخلات فعالة ومنخفضة التكلفة. يمكن أن تقدم هذه التعديلات على سطحها ، مثل وجود مجموعات وظيفية أو بروتينات تسمح بالاقتران التساهمي أو غير التساهمي لجزيئات معينة3،4،5.

تستخدم هذه المقايسات المناعية مكونات مثل المستضدات والأجسام المضادة لإجراء الكشف عن علامات المرض وعادة ما تتطلب أجساما مضادة من الثدييات مثل الفئران والأرانب والماعز. هذا يخلق مشاكل تتعلق بالقضايا الأخلاقية ، لأن تحصين الثدييات يتطلب عموما العديد من الحيوانات للحصول على عائد جيد ، وكذلك الأداء المتكرر للإجراءات التي تؤدي إلى معاناة الحيوانات 6,7. بديل لذلك هو استخدام الأجسام المضادة IgY المعزولة من صفار البيض من الدجاج المحصن ، حيث يمكن العثور على تركيزات عالية من الأجسام المضادة المحددة ضد المستضدات الملقحة في صفار البيض. إنتاج الدجاج يعادل إنتاج 4.3 أرانب على مدار عام 6,7.

وبالتالي ، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو توفير طريقة لتقييم الأجسام المضادة IgY التي تم الحصول عليها من صفار بيض الدجاج باستخدام قياس التدفق الخلوي مع حبات اللاتكس. لهذا ، نقترح طريقة توحيد للمقايسة المناعية للخرزة الخلوية في شكل شطيرة باستخدام حبات اللاتكس. كنموذج ، استخدمنا الأجسام المضادة IgY الموجهة إلى مستضد البروتين الثاني الغني بالمتصورة المنجلية (IgY-Pf HRP2). نصف طريقة لاستخراج الأجسام المضادة ، ونناقش الخطوات الحاسمة لتحديد تركيز اقتران هذه الأجسام بخرز اللاتكس ، ونقدم تقييما لحدود اكتشاف المستضد. الدقة العالية لقياس التدفق الخلوي ، إلى جانب التكلفة المنخفضة لخرز اللاتكس ، تجعل هذه التقنية قابلة للتطبيق لتحليل أدوات المقايسة المناعية ، مثل الأجسام المضادة والمستضدات. يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن أهداف متنوعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. استخراج IgY من صفار البيض

  1. صحة البيض
    1. اغمر البيض (الذي تم وضعه حديثا أو حتى 4 أيام بعد وضعه ، من سلالة Gallus gallus Dekalb White) في محلول مخفف بنسبة 0.2٪ من هيبوكلوريت الصوديوم ، واشطفه بسرعة تحت الماء الجاري ، وامسحه برفق للاستخدام لاحقا أو الفوري.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدامه على الفور ، احتفظ به عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 15 يوما.
  2. فصل صفار البيض
    1. كسر البيض بعناية ، وفصل صفار البيض عن الأبيض بمساعدة فاصل صفار البيض.
    2. قم بإزالة اللون الأبيض الزائد بمساعدة ورق الترشيح. بيرس صفار البيض ، وجمع الداخل في أنبوب مخروطي 50 مل. قم بتخزين الصفار في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
      ملاحظة: خلال هذه التجارب (البيانات غير معروضة) ، لوحظ أن استخدام صفار البيض الذي لم يتم تجميده سابقا أعاق عزل الغلوبولين المناعي من الجزء الدهني من الصفار.
  3. تحمض صفار البيض
    1. قم بإذابة صفار البيض المخزن وقم بتخفيفه بنسبة 1:10 في 1 مللي مول PBS. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 5 مع 1 N HCl ، واحتضان المحلول عند 4 درجات مئوية لمدة 6-24 ساعة.
    2. قم بطرد المحلول عند 3000 × جم لمدة 40 دقيقة ، واستعد المادة الطافية ، وقم بتصفيتها باستخدام مرشح السليلوز 0.7 مم.
  4. ترسيب الدهون مع حمض الكابريليك
    1. أعد ضبط الرقم الهيدروجيني للطافات إلى 5 ، وأضف حمض الكابريليك (≥98٪ تركيز أولي) إلى تركيز نهائي قدره 8.7٪ تحت التحريك المستمر لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قد يختلف حجم المادة الطافية اعتمادا على كتلة الدهون المترسبة في الخطوة 1.3.2. وهكذا ، على سبيل المثال ، يجب إضافة 3.107 مل من حمض الكابريليك إلى 35 مل من المادة الطافية التي تم الحصول عليها بعد الترشيح.
    2. أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 15 دقيقة عند 18600 × جم ، وفصل المادة الطافية عن المادة المترسبة.
    3. أعد ضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 7.4 باستخدام 1 M NaOH ، وحدد كمية الأجسام المضادة باستخدام اختبار برادفورد8 ، وقم بتخزين الأجسام المضادة عند -20 درجة مئوية حتى وقت الاستخدام.
      ملاحظة: تم الحصول على الأجسام المضادة بتركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر ، والذي تم التحقق منه عن طريق هلام SDS-PAGE بنسبة 12٪.

2. منحنى تشبع الأجسام المضادة IgY إلى حبات اللاتكس

  1. اقتران الخرز بالأجسام المضادة IgY
    1. أضف 21 ميكرولتر من 1-إيثيل-3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد (EDC ، تركيز أولي 367 مللي مول) و 21 ميكرولتر من N-hydroxysuccinimide (NHS ، تركيز أولي 50 مللي مول) إلى 21 ميكرولتر من حبات اللاتكس (4٪ وزن / حجم) ، واضبط على الحجم النهائي البالغ 2.1 مل مع 10 مللي مول PBS المصفاة.
      ملاحظة: يجب أن يكون نطاق الأس الهيدروجيني لمحلول PBS بين 7.2 و 7.4 ، لأنه في هذا العمل ، لوحظ تغيير سلبي في أداة التوصيل والخطوات الأخرى عند استخدام محلول خارج هذا النطاق.
    2. احتضان في 22 درجة مئوية مع اهتزاز سريع لمدة 3 ساعات.
    3. أضف 4 ميكروغرام و 2 ميكروغرام و 1 ميكروغرام و 0.5 ميكروغرام و 0.25 ميكروغرام و 0.125 ميكروغرام و 0 ميكروغرام من الجسم المضاد المستخرج مسبقا IgY-PfHRP2 (انظر الخطوة 1.4.3) إلى أنابيب دقيقة مختلفة تحتوي على 100 ميكرولتر من المحلول الموصوف في الخطوة 2.1.1 (تركيز حبة نهائي 0.04٪) ، واحتضان تحت نفس الظروف كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 لمدة 16 ساعة.
    4. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 857 × جم عند 15 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المواد الطافية ، واغسل حبات اللاتكس مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من 10 mM PBS المصفى (تركيز الخرزة النهائية 0.008٪) باستخدام دورات الطرد المركزي وإعادة التعليق.
      ملاحظة: لا تتجاوز 857 × جم ، كما هو الحال في هذا العمل ، لوحظ أنه بعد هذه السرعة تخضع الحبيبات لتشوهات تغير نتيجة الاختبار سلبا.
  2. سد الخرز
    1. أعد تعليق العينات في 1 مل من المخزن المؤقت للحظر (تركيز حبة نهائي 0.004٪) (تمت تصفيته 10 مللي مول PBS + ألبومين مصل البقر ، BSA ، 5٪) ، واحتضانها في نفس الظروف الموضحة في الخطوة 2.1.2 لمدة ساعتين.
    2. بعد الحظر ، اغسل كما هو موضح في الخطوة 2.1.4 ، وأعد التعليق في مخزن مؤقت 10 مللي متر PBS.
  3. الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للدجاج المسمى Alexa Fluor 488
    1. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الفلورية المضادة للدجاج (2 مجم / مل) مخففة إلى 1: 2,000 في 10 مللي مول PBS + 0.5٪ BSA لكل أنبوب دقيق ، كما هو موضح في الخطوة 2.1.3.
    2. احتضان العينات كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 ، هذه المرة في الظلام ، لمدة 30 دقيقة.
    3. اغسل الخرزات كما في الخطوة 2.1.4 ، وأعد التعليق ب 250 ميكرولتر من (تركيز الخرزة النهائية 0.016٪) المصفاة 10 مللي متر PBS. قم بإجراء قراءة مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في القسم 5.
      ملاحظة: من بيانات النسبة المئوية للتألق التي تم الحصول عليها ، لاحظ النقطة الأولية لتشكيل الهضبة (1 ميكروغرام ، كما لوحظ في هذه الدراسة). نوصي باستخدام النقطة الثانية للهضبة (2 ميكروغرام ، كما لوحظ هنا) للخطوات التالية (الشكل 1).

figure-protocol-1
الشكل 1: رسم بياني لتحليل قياس التدفق الخلوي لتحديد نقطة تشبع اقتران الجسم المضاد IgY-Pf HRP2 بحبات اللاتكس. يمثل المحور السيني تركيز الأجسام المضادة ، ويمثل المحور Y النسبة المئوية للتألق الذي تم الحصول عليه. اختبار كروسكال واليس ، ص < 0.0033. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. فحص قياس التدفق الخلوي على أساس حبات اللاتكس للكشف عن المستضد

  1. بعد تحديد نقطة تشبع الأجسام المضادة IgY إلى حبات اللاتكس ، قم بإجراء عملية تنشيط الخرزة مرة أخرى ، وفقا للخطوة 2.1.1.
    1. قم بإقران الخرزات عند تركيز التشبع المرصود (كما هو موضح في الخطوة 2.1.3) ، واحتضانها وفقا للخطوة 2.1.2.
      ملاحظة: في المقايسات التي أجريت باستخدام الجسم المضاد IgY-PfHRP2 ، كانت حالة التشبع 2 ميكروغرام لكل 1 ميكرولتر من حبات اللاتكس.
  2. سد وغسل الخرز وفقا للخطوة 2.2.
  3. الحضانة مع المستضد
    1. لتحديد حد الكشف ، قم بتوزيع ما يعادل 100 ميكرولتر من مستحضر الخرزة المحظورة في أنابيب تحتوي على كميات مختلفة من البروتين المؤتلف Pf HRP2 (1 ميكروغرام / مل) (r PfHRP2 ، 10 ميكروغرام ، 1 ميكروغرام ، 0.1 ميكروغرام ، 0.01 ميكروغرام ، 0.001 ميكروغرام ، 0.0001 ميكروغرام ، و 0 ميكروغرام) مخففة في 10 مللي مول PBS + 0.5٪ BSA في ثلاث نسخ.
      ملاحظة: تم تطوير هذا البروتين المؤتلف في عمل Sousa et al.9.
    2. احتضان محاليل الخرزة ببروتين rPfHRP2 كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 لمدة 1 ساعة.
    3. قم بإجراء عمليات الغسيل كما هو موضح في الخطوة 2.1.4 ، وتخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي.
  4. الحضانة مع الجسم المضاد الأساسي
    1. أضف 2 ميكروغرام من الجسم المضاد IgG للفأر ضد بروتين rPfHRP2 المخفف في 10 mM PBS + 0.5٪ BSA إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر في كل عينة. احتضان العينات كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 ، وتخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي الأخير.
      ملاحظة: تم تطوير هذا الجسم المضاد في عمل Sousa et al.9.
  5. الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي
    1. أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الفلورية المضادة للفأر (2 مجم / مل) مخففة إلى 1: 2000 في 10 مللي مول PBS + 0.5٪ BSA لكل عينة. احتضان كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 ، وإعادة التعليق في 250 ميكرولتر (تركيز حبة نهائية 0.016٪) من 10 مللي مول PBS المصفاة. قم بإجراء القراءة وفقا للقسم 5.

4. قراءة مقياس التدفق الخلوي للعينات

  1. إعداد قياس الخلايا: محاذاة المعلمات البصرية لمقياس الخلايا المقترنة بجهاز كمبيوتر
    1. قم بتشغيل الكمبيوتر ومقياس التدفق الخلوي ، وانتظر بضع دقائق حتى يتصل الجهاز بالكمبيوتر.
    2. انقر فوق برنامج قياس الخلايا المثبت على الكمبيوتر وقم بتسجيل الدخول إليه. من مساحة عمل البرنامج، حدد مقياس الخلايا | بدء التشغيل | الوضع النظيف | سوائل الحشرة العقيمة.
      ملاحظة: يجب إزالة فقاعات الهواء والعوائق أثناء عملية بدء مقياس الخلايا قبل الحصول على العينة.
  2. مراقبة الجودة
    1. استخدم كاشف مراقبة الجودة للتحقق من الفولتية لأنابيب المضاعف الضوئي وتقييم حساسية مقياس الخلايا.
    2. ضع كاشف إعداد مقياس الخلايا وخرز التتبع في أنبوب بوليسترين مغطى مقاس 12 مم × 75 مم.
    3. امزج الأنبوب برفق عن طريق الدوامة.
  3. تحضير حبات التعليق
    1. لتحديد خط الأساس ، أضف 0.5 مل من المادة المخففة (10 مللي متر PBS المصفى ، درجة الحموضة 7) وثلاث قطرات من الخرز إلى أنبوب البوليسترين المغطى 12 مم × 75 مم. دوامة الأنبوب بلطف قبل الاستخدام.
    2. في مساحة عمل برنامج مقياس الخلايا، حدد مقياس الخلايا | CST ، وانتظر حتى ينفصل مقياس الخلايا عن واجهة برنامج مقياس الخلايا ويتصل بواجهة CS&T. لاحظ الرسالة التالية على شريط حالة برنامج مقياس الخلايا في أسفل الشاشة: مقياس خلوي غير متصل.
    3. استخدم أنبوب البوليسترين المتوج 12 مم × 75 مم الذي يحتوي على كاشف مراقبة الجودة وقم بإرفاقه بمسبار مقياس التدفق الخلوي.
  4. التحقق من تكوين مقياس الخلايا
    1. في نافذة ملخص النظام ، تحقق من أن تكوين مقياس الخلايا مناسب للتجربة.
  5. الإعداد لفحص الأداء
    1. حدد معرف خرز الإعداد المقابل لكمية حبات البحث CS&T .
  6. فحص الأداء
    1. قم بتوصيل الأنبوب بمسبار مقياس التدفق الخلوي ، وانقر فوق نافذة التحكم في الإعداد . حدد التحقق من الأداء ، وانقر فوق تشغيل.
    2. بمجرد اكتمال فحص الأداء ، انتظر حتى يتم فتح مربع حوار. قم بأحد الإجراءات التالية:
      1. لعرض تقرير أداء مقياس الخلايا ، انقر فوق عرض التقرير.
      2. لإكمال فحص الأداء والعودة إلى عرض الإعداد لمساحة العمل ، انقر فوق إنهاء.
      3. لاحظ النتيجة النهائية لتحليل الحساسية المورفومترية والفلورية التي تظهر في ملخص النظام | نتيجة أداء مقياس الخلايا مع الحالة تم النجاح.
      4. قم بإزالة الأنبوب من مقياس الخلايا. تحقق من نتائج أداء مقياس الخلايا المعروضة في نافذة ملخص النظام .

5. تحليل العينات باستخدام قياس التدفق الخلوي

  1. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج مقياس الخلايا.
    1. من مساحة عمل برنامج مقياس الخلايا، حدد مقياس الخلايا | الوضع النظيف | سوائل الحشرة العقيمة.
    2. اضبط على مساحة عمل البرنامج.
    3. تحديد استراتيجية البوابات بناء على الخصائص المورفومترية والفلورية لجسيمات التحكم السلبي (حبات بدون مضان).
    4. لتحديد مورفومترية الخلية ، اختر رسم رسم الرسم النقطي لتحليل معلمات FSC-A باستخدام SSC-A (الشكل التكميلي 1A).
    5. حدد الخلايا المفردة بواسطة SSC باستخدام رسم مخطط المؤامرة النقطية لتحليل SSC-H في المحور y و SSC-W في المحور x (الشكل التكميلي 1B) ، وحدد الخلايا المفردة بواسطة FSC باستخدام رسم مخطط المؤامرة النقطية لتحليل FSC-H في المحور y و FSC-W في المحور x (الشكل التكميلي 1C).
    6. بالنسبة لتحليلات التألق ، اختر FL1 Dot Plot Plots باستخدام FCS-A. استخدم أنبوب بوليسترين متوقف مقاس 12 مم × 75 مم يحتوي على عينات غير مصنفة وعينات تم تصنيفها مسبقا باستخدام Alexa Fluor 488 أحادي اللون (الشكل التكميلي 1D ، E).
  2. الحصول على العينة في قياس التدفق الخلوي.
    1. استخدم أنبوب بوليسترين متوقف 12 مم × 75 مم يحتوي على العينات المصنفة مسبقا. امزج محتويات الأنبوب بعناية ، وقم بتوصيل الأنبوب بمسبار مقياس التدفق الخلوي ، وانقر بزر الماوس الأيسر على اكتساب.
    2. لضبط قوة الليزر ، انقر فوق المعلمات ، وفي الخيارات أدناه ، اضبط جهد FSC على 182 فولت وجهد SSC على 236 فولت. لتعيين العتبة ، انقر فوق Cytometer | العتبة ، وفي الخيارات أدناه ، اضبط FSC على 500 فولت.
    3. اضبط بوابة التحليل لتوصيف الجسيمات حسب الحجم والتعقيد ، وكذلك لإجراء تحليل خلية واحدة.
    4. لإزالة التألق الذاتي ، قم بتحليل العينة الخالية من الصبغة التي تحتوي فقط على حبات اللاتكس ، واضبط جهد الكاشف: في الخيارات أدناه ، اضبط جهد FL1 (FITC) على 332 فولت.
    5. اضبط بوابة تحليل التألق بتنسيق رباعي الزوايا من النقطة السالبة الموضحة في الرسم البياني النقطي.
    6. بعد ضبط التحليلات المورفومترية والفلورية ، قم بتكوين الجهاز ل 50000 حدث: ضمن الاستحواذ ، انقر فوق تسجيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم الشكل 2 تمثيلا بيانيا لعملية استخراج الأجسام المضادة IgY عن طريق التحمض ، متبوعا بالفصل باستخدام حمض الكابريليك (الشكل 2).

figure-results-1
الشكل 2: تمثيل تخطيطي لخطوة استخلاص الأجسام المضادة IgY وفصلها باستخدام حمض الكابريليك. أ: فصل صفار البيض، وا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة ترسيب الجسم المضاد IgY عن طريق تقليل الأس الهيدروجيني متبوعا بفصل الدهون باستخدام حمض الكابريليك فعالة في عزل الأجسام المضادة الكلية دون أي خسارة في الوظائف. الطريقة المقترحة هنا أبسط وأرخص من تلك التي أبلغ عنها Redwan et al.11 ، والتي استخدمت أيضا الترسيب عن طريق التحمض وحمض الكابريليك ولكن مع بروتوكول أكثر تعقيدا وشاقة. تقدم هذه الطريقة أيضا مزايا على المنهجيات شائعة الاستخدام لعزل IgY من صفار البيض ، مثل تلك التي تستخدم ترسيب PEG 12،13 ، وكبريتات الصوديوم 14،15 ، والكلوروفورم

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب محتمل في المصالح فيما يتعلق بالبحث والتأليف ونشر هذه المقالة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر FIOCRUZ ("برنامج التفوق في مجال العلوم التطبيقية في جامعة أمازوناس الفيدرالية - UFAM) ، و Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) ، ومؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) ، ومؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) لتقديم المنح الدراسية. تم إنشاء الشكل 2 والشكل 4 باستخدام biorender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مضاد للدجاج IgY (H + L) ، ممتص للغاية ، CF & nbsp ؛ 488 A الجسم المضاد المنتج في الحمارSigma-AldrichSAB4600031
IgG المضاد للفأر (H + L) ، F (ab & prime;)2سيجما ألدريتشSAB4600388
BD FACSكانتو الثانيBD BiosciencesBF-FACSC2
BD FACSDiva CS & حبات البحث T (CS& ; حبات البحث)BD Biosciences655050
BD FACSبرنامج 7.0BD Biosciences655677
Bio-Rad فحص البروتين كاشف صبغة التركيزBio-Rad# 5000006
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA4503
حمض الكابريليكSigma-AldrichO3907
طرد مركزي 5702 RZ606936
37٪ درجة جزيئية حمضيةNEON02618 NEON
CML لاتكس ، 4٪ وزن / فولتInvitrogenC37253
Megafuge 8RThermo ScientificTS-HM8R
N- (3-Dimethylaminopropyl) -N & Prime ؛ - مسحوق هيدروكلوريد إيثيل كاربوديميد (EDC)سيجما ألدريتشE7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich130672-25G
محلول ملحيمخزن من الفوسفات سيجما ألدريتش1003335620
هيدروكسيد الصوديومAcs CientificaP.10.0594.024.00.27
هيبوكلوريت الصوديومAcs CientificaR09211000
خلاط حراري حراري للحرارة / باردKASVIK80-120R
جهاز كلوريد إيبندورف مخزن

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
  3. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
  4. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  5. Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
  6. Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
  7. Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  9. Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49(2014).
  10. Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
  11. Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956(2021).
  12. Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
  13. Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084(2011).
  14. Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
  15. Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
  16. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
  17. Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
  18. Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986(2015).
  19. Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IgY

مقالات ذات صلة