يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إثراء الحويصلات خارج الخلية الأصلية والمؤتلفة من المتفطرات

2.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65138

⸱

ديسمبر 8, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

يفصل هذا البروتوكول إثراء الحويصلات خارج الخلية المتفطرة الأصلية (mEVs) من الثقافات المحورية للمتفطرة smegmatis (Msm) وكيف يمكن تصميم وإثراء mCherry (مراسل الفلورسنت الأحمر) المحتوي على MSMEVs المؤتلفة. أخيرا ، يتحقق من النهج الجديد مع إثراء MsmEVs التي تحتوي على بروتين EsxA من المتفطرة السلية.

الملخص

معظم البكتيريا ، بما في ذلك المتفطرات ، تولد حويصلات خارج الخلية (EVs). نظرا لأن EVs البكتيرية (bEVs) تحتوي على مجموعة فرعية من المكونات الخلوية ، بما في ذلك المستقلبات والدهون والبروتينات والأحماض النووية ، فقد قامت عدة مجموعات بتقييم الإصدارات الأصلية أو المؤتلفة من bEVs لقوتها الوقائية كمرشحين للقاح الوحدة الفرعية. على عكس المركبات الكهربائية الأصلية ، يتم تصميم المركبات الكهربائية المؤتلفة جزيئيا لتحتوي على واحد أو أكثر من مناعيات الاهتمام. على مدى العقد الماضي ، استكشفت مجموعات مختلفة مناهج متنوعة لتوليد المركبات الكهربائية المؤتلفة. ومع ذلك ، هنا ، نبلغ عن تصميم وبناء وإثراء المركبات الكهربائية المتفطرة المؤتلفة (mEVs) في المتفطرات. نحو ذلك ، نستخدم المتفطرة smegmatis (MSM) ، وهي متفطرة التربة الطيرية كنظام نموذجي. نصف أولا توليد وإثراء المركبات الكهربائية الأصلية ل MSM. بعد ذلك ، نصف تصميم وبناء mEVs المؤتلف التي تحتوي إما على mCherry ، وهو بروتين مراسل فلوري أحمر ، أو EsxA (Esat-6) ، وهو مناعي بارز للمتفطرة السلية. نحقق ذلك عن طريق دمج mCherry و EsxA N-termini بشكل منفصل مع الطرف C لبروتين MSM صغير Cfp-29. Cfp-29 هو واحد من البروتينات القليلة الموجودة بكثرة من MsmEVs. يظل بروتوكول توليد وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة من MSM مطابقا لتوليد وإثراء المركبات الكهربائية الأصلية من MSM.

المقدمة

على الرغم من تطوير وإدارة مجموعة واسعة من اللقاحات ضد الأمراض المعدية ، حتى يومنا هذا ، ~ 30 ٪ من جميع الوفيات البشرية لا تزال تحدث من الأمراض المعدية1. قبل ظهور لقاح السل (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - كان السل هو القاتل الأول (~ 10000 إلى 15000 / 100000 نسمة) 2. مع إعطاء BCG وسهولة الوصول إلى أدوية الخط الأول والثاني المضادة للسل ، بحلول عام 2022 ، انخفضت الوفيات المرتبطة بالسل بشكل كبير إلى ~ 1 مليون / سنة بحلول عام 2022 (أي ~ 15-20 / 100000 نسمة1). ومع ذلك ، في السكان الموبوءين بالسل في العالم ، لا تزال الوفيات المرتبطة بالسل تقف عند ~ 100-550 / 100000 نسمة1. بينما يدرك الخبراء عدة أسباب تؤدي إلى هذه الأرقام المنحرفة ، يبدو أن الحماية بوساطة BCG التي لا تدوم حتى في العقد الأول من العمر هي السبب البارز3،4،5،6،7. ونتيجة لذلك، وبالنظر إلى "أهداف التنمية المستدامة" المتجددة للأمم المتحدة و"استراتيجية القضاء على السل" لمنظمة الصحة العالمية، هناك جهد عالمي متضافر لتطوير بديل لقاح أفضل بكثير من لقاح بوسطن كونسلتينج جروب الذي ربما يوفر حماية مدى الحياة من السل.

ولتحقيق هذا الهدف، تقوم عدة مجموعات حاليا بتقييم سلالات BCG المعدلة/المؤتلفة، والأنواع الفطرية غير المسببة للأمراض والموهنة بخلاف BCG، والوحدات الفرعية المرشحة8،9،10،11،12،13،14،15،16،17،18. عادة ما تكون لقاحات الوحدات الفرعية عبارة عن جسيمات شحمية محملة بشكل انتقائي بعدد قليل من البروتينات المناعية النقية (~ 1-6) كاملة الطول أو مبتورة من العامل الممرض. ومع ذلك ، بسبب طيها الزائف إلى توافقات غير أصلية و / أو تفاعلات عشوائية غير وظيفية بين البروتينات المحملة ، غالبا ما تفتقر الوحدات الفرعية إلى الحلقات الأصلية والوثيقة ، وبالتالي تفشل في تجهيز جهاز المناعة بشكل كاف14،19،20.

وبالتالي ، اكتسبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) للبكتيريا وتيرة كبديل واعد21،22،23،24،25،26. عادة ، تحتوي EVs البكتيرية (bEVs) على مجموعة فرعية من مكوناتها الخلوية ، بما في ذلك بعض أجزاء الأحماض النووية والدهون ومئات المستقلبات والبروتينات27,28. على عكس الجسيمات الشحمية حيث يتم تحميل عدد قليل من البروتينات النقية بشكل مصطنع ، تحتوي bEVs على مئات البروتينات المحملة بشكل طبيعي والمطوية محليا مع ميل أفضل لتجهيز جهاز المناعة ، خاصة بدون تعزيز / مساعدة المواد المساعدة ومستقبلات تشبه الرسوم (TLR)27،28،29. في هذا الخط من البحث ، استكشفنا نحن وآخرون فائدة المركبات الكهربائية المتفطرة كمعززات محتملة للوحدات الفرعية ل BCG30. على الرغم من المخاوف من أن المركبات الكهربائية تفتقر إلى أحمال مستضدات موحدة ، فقد نجحت المركبات الكهربائية من النيسرية السحائية الموهنة في حماية البشر من المكورات السحائية من المجموعة المصليةB 31,32.

من الناحية النظرية على الأقل ، فإن أفضل المركبات الكهربائية التي يمكن أن تعزز BCG بشكل جيد هي المركبات الكهربائية المخصبة من البكتيريا المسببة للأمراض. ومع ذلك ، فإن إثراء المركبات الكهربائية الناتجة عن المتفطرة المسببة للأمراض مكلف ويستغرق وقتا طويلا ومحفوفا بالمخاطر. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون المركبات الكهربائية الناتجة عن مسببات الأمراض أكثر ضراوة من الحماية. بالنظر إلى المخاطر المحتملة ، هنا ، نبلغ عن بروتوكول تم اختباره جيدا لتخصيب المركبات الكهربائية الناتجة عن MSM المزروعة محوريا ، وهي متفطرة طيرية الطيور.

ومع ذلك ، على الرغم من تشفير العديد من تقويم البروتين الممرض ، تفتقر المتفطرات الفيروسية إلى العديد من مستضدات اللقاح / حوامل البروتين المسببة للأمراض اللازمة لتجهيز الجهاز المناعي بشكل كاف نحو الحماية33. لذلك ، استكشفنا أيضا بناء وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة من MSM من خلال الهندسة الجزيئية ، بحيث يجب أن يصل جزء كبير من أي بروتين ممرض مهم يتم التعبير عنه وترجمته في MSM ، إلى EVs. افترضنا أن واحدا أو أكثر من أفضل 10 بروتينات وفيرة من MSM EVs عند دمجها مع البروتين محل الاهتمام سيساعد في هذا النقل.

بينما بدأنا في توحيد إثراء المركبات الكهربائية المتفطرة (mEVs) في مختبرنا ، في عام 2011 ، أبلغ Prados-Rosales et al. لأول مرة عن تصور وإثراء mEVs في المختبر30. في وقت لاحق ، في عام 2014 ، نشرت نفس المجموعة نسخة معدلة من طريقة2011 34. في عام 2015 ، أبلغ Lee et al. أيضا عن طريقة موحدة بشكل مستقل لتخصيب mEV مرة أخرى من الثقافات المحورية للمتفطرات35. من خلال الجمع بين كلا البروتوكولين 34,35 ودمج بعض تعديلاتنا بعد التوحيد الشامل ، نصف هنا بروتوكولا يساعد بشكل روتيني على إثراء mEVs من الثقافات المحورية للبكتيرياالفطرية 36.

هنا ، نفصل بشكل خاص إثراء المركبات الكهربائية الخاصة ب MSM ، وهو امتداد للبروتوكولالمنشور 36 لإثراء المركبات الكهربائية المتفطرة بشكل عام. نحن أيضا بالتفصيل كيفية بناء mEVs المؤتلف (R-mEVs) التي تحتوي على بروتين mCherry (كمراسل فلوري أحمر) و EsxA (Esat-6) 37،38،39 وهو مناعي سائد ووحدة فرعية محتملة لقاح المتفطرة السلية. يظل بروتوكول إثراء R-mEVs مطابقا للبروتوكول الذي وصفناه لإثراء المركبات الكهربائية الأصلية من MSM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ظروف نمو المتفطرة السميغماتية ، الإشريكية القولونية ، ومشتقاتها

  1. وسائط
    1. ميدلبروك 7H9 مرق السائل
      1. قم بإعداد محلول مخزون Tween-80 بنسبة 20٪ عن طريق التسخين المسبق للحجم المطلوب من الماء المقطر المزدوج (ddw) في دورق زجاجي إلى ~ 45-50 درجة مئويةفي الميكروويف ، وأضف الحجم المطلوب من Tween-80 باستخدام أسطوانة قياس مناسبة ، وحركه باستمرار على محرك مغناطيسي صغير لإحضار 20٪ Tween-80 إلى محلول موحد. قم بتصفية 20٪ Tween-80 من خلال مرشح التخلص 0.22 um وقم بتخزين محلول المخزون الأصفر الباهت عند 4 درجة مئوية.
        ملاحظة: يجب نقل جميع آثار Tween-80 في أسطوانة القياس إلى الدورق للحصول على تركيز نهائي دقيق. لا الأوتوكلاف الأسهم توين 80 المعدة. مرشح (استخدام 0.22 ميكرومتر) تعقيم وتخزين في 4 درجة مئوية.
      2. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد مرق 7H9. تعليق 4.7 غرام من مسحوق 7H9 في 900 مل من DDW. أضف 2 مل من الجلسرين ، واخلطي المحتويات ، والأوتوكلاف عند 121 درجةمئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة.
        ملاحظة: لا تقم بإضافة ميدلبروك ADC التخصيب (ADC) و Tween-80 قبل التعقيم.
      3. بعد أن يبرد الوسائط المعقمة إلى درجة حرارة الغرفة (RT ، أي ~ 25 درجةمئوية) ، في خزانة قياسية للسلامة الحيوية من النوع A2 ، أضف بشكل معقم 10x مخزون 100 مل من ADC (النهائي 1x) و 2.5 مل (0.05٪ النهائي) من 20٪ Tween-80. قم بتصفية الخليط من خلال وحدة ترشيح يمكن التخلص منها 0.22 ميكرومتر وقم بتخزين محلول المرق الأخضر المصفر الفاتح والشفاف عند 4 درجاتمئوية.
        ملاحظة: يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للوسائط ~ 6.6 إلى 6.8 (إذا <6.4 أو >7.0 ، فتخلص منه واجعله جديدا). يخزن في درجة حرارة 4 درجاتمئوية (مستقر لمدة 3-4 أسابيع). يوصى بشدة بتصفية وسائط 7H9 (بعد إضافة ADC و Tween-80) مرتين من خلال وحدتي مرشح مستقلتين 0.22 ميكرومتر.
    2. مرق سائل Sauton (الحد الأدنى من الوسائط)
      1. قم بإذابة L-asparagine (0.4٪ وزن / حجم) وحامض الستريك (0.2٪ وزن / حجم) في 950 مل من DDW. أضف 1 مل لكل من مخزون 1000x المحضر حديثا (بالكيلو ووردو) من فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة (عديم اللون ؛ مخزون 10 جم / 20 مل ؛ نهائي 1x 0.5 جم / لتر) ؛ كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتي (عديم اللون ؛ مخزون 10 جم / 20 مل ؛ نهائي 1x 0.5 جم / لتر) ؛ وسترات الأمونيوم الحديديك (بني فاتح جدا ؛ مخزون 1.6 جم / 40 مل ؛ نهائي 1x 0.04 جم / لتر) ويقلب جيدا على محرك مغناطيسي.
        ملاحظة: في أحسن الأحوال ، يمكن أن يكون عمر الأسهم 1,000x أسبوعين ؛ إذا كان أقدم من ذلك ، قم بإعداد مخزون طازج ؛ قم بتخزينها في RT في الظلام (على سبيل المثال ، داخل خزانة / رف). إذا كانت سترات الأمونيوم الحديديك بنية داكنة ، فتخلص منها واجعلها طازجة. من الأفضل إضافة الأملاح الثلاثة بالترتيب المذكور في الخطوة 1.1.2.1. قم بتدوير المحلول في كل مرة قبل إضافة كل محلول ملحي.
      2. قياس وملاحظة الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ؛ تأكد من أنه حوالي 3.1 إلى 3.2. إذا كان الرقم الهيدروجيني أكثر من 3.7 ، فتخلص من الأسهم واستعد طازجا. لضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 ، استخدم العديد من قطرات هيدروكسيد الصوديوم 10 N حسب الحاجة. راقب الرقم الهيدروجيني النهائي مع التحريك المستمر للمحلول / الوسائط على محرك مغناطيسي.
      3. أضف 4.76 مل من الجلسرين ، 0.25 مل من 20٪ توين -80 (النهائي 0.005٪ ، انظر أيضا ملاحظة الخطوة 2.2.1.3) ، وبعد ذلك فقط ، قم بتكوين الحجم إلى 1 لتر. بعد ذلك ، قم بتعقيم المرشح مرتين من 1 لتر من الوسط باستخدام مرشحين منفصلين للتخلص 0.22 ميكرومتر. تخزين واضحة ، عديم اللون وسط في 4 درجة مئوية(مستقرة لمدة 2 أسابيع).
        ملاحظة: فقط بعد ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 ، أضف الجلسرين. خلاف ذلك ، سوف تتحول وسائل الإعلام إلى اللون الأبيض الغائم. إذا كان الجو غائما ، فتخلص منه (لا تحاول تسخينه) وقم بإعداده طازجا. لجميع مستحضرات mEVs ، استخدم Sauton's الطازجة.
    3. قاعدة ميدلبروك 7H11 أجار
      1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للتحضير. تعليق 19 غرام من مسحوق 7H11 في 900 مل من DDW. أضف 5 مل من الجلسرين ، وقم بالدوران على محرك مغناطيسي للحصول على تعليق موحد (أخضر شاحب ؛ درجة الحموضة 6.6 إلى 6.8 ؛ إذا >7.2 ، تخلص منها وحضرها طازجة) ، والأوتوكلاف عند 121 درجةمئوية ، 15 رطل / بوصة مربعة ، ولمدة 20 دقيقة.
        ملاحظة: لا تقم بإضافة ADC و 0.05٪ Tween-80 قبل التعقيم.
      2. عندما يبرد الوسط إلى ~ 50 درجةمئوية ، معقم في خزانة السلامة الحيوية من النوع A2 ، أضف 100 مل من ADC (تم إحضاره إلى RT) و 2.5 مل من 20٪ (0.05٪ نهائي) Tween-80 (تم إحضاره إلى RT). الاستغناء على الفور في أطباق بتري.
        ملاحظة: الألواح مستقرة عند 4 درجاتمئوية لمدة 4-6 أسابيع على الأقل. تأكد من أن الألواح في RT طوال الليل قبل لف الألواح لتخزين 4 درجاتمئوية. خلاف ذلك ، سوف تنحصر الرطوبة في الألواح أثناء الحضانة عند 37 درجةمئوية.
    4. ميلر لوريا بيرتاني (LB) مرق وقاعدة أجار
      1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للتحضير. لتحضير مرق LB ، 25 جم من المسحوق في 1000 مل من DDW وحركه برفق لمدة 5 دقائق في دورق زجاجي على محرك مغناطيسي. عند التعليق الموحد ، قم بتقسيم الأحجام المطلوبة في زجاجات الوسائط (على سبيل المثال ، 300 مل في زجاجة وسائط سعة 500 مل) والأوتوكلاف. لتحضير LB Agar ، 40 جم من المسحوق في 1000 مل من DDW والأوتوكلاف (12 جم من المسحوق في 300 مل DDW في زجاجة وسائط زجاجية سعة 500 مل).
  2. ظروف النمو
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات عمل الاستزراع البكتيري في خزانة السلامة الحيوية (النوع A2). يجب معالجة جميع الثقافات بأنابيب معقمة وقوارير وأطراف ماصة.
    1. اليوم 1
      1. أضف 1 مل من كل من مخزون الجلسرين من MSM (من -80 درجة مئوية في الفريزر) إلى 2 × 10 مل (في أنابيب الطرد المركزي المخروطية المعقمة سعة 50 مل) من مرق 7H9 المعقم حديثا والمبرد والمسخن مسبقا (~ 37 درجة مئوية) ، ودوامة ثلاث مرات ، وأغلق الأغطية ، واحتضان الأنابيب طوال الليل عند 37 درجةمئوية و 200-220 دورة في الدقيقة (شاكر الحاضنة).
        ملاحظة: لزراعة المتفطرة السلية (Mtb) ، اتبع خطوات مماثلة ولكن احتضان أنابيب 50 مل لمدة 4-6 أيام عند 37 درجةمئوية و 120-150 دورة في الدقيقة (شاكر الحاضنة) في إعدادات BSL3. اتبع جميع الإرشادات الدولية وممارسات السلامة الأحيائية لمسببات الأمراض BSL3 و Risk Group 3 أثناء التعامل مع MTB وثقافاته والتخلص منها. استخدم خزانة السلامة الأحيائية من النوع B2 للتعامل مع MTB وثقافاته.
    2. اليوم 2
      1. عندما يصل OD 600 (A600nm ؛ مقياس كثافة الخلية) إلى ~ 1.0 ، يقوم جهاز الطرد المركزي بمزارع MSM لمدة 10 دقائق عند3200 × جم و RT (جهاز طرد مركزي على الطاولة). تخلص من المواد الطافية باستخدام أطراف ماصة معقمة سعة 1 مل.
        ملاحظة: تظل الخطوة أعلاه كما هي بالنسبة لثقافات MTB ، باستثناء أن عدد الأيام هو 4-7. تأكد من عدم لمس الحبيبات البكتيرية بطرف الماصة.
      2. غسل: لكل حبيبات MSM ، أضف 1 مل من وسائط Sauton (at RT) المسخنة مسبقا (الخطوة 1.1.2) وأعد التعليق برفق بأطراف ماصة سعة 1 مل للحصول على تعليق موحد. باستخدام أطراف ماصة معقمة ، قم بتكوين الأحجام إلى 10 مل (في كل منها) بنفس الوسائط. أجهزة الطرد المركزي تعليق لمدة 10 دقائق في 3200 × غرام و RT والتخلص من المواد الطافية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
        ملاحظة: تظل الخطوة أعلاه كما هي بالنسبة لثقافات MTB.
      3. أعد تعليق خلايا MSM المغسولة مرتين في 20 مل (لكل منها) من Sauton المسخن مسبقا (المسخن مسبقا في لوحة أو حاضنة شاكر) وقياس الكثافة البصرية للخلايا عند 600 نانومتر. تلقيح الحجم المطلوب من مزارع MSM في قوارير Erlenmeyer معقمة سعة 1 لتر تحتوي على ~ 330 مل من Sauton المعقمة بحيث يكون OD600 النهائي ~ 0.05.
        ملاحظة: يجب أن تبدأ عمليات التعليق دائما بحجم صغير. إذا تمت إضافة الحجم النهائي مباشرة إلى الحبيبات كخطوة واحدة ، فستظل الخلايا كريات منتشرة (مؤشر على ضعف التعليق). الطريقة الوحيدة لحل المشكلة هي تدوير الثقافات وإعادة التعليق على النحو الموصى به. تظل الخطوة المذكورة أعلاه كما هي بالنسبة لثقافات MTB.
    3. اليوم 2/3
      1. احتضان ثقافة 330 مل في شاكر الحاضنة عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئويةحتى تصل الثقافة OD600 إلى ~ 0.3. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرة واحدة (على غرار الخطوة 1.2.2.2 ولكن بحجم متساو) ثم أعد تعليق الحبيبات بنفس الحجم. قم بتوزيع 50 مل من المزارع المعاد تعليقها في ست قوارير Erlenmeyer معقمة سعة 1 لتر ، تحتوي كل منها على 280 مل من Sauton المعقمة المسخنة مسبقا مع 1/10th من الاستخدام العادي (0.05٪) Tween-80 أي 0.005٪ (انظر أيضا ملاحظة الخطوة 2.2.1.3. لفهم سبب 1/10). يجب أن يكون OD600 النهائي حوالي 0.05.
        ملاحظة: بالنسبة لثقافات MTB ، بدلا من قوارير Erlenmeyer ، استخدم زجاجات الأسطوانة (بسعة 1/2/4 لتر). اضبط حجم الثقافة لكل زجاجة بحيث لا تصل الثقافة إلى فم الزجاجة عند الاحتفاظ بها على جهاز الأسطوانة. يعتمد الحجم الفعلي في زجاجة الأسطوانة على سعة زجاجة الأسطوانة.
      2. احتضان كل من الثقافات 330 مل في شاكر الحاضنة عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئويةحتى يصل OD600 إلى 2.0 إلى 2.5 (~ 15-18 ساعة).
        ملاحظة: بالنسبة لثقافات MTB ، تأكد من أن OD600 النهائي هو ~ 1.0-1.2 (يستغرق ~ 5-8 أيام).

2. إثراء أجهزة MSM mEVs من خلال استخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة

  1. اليوم 4
    1. أجهزة الطرد المركزي ~ 2 لتر من مزارع MSM في المرحلة المتوسطة الأسية في زجاجات طرد مركزي معقمة 6 × 400 مل عند 4 درجةمئوية لمدة 20 دقيقة عند ~ 8000 × جم (جهاز طرد مركزي نموذج أرضي). اجمع طاف الوسائط / الثقافة المستهلك في قارورتين من Erlenmeyer مبردة مسبقا ومعقمة سعة 1 لتر وقم بتخزين حصة من الحبيبات لأي إجراءات تحليلية (مثل SDS-PAGE والنشاف الغربي - غير مفصل هنا).
      ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في البرد (~ 4 °C) للحفاظ بشكل أفضل على سلامة mEVs. تعتبر mEVs مستقرة تماما في RT ولكن التبريد أمر لا بد منه لتحقيق الاستقرار على المدى الطويل (لا ينصح بالتجميد والذوبان المتكرر). أثناء نمو الثقافة المحورية ، تنفصل mEVs عن سطح MSM / Mtb وتتراكم في الوسائط الطافية / المستهلكة للثقافة.
    2. قم بتصفية طاف ثقافة MSM أولا من خلال وحدة (وحدات) مرشح التخلص 0.45 ميكرومتر ثم من خلال وحدة (وحدات) مرشح التخلص 0.22 ميكرومتر لإزالة جميع آثار البكتيريا.
      ملاحظة: غالبا ما يؤدي الترشيح المباشر من خلال مرشحات 0.22 ميكرومتر إلى خنق وحدات المرشح (حيث قد تنزعج الحبيبات البكتيرية أثناء تنفيذ الخطوة 2.1.1.). لتوليد طاف ثقافة Mtb ، قم بإجراء ثلاث عمليات ترشيح لمزارع Mtb (على سبيل المثال ، خطوة الترشيح الأولى بوحدة مرشح يمكن التخلص منها 0.45 ميكرومتر ؛ خطوتان متتاليتان للترشيح مع وحدات مرشح 0.22 ميكرومتر يمكن التخلص منها) قبل نقل ترشيحات الثقافة إلى إعدادات BSL-2.
  2. اليوم 4/5
    1. استخدم مكثفات الغشاء 30 كيلو دالتون لتركيز ترشيح ثقافة MSM (~ 2 لتر) وصولا إلى ~ 38 مل عن طريق الطرد المركزي لترشيح الثقافة عند 4 درجةمئوية و 20 دقيقة وعند 3200 × جم.
      1. اغسل المكثفات مسبقا أولا باستخدام DDW معقم وبارد (~ 15 مل) (اغسل عند 4 درجاتمئوية و 5 دقائق وعند 3200 × جم).
      2. اغسل ب ~ 15 مل من Sauton البارد المصفى مسبقا (نفس ظروف الماء (2.2.1.1.)) لإزالة جميع آثار المواد الكيميائية (المستخدمة أثناء التصنيع).
      3. نظرا لأن ~ 130 مركزا (إذا كان الاستخدام واحدا فقط) مطلوبة تقنيا لتركيز ~ 2 لتر من ترشيح الثقافة ، أعد استخدام المراكز المركزية 3-4 مرات على الأقل إذا لزم الأمر. اتبع هذه الخطوات: ركز 15 مل إلى 0.5 إلى 1.0 مل (اتبع الخطوة 2.2.1) ، وانقل المركز إلى أنبوب طرد مركزي فائق نظيف ومعقم وبارد سعة 38 مل ، ثم أعد نقل ترشيح الثقافة غير المركز المتبقي إلى المراكز المركزية المستخدمة لتكرار التركيز.
        ملاحظة: استخدام مكثفات 24 ، 30 كيلو دالتون لتركيز 2 لتر من ترشيح الثقافة سيستغرق ما يصل إلى 6 ساعات. عند تركيز ترشيح الثقافة ، يتركز Tween-80 أيضا ويمكنه منع المكثف. يساعد استخدام Tween-80 إلى 0.005٪ نهائي (بدلا من 0.05٪) في وسائط Sauton على منع هذا الانسداد. لا يؤثر التركيز المنخفض ل Tween-80 على التعليق المنتظم ل MSM أثناء النمو ولا يسبب تكتل خلايا MSM. ومع ذلك ، نظرا لأن خلايا Mtb تتكتل عند 0.005٪ Tween-80 ، استخدم 0.05٪ Tween-80 للمركبات الكهربائية الخاصة ب MTB.
    2. انقل ترشيح مزرعة Msm المركز (~ 38 مل) إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ومغسول (مع ddw) ومبرد مسبقا 40-50 مل من مادة البولي بروبيلين وعرضه للطرد المركزي من خطوتين ، أولا عند 4000 × جم ثم عند 15000 × جم ، كلتا الخطوتين عند 4 درجاتمئوية لمدة 20 دقيقة (لإزالة جميع الحطام). استخدم جهاز طرد مركزي من النوع الأرضي لنفسه.
  3. اليوم 5/6
    1. انقل طاف الثقافة إلى أنبوب طرد مركزي فائق التبريد سعة 38.5 مل من مادة البولي بروبيلين وقم بتدويره في جهاز طرد مركزي فائق عند 100000 × جم لمدة 4 ساعات عند 4 درجاتمئوية.
      ملاحظة: يعمل جرافة التأرجح بشكل أفضل عند هذه السرعة. تأكد من ملء أنبوب الطرد المركزي الفائق حتى أسنانه والحصول على أنبوب طرد مركزي فائق التوازن بوزن مكافئ. إذا كان أي من الأنبوبين عالقا في دلو التأرجح بعد الطرد المركزي (الذي يحدث بسبب التكثيف) ، باستخدام الملقط ، فقم بإزالته برفق من الدوار. إن مسح الرطوبة المكثفة الموجودة على السطح الخارجي لجهاز الطرد المركزي الفائق قبل الطرد المركزي الفائق يمنع الالتصاق.
    2. احفظ المادة الطافية في أنبوب مبرد سعة 50 مل (انظر الملاحظة). اقلب أنبوب الطرد المركزي الفائق على ورق ماص جديد خال من النسالة لإزالة آثار المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 600 ميكرولتر من محلول HEPES العازل (50 mM HEPES و 150 mM NaCl ، درجة الحموضة 7.4 ؛ تعقيم المرشح قبل الاستخدام).
      ملاحظة: احفظ المادة الطافية كنسخة احتياطية فقط. تظهر حبيبات mEV الأصلية على شكل هلام يشبه الهلام ، قطره 5-7 مم ، أصفر رمادي باهت إلى بقعة شفافة. إذا لم تكن هناك حبيبات مرئية ، كرر الخطوة 2.3.1 عن طريق إعادة استخدام المادة الطافية المحفوظة. إذا لم تظهر أي حبيبات بعد تكرار الخطوة 2.3.1 ، فتجاهل الخطوة 1.2 وأعد تشغيلها. تستغرق الحبيبات وقتا لإنعاشها. يوصى بإضافة المخزن المؤقت HEPES وتركه طوال الليل عند 4 درجاتمئوية لسهولة التعليق. أعد التعليق برفق ولكن مع سحب متكرر (استخدم أطراف P200 لإعادة التعليق بشكل أفضل) حتى يتم إعادة التعليق بشكل موحد.
  4. اليوم 6
    1. إخضاع الحبيبات المعاد تعليقها للطرد المركزي المتدرج القائم على "iodixanol".
      1. ضع طبقة من الحبيبات المعاد تعليقها في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق النعومة عالي الوضوح سعة 13 مل والمغسول (مع DDW) والمبرد مسبقا من مادة البولي بروبيلين فائقة الوضوح واخلطها برفق (استخدم ماصة 1 مل) مع ~ 4 مل من محلول "iodixanol" المتدرج بكثافة خاملة (متوفر تجاريا كمحلول ~ 60٪ w / v). بعد وضع طبقات من الحبيبات المعاد تعليقها في قاع الأنبوب (بحد أقصى 5 مل) ، ثم تراكب مع 1 مل (وزن / حجم) لكل 40٪ و 30٪ و 20٪ و 10٪ من المخزونات الفرعية من "iodixanol" بالترتيب المعني (تحضير مخزون فرعي (مع مخزن HEPES المؤقت) من مخزون 60٪). ثم أضف 4 مل من المخزون الفرعي 6٪ (محضر من 60٪ مخزون مع مخزن HEPES) في الأعلى لملء الأنبوب.
        ملاحظة: تحضير التدرج قبل الاستخدام مباشرة ؛ لا تقم أبدا بالتخزين والاستخدام.
      2. بعناية (بدون اهتزاز) ، قم بوزن الأنبوب في دورق زجاجي ، وانقله برفق إلى دوار الدلو المتأرجح.
        ملاحظة: الوزن ضروري لتحقيق التوازن مع أنبوب وهمي (وزنه أيضا).
      3. إخضاعه للطرد المركزي الفائق عند 141000 × جم لمدة 16 ساعة عند 4 درجة مئوية.
  5. اليوم 7
    1. قم بإزالة الأنبوب بعناية (انظر ملاحظة الخطوة 2.3.1) وجمع أجزاء 1 مل في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة حديثا ؛ انتبهإلى الكسور من4 إلى 6 ، والتي تحتوي عادة على MSM mEVs.
      ملاحظة: عادة ما تنقسم mEVs من هذه الكسور إلى ثلاثة أو أربعة نطاقات mEVs (واحد هو النطاق الرئيسي) التي تكون بيضاء باهتة اللون. تتجزأ R-mEVs التي تحتوي على mCherryفي الكسور من 5 إلى 7 وتظهر باللون الأرجوانيالداكن إلى الأرجواني. عادة ما تتجزأ Mtb EVsفي الكسور من5 إلى 7. يعتمد فصل mEVs في التدرج على تركيز التدرج المستخدم ومدى جودة طبقات التدرج. إذا تمزق mEVs جزئيا ، فقد تتكسر في الكسور السابقة. بدلا من ذلك ، إذا لم يتم إعادة تعليق الحبيبات التي تم الحصول عليها بعد الخطوة 2.3.2 جيدا ، فإن الحويصلات تشكل كريات دقيقة كثيفة تتكسر ككسور لاحقة. نوصي بالجمع الدقيق للكسور فقط عندما يريد المستخدم تقييم أي من الكسور سعة 1 مل تحتوي على mEVs. قد يرغب المستخدمون في تقسيم الاقتباس إلى أجزاء أصغر أو أكبر بناء على راحتهم. عندما نستخدمها لتطبيقات معينة ، على سبيل المثال ، اختبارها كمعزز لقاح وحدة فرعية محتملة ل BCG ، فإننا نقصر مجموعتنا من mEVs على أقل من 250 ميكرولتر من الكسور (حيث تتجزأ mEVs) حتى نتمكن على وجه التحديد من جمع نطاقات mEVs ومعالجتها فقط كما هو موضح في 2.7.5. هذا يساعد على إزالة جميع آثار اليوديكسانول التي قد تتداخل في طريق تجاربنا النهائية بشكل أكثر فعالية.
  6. اليوم 8
    1. قم بتجميع الكسور المحتوية على mEVs ، وقم بتخفيفها باستخدام مخزن HEPES المؤقت إلى 38 مل ، وكرر الطرد المركزي الفائق عند 4 درجةمئوية لمدة 16 ساعة عند 100000 × جم. أعد تعليق الحبيبات (كما في الخطوة 2.3.2 بنفس التحذيرات) إما في المخزن المؤقت HEPES أو في أي مخزن مؤقت تتطلبه تجارب المصب (غير المفصلة هنا) مثل تقدير البروتين ، وتحليلات تتبع النانو ، والتلوين السلبي ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، والنشاف الغربي ، ووضع العلامات على الذهب المناعي.
      ملاحظة: للحصول على تعليق أفضل ، صوتنة الأنبوب المحتوي على mEV لمدة 10 دقائق باستخدام صوتنة حمام مائي بالموجات فوق الصوتية. يمكن أن يؤدي Sonicating لفترة أطول إلى تمزق وفقدان mEVs سليمة. إذا تم تعليقه جيدا ، فإن صوتنة غير ضرورية. جميع الخطوات من 2.1 إلى 2.6 متطابقة أثناء إثراء المركبات الكهربائية التي تم إنشاؤها بواسطة MTB.

3. بناء وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة.

ملاحظة: أحد أكثر 10 بروتينات وفرة (تم تحديدها بواسطة مطياف الكتلة) ل MSM EVs هو Cfp-2930. نظرا لصغر حجمه (29 كيلو دالتون) ، وهيكله الثانوي البسيط40 ، وتوطينه في الغشاء 41 ، والميل إلى إفرازه في الوسائط المستهلكة في الثقافات المحورية (على سبيل المثال ، كبروتين ترشيح ثقافي ؛ يفرزه كل من MSM و Mtb42,43 ، هنا ، تم استغلاله لتوصيل مراسل فلوري أحمر وبروتين مهم (EsxAMtb) إلى mEVs. ولتحقيق ذلك،

  1. استخدم البادئات الأمامية والخلفية المناسبة (الجدول 1 ؛ متوافق ليتم استنساخه مباشرة في ناقل مكوك مثل pMV261) لتضخيم cfp-29 من MSM. باستخدام ~ 50 نانوغرام من الوزن الجزيئي العالي (~ >20 كيلو بايت) الحمض النووي الجينومي MSM كقالب ، يقوم PCR بتضخيم جزء الجين cfp-29 باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (مثل Phusion أو Q5). اتبع توصيات الشركة المصنعة ل PCR.
    ملاحظة: صمم مواقع التقييد اللازمة في مواد أولية لسهولة الاستنساخ في أي ناقل مكوك بديل مهم. ستختلف ظروف وحجم تفاعل البوليميراز المتسلسل باختلاف نوع وعلامة بوليميراز الحمض النووي المستخدم في قراءة التدقيق. يختلف حجم مزيج التفاعل اعتمادا على كمية قالب الحمض النووي وكمية بوليميراز الحمض النووي المصحح. اتبع توصيات الشركة المصنعة لظروف PCR ، ونجاح التضخيم ، والقضاء على التلدين غير المحدد للبادئات.
  2. يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتنقية الأمبليكون المستخلص بأي مجموعة تنقية PCR متاحة تجاريا والتحقق من طول الأمبليكون عن طريق الرحلان الكهربائي القياسي لهلام الأغاروز. هضم amplicon المنقى.
    1. تقدير كمية amplicon المنقى على مقياس الطيف الضوئي. استخدم ما لا يقل عن 2 ميكروغرام من أمبليكون cfp-29 للهضم.
    2. هضم أولا مع BstB1 عند 65 درجة مئويةلمدة 1 ساعة (نوع وكمية المخزن المؤقت والإنزيم - وفقا لتوصيات الشركة المصنعة) ، وخفض درجة حرارة التفاعل إلى RT ، ثم هضم مع HindIII لمدة 1 ساعة عند 37 درجةمئوية (نوع وكمية المخزن المؤقت والإنزيم - وفقا لتوصيات الشركة المصنعة).
    3. يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتنقية والتخلص من الأمبليكون المهضوم في 50 ميكرولتر من DDW الخالي من النيوكلياز المعقم.
    4. تقدير تركيز وإنتاجية الأمبليكون المهضوم باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يخزن في -20 درجةمئوية حتى إعداد الربط. ملاحظة: بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تحقق من طول amplicon (~ 798 + 50 bp) والعائد عن طريق الرحلان الكهربائي 10 ميكرولتر من مزيج تفاعل تفاعل PCR على هلام أغاروز 1٪. على الرغم من أن الهضم المزدوج غير ممكن مع هذا المزيج من الإنزيمات ، إلا أن المخزن المؤقت المتوافق سيمنع تنقية PCR المتكررة وفقدان الأمبليكون المهضوم لاحقا. يختلف تركيز الأمبليكون المهضوم باختلاف المجموعة المستخدمة لتنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل. كما أنه يختلف باختلاف الطول (في bp) لأي متجهات بديلة من اختيارك.
  3. استخدم البادئات الأمامية والخلفية (الجدول 1) ، وبوليميراز الحمض النووي للتدقيق اللغوي ، و ~ 50 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي Mtb ، يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم esxA- أو esxA-3X FLAG-tag amplicon المحدد. استخدم ~ 5 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد المناسب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل mCherry. تفاصيل البلازميد والتسلسل موجودة في الملف التكميلي 1.
    ملاحظة: استخدم رابط جليكاين ، جليكاين ، جليكاين ، جليكاين ، سيرين44،45 (G4S) بين cfp-29 و mCherry / esxA / esxA-3X FLAG ؛ قبل بدء mCherry ، يساعد رابط G4S mCherry على عدم الخضوع لطيات زائفة غير وظيفية (بما في ذلك تلك التي يقودها Cfp-29). ارجع إلى تسلسلات cfp-29 و hsp60 و mCherry و esxA في الملف التكميلي 1. تتوفر البلازميدات التي تعمل كقوالب ل mCherry في مستودعات / بنوك بلازميد مختلفة. تتوفر إصدارات مختلفة (تسلسلات معدلة قليلا) من mCherry والتي تتطلب تسلسلات أولية أمامية وخلفية متغيرة. تساعد البادئات (الجدول 1) في تضخيم mCherry المذكور في الملف التكميلي 1. يعمل اندماج المحطة N ل mCherry / esxA / esxA :: 3XFLAG إلى الطرف C من Cfp-29 بشكل جيد.
  4. هضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي ل mCherry / esxA / esxA :: 3XFLAG amplicons وتنقية الحمض النووي المهضوم.
    1. هضم مزدوج كل amplicon مع HindIII و HpaI لمدة 1 ساعة عند 37 درجةمئوية (أو حسب توصيات الشركة المصنعة).
    2. استخدم مجموعة تنقية PCR المتاحة تجاريا وتوصيات الشركة المصنعة لتنقية الأمبليكون المهضوم. تخلص من الأمبليكون المهضوم في 50 ميكرولتر من DDW الخالي من النيوكلياز المعقم.
    3. تقدير تركيز وإنتاجية الأمبليكون المهضوم باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يخزن في -20 درجةمئوية حتى إعداد الربط.
  5. هضم 2 ميكروغرام من pMV261-KanR (الملف التكميلي 1) أو ناقل استنساخ مناسب مع الإنزيم (الإنزيمات) المختار.
    1. هضم أولا مع BstB1 عند 65 درجة مئويةلمدة 1 ساعة (نوع وكمية المخزن المؤقت والإنزيم - وفقا لتوصيات الشركة المصنعة) ، وخفض درجة حرارة التفاعل إلى RT ، ثم هضم مع HindIII لمدة 1 ساعة عند 37 درجةمئوية (نوع وكمية المخزن المؤقت والإنزيم - وفقا لتوصيات الشركة المصنعة).
    2. جل تنقية و elute في 50 ميكرولتر من DDW خالية من النيوكلياز المعقم.
    3. تقدير تركيز وإنتاجية المتجه المهضوم باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يخزن في -20 درجةمئوية حتى إعداد الربط.
      ملاحظة: يمكن الاستنساخ المكون من جزأين بخطوة واحدة باستخدام البادئات المذكورة أعلاه ل pMV261. أي ناقل مكوك بديل يبقى على قيد الحياة كحلقة سيعمل. ستعمل البلازميدات التكاملية أيضا ، لكن إنتاج البروتين المؤتلف سيكون أقل نسبيا لكل خلية.
  6. ربط وتحويلها إلى سلالة متوافقة من الإشريكية القولونية.
    1. للربط ، استخدم 125 نانوغرام من المتجه. استخدم مضخمات mCherry / esxA / esxA :: 3XFLAG المهضومة بشكل مناسب بنسبة 1: 3 مولاري. قم بإجراء الربط طوال الليل باستخدام T4 DNA Ligase (الكمية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة) عند 16 درجة مئوية في حمام مائي دائري مبرد.
      ملاحظة: استخدم الضوابط المناسبة مثل المتجه فقط مع وبدون T4 DNA Ligase لتقييم كفاءة الهضم والتنبؤ بكفاءة نجاح الاستنساخ.
    2. التحول
      1. قم بإذابة نقسام الخلايا المختصة كيميائيا NEB5α (~ 100 ميكرولتر لكل تحول) على الجليد لمدة 15 دقيقة. تخلط بلطف مرتين مع طرف ماصة معقمة. أضف مزيج الربط (حتى 20 ميكرولتر) إلى الخلايا المختصة الباردة.
      2. امزج خلايا الماصة برفق + الحمض النووي المربوط. احتضن المزيج على الثلج لمدة 30 دقيقة إضافية.
      3. قم بتوفير صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية (في حمام مائي دائري) لمدة 60 ثانية وانقلها على الفور إلى الجليد لمدة 15 دقيقة إضافية.
      4. استرجع الخلايا المحولة بإضافة 1 مل من مرق SOC (2٪ تريبتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ، 10 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2.5 مللي مول KCl ، 10 مللي مول MgCl2 ، 10 mM MgSO4 ، و 20 mM Glucose) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة.
      5. قم بتدوير البكتيريا المستعادة في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل (3000 × جم ، RT ، و 10 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من وسائط LB المعقمة والمسخنة مسبقا والمحضرة حديثا ، وانشر التعليق على ألواح أجار LB Miller المصبوبة حديثا والتي تحتوي على المضادات الحيوية المطلوبة بتركيزات مناسبة.
      6. احتضان أطباق بتري في حاضنة لوحة محددة مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
  7. الشاشة (غير مفصلة هنا) للاستنساخ المحتمل ، تحقق (عن طريق مستعمرة PCR- / تقييد الإنزيمات القائمة)46 وتسلسلها (تسلسل سانجر) لتأكيد الاندماج.
  8. استخراج الحمض النووي البلازميد (~ 200 نانوغرام / 1-2 ميكرولتر ؛ أي مجموعة متاحة تجاريا) من الاستنساخ المؤكد (خلفية الإشريكية القولونية ) وتحويلها إلى خلايا حديثة الصنع ذات كفاءة كهربائية من MSM.
  9. تحضير الخلايا الكهربية MSM
    1. تنمو حديثا MSM (كما في الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2). اغسل MSM المزروع حديثا كما في الخطوتين 1.3.3 و 1.3.4 (باستثناء استخدام 7H9 + ADC + Tween-80 (غني) بدلا من Sauton's).
    2. أضف حصة من خلايا MSM المغسولة إلى OD600 النهائي من ~ 0.05 في دورق Erlenmeyer معقم سعة 500 مل يحتوي على 150 مل من الوسائط الغنية.
    3. احتضان في شاكر الحاضنة عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجةمئوية حتى تصل الثقافة OD600 ~ 0.8 إلى 1.0 (~ 12-14 ساعة).
    4. انقل المستنبتة إلى زجاجة طرد مركزي مبردة سعة 400 مل واحتضانها على الثلج لمدة 60-90 دقيقة. ثم, قم بتقطيع الخلايا عند 4 درجاتمئوية لمدة 15 دقيقة عند 4,000 × جم.
    5. اغسل الخلايا مرتين (كل غسلة ب 150 مل ، عند 4000 × جم ، 4 درجاتمئوية ، و 15 دقيقة) بجليسرول معقم (معقم) بنسبة 10٪.
      ملاحظة: مع كل غسلة ، تصبح الحبيبات فضفاضة. توخ الحذر أثناء التخلص من المادة الطافية بالكامل (بعد كل غسلة). خلاف ذلك ، سيتم فقدان غالبية الخلايا في طاف المهملة.
    6. اغسل الخلايا مرة أخرى ب 75 مل من الجلسرين المثلج والمعقم 10٪ الذي يحتوي على 0.005٪ Tween-80.
    7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 7.5 مل من 10٪ جلسرين مع 0.005٪ توين -80 والقسمة إلى 400 ميكرولتر من القسامة.
      ملاحظة: على الرغم من أن الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية MSM مختصة لمدة 4 أشهر على الأقل ، إلا أن الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية الطازجة تعطي أفضل النتائج. عند استخدام الخلايا المختصة القديمة ، تظهر بعض المستعمرات غير الوردية (البيض) كمحولات كاذبة. كلما كبرت الخلايا المختصة ، زادت المستعمرات البيضاء.
  10. تحول MSM
    1. قم بإذابة قسامة الخلايا المختصة MSM على الجليد.
      ملاحظة: يؤدي الذوبان في RT وتحويل هذه الخلايا إلى كفاءة أقل.
    2. أضف 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (~ 200 نانوغرام إجمالي) إلى الخلايا المختصة الباردة ، واخلطها برفق مع طرف ماصة معقم سعة 1 مل ، وانقلها إلى كوفيت معقم مسبقا 2 مم.
    3. انقل الكوفيت المغلق بخلايا MSM المختصة + مزيج الحمض النووي البلازميد إلى ماوس elctroporator ، وأغلق الغطاء برفق وقم بتطبيق نبضة (نوع الاضمحلال الأسي) عند 2.5 كيلو فولت (جهد) ، 25 μF (سعة) ، و 1000 Ω (مقاومة).
    4. أضف على الفور 1 مل من الوسط الغني المعقم المسخن مسبقا (7H9 + ADC + Tween-80) إلى كوفيت ، واخلطه برفق مع طرف ماصة معقم سعة 1 مل ، وانقل المحتويات بالكامل إلى أنبوب معقم سعة 10 مل.
    5. احتضان المحتويات لمدة 3 ساعات في شاكر حاضنة مضبوط على 37 درجةمئوية و 200 دورة في الدقيقة. قم بتدوير المحتويات في أنبوب طرد مركزي دقيق (4000 × جم ، RT ، و 10 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الوسط الغني المعقم الذي تم تسخينه مسبقا ، وانشر التعليق على ألواح أجار 7H11 المصبوبة حديثا والتي تحتوي على ADC و Tween-80 والمضادات الحيوية المطلوبة بتركيزات مناسبة.
      ملاحظة: بالنسبة ل MSM ، عند الحاجة ، استخدم Hygromycin و Kanamycin و Apramycin بتركيزات نهائية تبلغ 50 ميكروغرام / مل و 25 ميكروغرام / مل و 50 ميكروغرام / مل على التوالي. MSM في حد ذاته لا يقاوم هذه المضادات الحيوية. استخدم هذه المضادات الحيوية فقط عند استخدام البلازميدات مع الجينات المقاومة المناسبة لاختيار / نمو المحولات / مستعمرات MSM المؤتلفة.
    6. احتضان أطباق بتري في حاضنة لوحة محددة مسبقا إلى 37 درجة مئوية. عادة ، تظهر المحولات بين 3-5 أيام.
      ملاحظة: إذا كان البروتين محل الاهتمام ساما ل MSM ، فقد تظهر المحولات لاحقا أو تفشل في الظهور. في مثل هذه الحالات ، استنساخ إصدارات مقطوعة من الطول الكامل.
    7. اصنع مخزون الجلسرين من مستعمرات MSM الناشئة بعد التحقق من الاستنساخ الإيجابي (مثل الخطوة 3.7)
  11. لإثراء R-mEVs التي تحتوي على بروتينات mCherry أو EsxA ، قم أولا بزراعة R-Msm معبرا إما عن mCherry أو exsA أو esxA :: 3X FLAG باتباع الخطوات من 1.2.1 إلى 1.2.3 ثم اتبع الخطوات من 2.1 إلى 2.6. لإثراء R-mEVs. تتلاشى R-mEVsفي الكسور 4-7 بعد دوران التدرج بعد الكثافة (الخطوة 2.5). حبيبات R-mEVs بعد خطوة الطرد المركزي الفائق الأولى (2.3.1). بعد إجراء مماثل للخطوة 2.3.1 ، تأكد من أن R-mEVs مرئية كحبيبات أرجوانية داكنة إلى أرجوانية قطرها 5-7 مم في الجزء السفلي من مركز جهاز الطرد المركزي الفائق.
  12. قم بإجراء التحليلات الغربية47 (غير مفصلة هنا) للكشف عن البروتين (البروتينات) ذات الأهمية داخل R-mEVs المخصبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نستخدم M. smegmatis (Msm) كنموذج المتفطرة لإثبات إثراء كل من mEVs الأصلية والمؤتلفة (R-mEVs). يعمل بروتوكول إثراء mEVs الملخص تخطيطيا (الشكل 1) أيضا على إثراء R-mEVs من MSM والمركبات الكهربائية الأصلية ل Mtb (مع تعديلات طفيفة كما في ملاحظات البروتوكول 1.2). يتطلب تصور mEVs المخصب تلطيخها سلبا تحت المجهر الإلكترونيالنافذ 36 (الشكل 2 أ). عادة ، تنفصل المركبات الكهربائية الخاصة ب MSM في الكسور 4-6 th 1 mL من تد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نظرا لأن تطوير لقاح جديد للسل يتفوق على BCG ويمكن أن يحل محله لا يزال يمثل تحديا هائلا ، كبديل ، تسعى العديد من المجموعات إلى اكتشاف لقاحات السل الفرعية المختلفة التي يمكن أن تعزز فعالية BCG وتطيل مدة الحماية48,49. نظرا للاهتمام المتزايد بالمركبات الكهربائية البكتيرية (bEVs) كوحدات فرعية محتملة وكمواد مساعدة طبيعية50,51 ، أصبح التخصيب المستمر لكميات كافية من mEVs لاختبارها / تحليلها النهائي خطوة مهمة. وبا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين أن هذا العمل البحثي قد تم إجراؤه في غياب أي علاقات / مصالح تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون بصدق البروفيسور سارة م. فورتشن على تفضله بمشاركة أسهم M. smegmatis mc2155. كما أنهم يعترفون ب Servier Medical Art (smart.servier.com) لتوفير بعض العناصر الأساسية للشكل 1. إنهم يعترفون بصدق بدعم بقية أعضاء المختبر لتعديلات المرضى أثناء الاستخدام الطويل لهزازات الحاضنة وأجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي الفائقة لتخصيب mEV. كما أنهم يعترفون بالسيد سورجيت ياداف ، مساعد المختبر ، للتأكد دائما من أن الأواني الزجاجية والمواد الاستهلاكية اللازمة كانت دائما متاحة وسهلة الاستخدام. أخيرا ، يعترفون بالفرق الإدارية والمشتريات والمالية في THSTI لدعمهم المستمر ومساعدتهم في التنفيذ السلس للمشروع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خزانة السلامة الحيوية من النوع A2Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية1300 سلسلة
مقاعد البدلاء أعلى الطرد المركزيEppendorf ، الولايات المتحدة الأمريكية5810 R
BstB1 ، HindIII ، HpaINEB ، الولايات المتحدةNEB
مقياس كثافة الخليةGE Healthcare ، الولايات المتحدة الأمريكيةUltraspec 10
حامض الستريكسيجما ألدريتش ، ميرك ، الولايات المتحدة الأمريكيةسيجما ألدريتش
القاعدة فوسفات البوتاسيومسيجما ألدريتش ، ميرك ، الولايات المتحدة الأمريكيةسيجما ألدريتش
مزدوج الماء المقطرميرك ، الولايات المتحدة الأمريكية~ 18.2 ميجاوات / سم @ 25 o< / sup>C
كوفيت التثقيب الكهربائيBio-Rad ، الولايات المتحدة الأمريكيةمم
ElectroporatorBio-Rad ، الولايات المتحدة الأمريكيةElectroporator
EsxA خاص AbAbcam ، أرنب المملكة المتحدة سترات
الأمونيوم الحديديكسيجما ألدريتش ، ميرك ، الولايات المتحدة الأمريكيةسيجما ألدريتش
نموذج الطرد المركزيالطابق الحراري فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكيةسورفال RC6 بالإضافة إلى
الأواني الزجاجيةبوروسيل، الهند1 لتر قوارير إرلينماير
الجلسرينسيجما ألدريتش ، ميرك ، الولايات المتحدة الأمريكيةسيجما ألدريتش
هيبس وكلوريدالصوديومسيجما ألدريتش ، ميرك ، الولايات المتحدة الأمريكيةسيجما ألدريتش
حاضنة هزازاتثيرمو فيشر العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكيةMaxQ 6000 و 8000
L-AsparagineSigma-Aldrich ، Merck ، الولايات المتحدة الأمريكيةSigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar ، MillerHi Media Media ، INDIA
Media كبريتات المغنيسيوم HeptahydrateSigma-Aldrich ، Merck ، الولايات المتحدة الأمريكيةSigma محرك النمام المغناطيسي Aldrich
Tarsons ، الهندTarsons
mCherry الخاص Abcam، المملكة المتحدةأرنب أحادي
النسيلة ميكروويفLG ، الهندMC3286BLT
Middlebrook 7H9 BrothBD ، الولايات المتحدة الأمريكيةDifco Middlebrook 7H9 مرق
Middlebrook ADC enrichmentBD ، الولايات المتحدة الأمريكيةBBL Middlebrook ADC Enrichment
NanodropThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةSpectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB، الولايات المتحدة الأمريكيةمشتق من DH5a
Optiprep (Iodixanol)Merck ، الولايات المتحدة الأمريكيةمتوفر كمحلول مخزون 60٪ (في الماء)
طقم تنقية PCRHi Media ، الهندHi Media
MeterMettler Toledo ، الولايات المتحدة الأمريكيةMettler Toledo
طقم البلازميد الحمض النووي المصغرمرحبا وسائل الإعلام ، الهندمرحبا
حاضنة لوحةالوسائط الحرارية فيشر العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكيةسلسلة جديدة
من البلازميد pMV261Addgene ، الولايات المتحدة الأمريكية *
* The  ؛   بلازميد    هو    لا    المزيد متوفر في بنك		هذا المكوك ناقلات
تدقيق الحمض النووي بوليميرازثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكيةPhusion DNA Plus Polymerase
Q5 تدقيق الحمض النووي بوليميرازNEB ، الولايات المتحدةNEB
حمام مائي مبرد متداولThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةR20
Middlebrock 7H11 Agar baseBD ، الولايات المتحدة الأمريكيةBBL سبعة H11 Agar قاعدة
SOC مرقمرحبا ميديا ، الهندمرحبا ميديا
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش ، ميرك ، الولايات المتحدة الأمريكيةسيجما ألدريتش
T4 DNA LigaseNEB ، الولايات المتحدة الأمريكيةNEB
Tween-80Sigma-Aldrich ، Merck ، الولايات المتحدة الأمريكيةSigma Aldrich
UltracentrifugeBeckman Coulter ، الولايات المتحدة الأمريكيةOptima L100K
أنابيب الطرد المركزي الفائق - 14 ملبيكمان كولتر ، الولايات المتحدة الأمريكيةنوع Polyallomer &ndash ؛ نوع فائق الوضوح في أنابيب الطرد المركزي الدوار SW40Ti
- 38 ملبيكمان كولتر ، الولايات المتحدة الأمريكيةنوع البولي بروبيلين &ndash ؛ نوع غائم للدوار SW28
بالموجات فوق الصوتية تنظيف حمام مائيسونيكاتير Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةSonicator - مقعد أعلى نموذج
0.22 & micro ؛ م مرشحات يمكن التخلص منهاThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةNunc-Nalgene
30-kDa Centricon مكثفاتMerck ، الولايات المتحدة الأمريكيةمرشحات الطرد المركزي Amicon Ultra - Millipore
3X FLAG الأجسام المضادةSigma-Aldrich ، Merck ، الولايات المتحدة الأمريكيةSigma Aldrich
400 مل زجاجات الطرد المركزيThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةNunc-Nalgene
50 مل أنابيبالطرد المركزيكورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكيةمعقمة ، معبأة
مسبقا <قوية > بكتيريا < / قوية >
<قوية >سلالة < / قوية >
< م > الإشريكية القولونية < / م >نب ، الولايات المتحدة الأمريكيةNEB 5-alpha (مشتق من DH5 & alpha ؛).
Msm تعبر عن cfp29 :: mCherryهذه الدراسةMC2   155
Msm يعبر عن cfp29 :: esxAهذه الدراسةMC2   ؛ 155
MSM تعبر عن cfp29::esxA::3X FLAGهذه الدراسةMC2  155
Mycobacterium smegmatis < / em> (MSM)البروفيسور سارة م. فورتشن ، جامعة هارفارد ، الولايات المتحدة الأمريكية  MC2  155
الأمريكية ثنائي 2 متعددة النسيلة Hi pH البلازميد الأمريكية

المراجع

  1. Global Tuberculosis Report 2022. , https://www.who.int/publications/m/item/global-tb-report (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028(2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12(2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220(2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658(2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884(2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664(2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732(2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95(2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium - Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45(2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220(2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260(2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658(2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131(2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 2/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

الوسوم

الحويصلات خارج الخلوية للبكتيريا الفطريّةالحويصلات خارج الخلوية المؤشبةالحويصلات خارج الخلوية الطبيعيةMycobacterium Smegmatisإثراء الحويصلات خارج الخلويةالطرد المركزي الفائق بتدرج الكثافةالحويصلات خارج الخلوية البكتيريةتوصيل EsxAاندماج mCherryالمجهر الإلكتروني النافذ
إثراء الحويصلات خارج الخلية الأصلية والمؤتلفة من المتفطرات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.