يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

صياغة وتوصيف العوامل النشطة بيولوجيا المحتوية على أقراص نانوية

2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65145

⸱

مارس 17, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف إنتاج وتوصيف العوامل النشطة بيولوجيا التي تحتوي على أقراص نانوية. تؤخذ أقراص الأمفوتريسين B النانوية كمثال لوصف البروتوكول بطريقة تدريجية.

الملخص

يشير مصطلح القرص النانوي إلى نوع منفصل من الجسيمات النانوية يتكون من طبقة ثنائية تشكل الدهون ، وبروتين سقالة ، وعامل نشط بيولوجيا متكامل. يتم تنظيم الأقراص النانوية كطبقة ثنائية دهنية على شكل قرص يحيط محيطها ببروتين السقالة ، وعادة ما يكون عضوا في عائلة البروتين الشحمي القابل للتبادل. تم إذابة العديد من العوامل النشطة بيولوجيا الكارهة للماء بكفاءة في الأقراص النانوية من خلال دمجها في الوسط الكارهة للماء للطبقة المزدوجة الدهنية للجسيمات ، مما ينتج عنه مجموعة متجانسة إلى حد كبير من الجسيمات في نطاق 10-20 نانومتر في القطر. تتطلب صياغة الأقراص النانوية نسبة دقيقة من المكونات الفردية ، وإضافة متسلسلة مناسبة لكل مكون ، تليها صوتنة الحمام لخليط الصياغة. يتصل بروتين السقالة البرمائية تلقائيا ويعيد تنظيم الطبقة المزدوجة المشتتة التي تشكل خليط من الدهون / العامل النشط بيولوجيا لتشكيل مجموعة منفصلة ومتجانسة من جزيئات الأقراص النانوية. خلال هذه العملية ، ينتقل خليط التفاعل من مظهر عكر معتم إلى عينة موضحة ، عند تحسينها بالكامل ، لا تنتج أي ترسب عند الطرد المركزي. تتضمن دراسات التوصيف تحديد كفاءة ذوبان العوامل النشطة بيولوجيا ، والمجهر الإلكتروني ، وكروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، والتحليل الطيفي للامتصاص المرئي فوق البنفسجي (UV / Vis) ، و / أو التحليل الطيفي الفلوري. يتبع ذلك عادة تحقيق النشاط البيولوجي باستخدام الخلايا المستزرعة أو الفئران. في حالة الأقراص النانوية التي تحتوي على مضاد حيوي (أي مضاد حيوي ماكرولايد بوليين أمفوتريسين ب) ، يمكن قياس قدرتها على تثبيط نمو الخميرة أو الفطريات كدالة للتركيز أو الوقت. إن السهولة النسبية للصياغة ، والتنوع فيما يتعلق بالأجزاء المكونة ، وحجم الجسيمات النانوية ، والاستقرار المتأصل ، والذوبان المائي تسمح بعدد لا يحصى من التطبيقات في المختبر وفي الجسم الحي لتكنولوجيا الأقراص النانوية. في هذه المقالة ، نصف منهجية عامة لصياغة وتوصيف الأقراص النانوية التي تحتوي على الأمفوتريسين B كعامل نشط بيولوجيا كاره للماء.

المقدمة

البروتينات الدهنية عالية الكثافة القرصية الوليدة (HDLs) هي أسلاف تحدث بشكل طبيعي ل HDL الكروي الأكثر وفرة الموجود في الدورة الدموية البشرية. هذه الجسيمات الوليدة ، التي يشار إليها أيضا باسم HDL pre-ß ، تمتلك خصائص هيكلية فريدة ومميزة1. في الواقع ، بدلا من الوجود كجسيم كروي ، فإن HDLs الوليدة على شكل قرص. كشفت دراسات التوصيف الهيكلي المكثفة على HDLs القرصية الطبيعية والمعاد تشكيلها أنها تتكون من طبقة ثنائية فوسفوليبيد محيطها محاط ببروتين شحمي برمائي قابل للتبادل (apo) ، مثل apoA-I. في استقلاب البروتين الدهني البشري ، تتراكم HDLs الوليدة المنتشرة الدهون من الخلايا المحيطية وتنضج إلى HDLs كروية في عملية تعتمد على وسطاء البروتين الرئيسيين ، بما في ذلك ناقل الكاسيت المرتبط ATP A1 والليسيثين: الكوليسترول acyltransferse2. تمثل هذه العملية مكونا مهما في مسار نقل الكوليسترول العكسي الذي يعتبر وقائيا ضد أمراض القلب. مسلحين بهذه المعرفة والقدرة على إعادة تكوين HDLs القرصية ، استخدم الباحثون هذه الجسيمات كتدخل علاجي لعلاج تصلب الشرايين3. في جوهرها ، فإن ضخ HDL المعاد تشكيله (rHDL) في المرضى يعزز تدفق الكوليسترول من رواسب البلاك ويعيده إلى الكبد لتحويله إلى الأحماض الصفراوية وإفرازه من الجسم. تتبع العديد من شركات التكنولوجيا الحيوية / الأدوية استراتيجية العلاجهذه 4.

في الوقت نفسه ، أثارت القدرة على توليد هذه الجسيمات في المختبر موجة من الأنشطة البحثية التي أدت إلى تطبيقات جديدة وتقنيات جديدة. يتضمن أحد التطبيقات البارزة استخدام جزيئات rHDL كغشاء مصغر لإيواء البروتينات عبر الغشاء في بيئة شبيهة بالسكانالأصليين 5. حتى الآن ، تم دمج مئات البروتينات بنجاح في rHDL القرصي ، وأظهرت الأبحاث أن هذه البروتينات تحتفظ بكل من التشكل الأصلي والنشاط البيولوجي كمستقبلات وإنزيمات وناقلات ، إلخ. كما ثبت أن هذه الجسيمات ، التي يشار إليها باسم "الأقراص النانوية" ، قابلة للتوصيف الهيكلي ، غالبا بدقةعالية 6. من المسلم به أن هذا النهج في التحقيقات في البروتينات عبر الغشاء متفوق على الدراسات التي أجريت على مذيلات المنظفات أو الجسيمات الشحمية ، ونتيجة لذلك ، يتقدم بسرعة. من المهم أن ندرك أنه تم الإبلاغ عن طريقتين متميزتين قادرتين على تشكيل rHDL. طريقة "غسيل الكلى cholate"13 شائعة للتطبيقات المتعلقة بدمج البروتينات عبر الغشاء في طبقة rHDLثنائية الطبقة 5. بشكل أساسي ، تتضمن طريقة الصياغة هذه خلط طبقة ثنائية تشكل الفوسفوليبيد ، وبروتين سقالة ، وبروتين عبر الغشاء مهم في مخزن مؤقت يحتوي على كولات الصوديوم المنظف (أو ديوكسي كولات الصوديوم ؛ الوزن الجزيئي للمذيلة [MW] من 4200 Da). يعمل المنظف على إذابة مكونات التفاعل المختلفة بشكل فعال ، مما يسمح بغسيل العينة ضد المخزن المؤقت الذي يفتقر إلى المنظفات. أثناء خطوة غسيل الكلى ، عند إزالة المنظف من العينة ، يتشكل rHDL تلقائيا. عندما يتم استخدام هذا النهج لمحاصرة بروتين عبر الغشاء محل الاهتمام ، فقد تم تسمية جزيئات المنتج بالأقراص النانوية5. ومع ذلك ، فإن محاولات استخدام هذه الطريقة لدمج العوامل النشطة بيولوجيا الكارهة للماء ذات الجزيئات الصغيرة (MW <1000 Da) ، لم تنجح إلى حد كبير. على عكس البروتينات عبر الغشاء ، فإن العوامل النشطة بيولوجيا للجزيئات الصغيرة قادرة على الهروب من كيس غسيل الكلى مع المنظف ، مما يقلل بشكل كبير من كفاءة دمجها في rHDLs. تم حل هذه المشكلة عن طريق حذف المنظفات من خليط التركيبة14. بدلا من ذلك ، تتم إضافة المكونات إلى مخزن مائي بالتتابع ، بدءا من الطبقة الثنائية المكونة للدهون ، مما يشكل عاملا نشطا بيولوجيا مستقرا يحتوي على rHDL ، يشار إليه باسم القرص النانوي. استخدم آخرون rHDL لدمج ونقل عوامل التصوير في الجسم الحي 7. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام rHDL المتخصصة المكونة من سقالة البروتين الشحمي والدهون الغليسيروفوسفوليبيد الأنيونية ، الكارديوليبين ، في دراسات ربط اليجند. توفر هذه الجسيمات منصة لدراسات تفاعل الكارديوليبين مع مختلف الروابط القابلة للذوبان في الماء ، بما في ذلك الكالسيوم والسيتوكروم ج والعامل المضاد للسرطان دوكسوروبيسين8.

ينصب تركيز هذه الدراسة على صياغة rHDL التي تمتلك عاملا نشطا بيولوجيا مسعورا مدمجا بشكل مستقر (أي قرص نانوي). إن قدرة هذه العوامل على الاندماج في الوسط الدهني لجزيئات rHDL القرصية تمنحها بشكل فعال قابلية الذوبان المائي. على هذا النحو ، فإن الأقراص النانوية لديها القدرة على التطبيقات العلاجية في الجسم الحي . عند صياغة الأقراص النانوية ، يلزم وجود ظروف حضانة / تفاعل محددة لدمج العوامل النشطة بيولوجيا المنفصلة الكارهة للماء بنجاح في جسيم المنتج ، والهدف من هذا التقرير هو توفير معلومات عملية مفصلة يمكن استخدامها كقالب أساسي لإنشاء جزيئات نانوية جديدة لتطبيقات محددة. وبالتالي ، في سياق هذه المخطوطة ، فإن المصطلحين nanodisc و nanodisk غير قابلين للتبادل. في حين يشير القرص النانوي إلى rHDL المركب ليحتوي على بروتين عبر الغشاء مضمن في طبقة الدهونالمزدوجة 5 ، يشير مصطلح nanodisk إلى rHDL المصمم لدمج عوامل نشطة بيولوجيا منخفضة الوزن الجزيئي (< 1000 Da) ، مثل الأمفوتريسين B14.

تتوفر مجموعة متنوعة من الطرق للحصول على بروتينات سقالة مناسبة. من الممكن شراء بروتينات سقالة من الشركات المصنعة [مثل apoA-I (SRP4693) أو apoE4 (A3234)] ، ومع ذلك ، قد تكون التكلفة عاملا مقيدا. النهج المفضل هو التعبير عن بروتينات السقالة المؤتلفة في الإشريكية القولونية. يتم نشر البروتوكولات للإنسان apoA-I9 ، apoE410 ، وكذلك بروتين الهيموليمف الحشري apolipophorin-III11. لغرض التجارب الموصوفة هنا ، تم استخدام مجال apoE4 N-terminal (NT) البشري المؤتلف (الأحماض الأمينية 1-183). تم تصنيع تسلسل النوكليوتيدات الذي يشفر apoE4-NT البشري وإدخاله في متجه تعبير pET-22b (+) مجاور مباشرة لتسلسل قائد pelB المشفر بالمتجهات. يؤدي هذا البناء إلى التعبير عن بروتين اندماج تسلسل pelB - apoE4-NT. بعد تخليق البروتين ، يوجه تسلسل قائد pelB البكتيري البروتين المركب حديثا إلى الفضاء المحيطي حيث يشق الببتيداز القائد تسلسل pelB. بروتين apoE4-NT الناتج ، بدون علامات تسلسل أو ذيول ، يهرب لاحقا من البكتيريا ويتراكم في وسط الاستزراع11,12 ، مما يبسط المعالجة النهائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحويل وتعبير وتنقية مكون بروتين السقالة

  1. التحول البكتيري BL21 مع البلازميد المحتوي على apoE4-NT
    1. قم بإذابة أنبوب من الخلايا المختصة BL21 (DE3) على الجليد لمدة 10 دقائق.
    2. بمجرد ذوبان كل الجليد ، امزج بلطف وبعناية ماصة 50 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب تحويل على الجليد.
    3. أضف 5 ميكرولتر تحتوي على 50 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد (للتسلسل ، انظر الجدول التكميلي 1) إلى خليط الخلية. حرك الأنبوب بعناية أربع أو خمس مرات للخلط. لا دوامة.
    4. ضع الخليط على الثلج لمدة 30 دقيقة.
    5. صدم الخليط بالحرارة عند 42 درجة مئوية بالضبط لمدة 10 ثوان.
    6. ضعه على الثلج لمدة 5 دقائق.
    7. ماصة 950 ميكرولتر من S.O.C. متوسطة في الأنبوب في درجة حرارة الغرفة.
    8. ضع الأنبوب في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة مع ضبط التذبذب على 250 دورة في الدقيقة.
    9. امزج الخلايا جيدا عن طريق النقر والتقليب ، ثم انشر 100 ميكرولتر من محلول الخلية على 20 مل من مرق لوريا + لوحة اختيار أجار معالجة بالأمبيسلين بتركيز 0.1 مجم / مل.
    10. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، أو حتى تنمو المستعمرات المرئية.
  2. باستخدام ماصة إلكترونية ، انقل 25 مل من وسط NZCYM المعقم إلى دورق مخروطي معقم سعة 250 مل في درجة حرارة الغرفة وأضف الأمبيسلين إلى تركيز عمل نهائي يبلغ 0.1 مجم / مل.
  3. باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، انقل مستعمرة فردية واحدة من لوحة الاختيار التي تحتوي على السلالة البكتيرية المحولة بشكل مناسب وأضفها مباشرة إلى القارورة التي تحتوي على 25 مل من وسائط NZCYM + الأمبيسلين.
  4. ضع 25 مل من دورق استزراع بذور NZCYM في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية مع ضبط التذبذب المداري على 250 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يوصى بزراعة هذه البذور بين عشية وضحاها للوصول إلى تركيز بكتيري مناسب (~ 1.5-2.0 وحدة كثافة بصرية) ، كما تم قياسه باستخدام مقياس الطيف الضوئي مضبوطا على الطول الموجي = 600 نانومتر.
  5. نقل 250 مل من وسط NZCYM المعقم إلى أربع قوارير محيرة سعة 1 لتر وإضافة مضاد حيوي أمبيسلين إلى تركيز عمل قدره 0.1 مجم / مل.
  6. في ظل ظروف معقمة، انقل 5 مل من مستنبتات البذور المشبعة إلى كل من القوارير الأربعة التي تحتوي على قوارير سعة 250 مل وضعها في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية مع ضبط التذبذب المداري على 250 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، سيشار إلى الثقافة على أنها ثقافة توسع وسيتم مراقبة النمو الأسي باستخدام مقياس الطيف الضوئي UV1800. يسمح للنمو بالمضي قدما حتى تصل الكثافة البصرية للثقافة عند 600 نانومتر (OD600) إلى قيمة تتراوح بين 0.6-0.8.
  7. بمجرد أن تصل ثقافة التمدد إلى قيمة OD600 المطلوبة البالغة 0.6-0.8 ، أضف 59.6 مجم من الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى كل 250 مل من المستنبتة تحتوي على دورق لتركيز نهائي قدره 1 mM للحث على التعبير عن البروتين. في هذه المرحلة ، يشار إلى ثقافة التوسع باسم ثقافة التعبير. بدء التعبير لمدة 5 ساعات.
  8. في نهاية فترة التعبير 5 ساعات ، قم بإزالة القوارير الأربعة من حاضنة الاهتزاز وماصة 125 مل إلى ست زجاجات طرد مركزي سعة 250 مل (إجمالي 750 مل).
  9. وازن كل زجاجة طرد مركزي للتأكد من أن الكتلة الإجمالية في حدود ±0.5 مجم من بعضها البعض.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لضمان التشغيل الآمن لجهاز الطرد المركزي.
  10. قم بإعداد جهاز الطرد المركزي عن طريق قلب مفتاح الطاقة أولا إلى وضع التشغيل. انقر فوق الزر المسمى "تعيين / فعلي" واضبط المعلمات على "JA-14" و "9400 × جم" و 20.00 دقيقة و 4 درجات مئوية باستخدام الأقراص المقابلة.
  11. قم بتحميل زجاجات الطرد المركزي الست المتوازنة في دوار جهاز طرد مركزي بحجم مناسب وضعها في جهاز الطرد المركزي لضمان اتباع أي معايير أمان محددة.
    ملاحظة: استمر في هذه الخطوة حتى يتم طرد جميع زراعة الخلايا البكتيرية بالطرد المركزي وجمع المواد الطافية.
  12. قم بتصفية الطافات البكتيرية المعزولة من خلال ترشيح فراغي أو جهاز مكافئ مزود بفلتر 0.45 ميكرون لإزالة أي حطام متبقي.
  13. تنقية الهيبارين من بروتين سقالة apoE4-NT المؤتلف
    ملاحظة: يتم إجراء تنقية العمود في درجة حرارة الغرفة.
    1. قم بموازنة عمود Hi-trap Heparin عن طريق تطبيق 10 أحجام أعمدة (50 مل) من محلول فوسفات الصوديوم 10 mM ، ودرجة الحموضة 7.2 ، واستخلاص بمعدل 5 مل / دقيقة.
    2. ضع الوسط المخصب apoE4-NT على العمود بمعدل 2.5 مل / دقيقة حتى يتم تطبيق حجم 1 لتر بالكامل من الوسط وتجاهل التدفق.
    3. اغسل العمود بأحجام 10 أعمدة (50 مل) من محلول فوسفات الصوديوم 10 مللي مول ، ودرجة الحموضة 7.2 ، وتجاهل التدفق.
    4. قم بإزالة بروتين apoE4-NT المطلوب عن طريق تطبيق ثلاثة أحجام أعمدة (15 مل) من محلول الشطف (10 mM من فوسفات الصوديوم + 1.5 M NaCl ، الرقم الهيدروجيني 7.2) على العمود وجمع الشحم.
  14. غسيل الكلى من apoE4-NT eluate
    1. قم بإعداد قسم من أنابيب غسيل الكلى (كانت أبعاد أنابيب غسيل الكلى المستخدمة 22 سم في الطول ، والقطر الداخلي 12 مم ، و 10000 ميجاوات من أكسيد الكربون) عن طريق نقعها جيدا في الماء منزوع الأيونات المقطر (DDI) لمدة 10 دقائق.
    2. تحضير 1 لتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (10 مللي مول فوسفات الصوديوم + 150 مللي مول كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.2) في دورق بلاستيكي سعة 1 لتر أو ما يعادله.
    3. باستخدام مشبك أنابيب غسيل الكلى ، قم بتثبيت أحد طرفي أنبوب غسيل الكلى المنقوع ، مما يضمن تأمين المشبك وعدم هروب أي سائل.
    4. أدخل قمعا ضيقا للرقبة في الطرف المفتوح لأنبوب غسيل الكلى واسكب 15 مل من محلول apoE4-NT في أنبوب غسيل الكلى.
      ملاحظة: من الضروري التحقق من وجود أي تسريبات في هذه الخطوة.
    5. قم بإزالة القمع وثبت نهاية أنبوب غسيل الكلى بمشبك أنبوب غسيل كلوي آخر.
    6. ضع عوامة غسيل الكلى الرغوية على أحد الأطراف المغلقة لأنبوب غسيل الكلى وضع أنبوب غسيل الكلى المجمع في الدورق الذي يحتوي على 1 لتر من المخزن المؤقت PBS.
    7. ضع قضيب تحريك مغناطيسي في قاع الدورق واضبط عنصر التحكم في التحريك على "منخفض" ، مما يضمن عدم تكوين دوامة.
    8. بعد انتهاء غسيل الكلى، صب المخزن في أنبوب مخروطي سعة 50 مل واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يوصى بإجراء غسيل الكلى هذا عند 4 درجات مئوية طوال الليل.

2. صياغة عامل نشط بيولوجيا يحتوي على أقراص نانوية

  1. إعداد القسمة الفوسفوليبيد
    1. تزن 5 ملغ من الفوسفوليبيد المناسب (على سبيل المثال، ثنائي ميريستويل فوسفاتيديل كولين [DMPC]) وانقله إلى أنبوب اختبار زجاجي.
    2. قم بإذابة 5 ملغ من الفوسفوليبيد بإضافة 300 ميكرولتر من CHCl 3 و 100 ميكرولتر من CH3 OH لنسبة إجمالية 3: 1 فولت / فولت.
    3. تبخر المذيب العضوي عن طريق وضع أنبوب الاختبار الزجاجي تحت تيار لطيف من غاز N2 لمدة 10-15 دقيقة ، بحيث يتشكل طبقة رقيقة من الفوسفوليبيد المجفف على طول جدران الجزء السفلي من الأنبوب.
  2. التجفيد من القسامات الفوسفوليبيد
    1. تحضير حصص الفوسفوليبيد للتجفيف بالتجميد عن طريق تغطية فتحة أنبوب الاختبار الزجاجي بالبارافيلم.
    2. قم بتثقيب البارافيلم باستخدام إبرة 24 جم حوالي 10-15 مرة.
    3. ضع القسوم المثقبة في حاوية تجفيف بالتجميد مناسبة وتأكد من إغلاق الغطاء المطاطي بشكل صحيح.
    4. قم بتوصيل حاوية التجفيد بمشعب الفراغ الموجود في الجزء العلوي من آلة التجفيد وتأكد من إغلاق جميع الصمامات الأخرى بإحكام.
    5. قم بتشغيل آلة التجفيد عن طريق قلب مفتاح الطاقة والضغط على زر تهيئة الفراغ.
    6. بعد وصول النظام إلى الفراغ التام ، انقر فوق زر تهيئة التبريد لبدء عملية التجفيف بالتجميد.
      ملاحظة: يوصى بالسماح للعينات بالتجفيد طوال الليل.
  3. صياغة أقراص الأمفوتريسين-ب (أمبير-ب) النانوية
    1. ماصة 0.45 مل من PBS إلى قسمة الفوسفوليبيد المجففة بالتجميد والدوامة ل ~ 30 ثانية لتفريق الدهون.
      ملاحظة: ستظهر العينة الناتجة معتمة وعكرة.
    2. ماصة 50 ميكرولتر من محلول ampB مخزون 20 مجم / مل (20 مجم من ampB مذاب في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO] ، مخزن عند -20 درجة مئوية في وعاء كهرماني مغلق) في عينة الفوسفوليبيد المشتتة والدوامة.
      ملاحظة: عند اختيار مذيب لاستخدامه في تحضير محلول مخزون من العامل النشط بيولوجيا الكارهة للماء ، فإن الاعتبارين الشاملين هما 1) قابلية ذوبان العامل النشط بيولوجيا و 2) امتزاج المذيب مع المخزن المائي المستخدم في التركيبة. في حين أن DMSO غالبا ما يستخدم 15،16،17،18،19 ، تم استخدام ثنائي ميثيل فورماميد 20،21 أو رباعي هيدروفوران22 بنجاح 23.
    3. ماصة 0.5 مل من بروتين سقالة apoE4-NT (تركيز ~ 4 مجم / مل) إلى أنبوب الاختبار الزجاجي الذي يحتوي على الفوسفوليبيد المشتت و ampB. يجب أن يكون الحجم النهائي للعينة حوالي 1 مل.
    4. باث صوتنة العينة عند 24 درجة مئوية حتى يتضح المحلول (بشكل عام 10-15 دقيقة).
  4. الطرد المركزي نانوديسك
    1. انقل محلول ampB-nanodisk الموضح إلى أنبوب طرد مركزي صغير معقم سعة 1.7 مل.
    2. ضع الأنبوب في دوار جهاز طرد مركزي صغير منضدية مع إضافة أنبوب توازن يوضع في الجهة المقابلة مباشرة.
    3. شد غطاء الدوار وأغلق غطاء جهاز الطرد المركزي.
    4. قم ببرمجة جهاز الطرد المركزي للدوران لمدة 10 دقائق عند ~ 11000 × g باستخدام الأقراص المقابلة الموجودة في مقدمة وحدة الطرد المركزي الدقيقة.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، قد تكون الحبيبات مرئية. تتكون هذه الحبيبات من فوسفوليبيد غير مدمج و / أو أمبيرب.
    5. قم بإزالة المادة الطافية ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف آخر سعة 1.7 مل.
  5. غسيل الكلى لعينة قرص نانوي ampB
    1. قم بإعداد قسم من أنابيب غسيل الكلى (كانت أبعاد أنابيب غسيل الكلى المستخدمة 3 سم في الطول ، وقطر داخلي 16 مم ، و 10000 ميجاوات من ثاني أكسيد الكربون) عن طريق نقعها جيدا في ماء DDI لمدة 10 دقائق.
    2. قم بإعداد محلول عازل سعة 1 لتر PBS (10 mM فوسفات الصوديوم + 150 mM NaCl ، درجة الحموضة 7.2) في دورق بلاستيكي سعة 1 لتر أو ما يعادله.
    3. باستخدام مشبك أنابيب غسيل الكلى ، قم بتثبيت أحد طرفي أنبوب غسيل الكلى المنقوع ، مما يضمن تأمين المشبك وعدم هروب أي سائل.
    4. أدخل قمع عنق ضيق في الطرف المفتوح لأنبوب غسيل الكلى وانقل عينة قرص ampB-nanodisk إلى أنبوب غسيل الكلى.
    5. قم بإزالة القمع وثبت نهاية أنبوب غسيل الكلى بمشبك أنبوب غسيل كلوي آخر.
    6. ضع عوامة غسيل الكلى الرغوية على أحد الأطراف المغلقة لأنبوب غسيل الكلى وضع أنبوب غسيل الكلى المجمع في الدورق الذي يحتوي على 1 لتر من المخزن المؤقت PBS.
    7. ضع قضيب تحريك مغناطيسي في قاع الدورق واضبط عنصر التحكم في التحريك على "منخفض" ، مما يضمن عدم تكوين دوامة. اسمح لغسيل الكلى بالاستمرار طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

3. التحليل الطيفي لعينات ampB-nanodisk

  1. تهيئة مقياس الطيف الضوئي متبوعة بفارغة تلقائية
    1. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي عن طريق قلب مفتاح الطاقة والاتصال بجهاز كمبيوتر دعم مطابق عن طريق الضغط على الزر المسمى "PC Control".
    2. على كمبيوتر الدعم ، افتح البرنامج المسمى "UVProbe 2.61" واتصل بمقياس الطيف الضوئي بالنقر فوق الزر المسمى "اتصال" في الزاوية اليسرى السفلية.
    3. انقر فوق الزر المسمى Spectrum في شريط الأدوات العلوي داخل برنامج UVProbe.
    4. انقر فوق الزر المسمى طريقة في شريط الأدوات العلوي.
    5. انقر فوق علامة التبويب "قياس" وأدخل "500" في مربع نص "ابدأ" الموجود ضمن "نطاق الطول الموجي (نانومتر)" و "300" في مربع النص "إنهاء".
    6. انقر فوق القائمة المنسدلة بجوار علامة التبويب المسماة سرعة المسح الضوئي واضبطها على متوسط.
    7. قم بإعداد عينة فارغة عن طريق نقل 1 مل من DMSO إلى اثنين من الكوارتز cuvettes (QS 1.000).
    8. قم بتحميل كلا الكوفيت في منافذ العينة الخاصة بمقياس الطيف الضوئي ، وانقر فوق Autoblank ، وقم بتسجيل طيف من 300-500 نانومتر بالنقر فوق ابدأ في الزاوية اليسرى السفلية.
  2. التحضير والتحليل الطيفي لمعيار ampB
    1. قم بإعداد معيار 20 ميكروغرام / مل أمبير بطريق إزالة كوفيت من منفذ العينة الأمامي وإضافة 20 ميكرولتر من محلول مخزون 1 مجم / مل أمبير (20 ميكروغرام من إجمالي أمبيرب).
    2. قم بتحميل cuvette مرة أخرى في منفذ العينة الخاص بمقياس الطيف الضوئي وانقر فوق ابدأ لتسجيل امتصاص العينة.
    3. أخرج الكوفيت من منفذ العينة وقم بصب محتويات السائل في حاوية نفايات تحمل علامات مناسبة.
    4. اشطف الكوفيت جيدا بثلاث غسلات من الماء منزوع الأيونات متبوعا بثلاث غسلات تحتوي على 70٪ من الإيثانول.
  3. التحضير والتحليل الطيفي لعينة قرص ampB-nanodisk المعطلة
    1. قم بإعداد عينة قرص نانوي ampB معطلة (تحتوي على 20 ميكروغرام / مل كأمبيرب) عن طريق سحب 20 ميكرولتر من مخزون قرص نانوي 1 مجم / مل أمبير في 1 مل من DMSO. احتضان لمدة 1 دقيقة على الأقل قبل تسجيل الطيف.
    2. قم بتحميل الكوفيت في منفذ العينة الأمامي لمقياس الطيف الضوئي وانقر فوق ابدأ لتسجيل امتصاص العينة.
  4. إعداد وتحليل طيفي لمخزن مؤقت PBS فارغ
    1. قم بإعداد مخزن مؤقت PBS فارغا عن طريق نقل 1 مل من المخزن المؤقت PBS إلى اثنين من الكوارتز cuvettes (QS 1.000).
    2. قم بتحميل cuvettes في منافذ العينة المعنية لمقياس الطيف الضوئي ، وانقر فوق Autoblank ، وسجل الطيف من 300-500 نانومتر.
  5. التحضير والتحليل الطيفي لعينة قرص نانوي ampB غير معطلة
    1. قم بإعداد عينة قرص نانوي ampB غير متقطعة (تحتوي على 20 ميكروغرام / مل ك ampB) عن طريق إزالة الكوفيت من منفذ العينة الأمامي وإدخال 20 ميكرولتر من عينة قرص نانوي 1 مجم / مل أمبير في المخزن المؤقت PBS.
    2. قم بتحميل cuvette مرة أخرى في منفذ العينة الخاص بمقياس الطيف الضوئي ، وانقر فوق ابدأ ، وقم بتسجيل طيف العينة.
      ملاحظة: يجب التخلص من جميع النفايات الكيميائية في حاوية نفايات تحمل علامات مناسبة وفقا للإرشادات المقبولة.

4. تحليل مقايسة جدوى الخميرة

ملاحظة: تم إجراء فحوصات صلاحية الخميرة من أجل تقييم النشاط البيولوجي ل ampB وتحديد ما إذا كانت عملية الصياغة أو الدمج في الأقراص النانوية قد أثرت على نشاط تثبيط نمو الخميرة.

  1. قم بصياغة عينتين من أقراص الأمبير النانوية (الحجم النهائي = 1 مل) لاحتواء 1 مجم من ampB لكل 5 مجم من DMPC و 0.1 مجم من ampB لكل 5 مجم من DMPC باتباع الطريقة الموصوفة سابقا (2.3-2.4.1).
    ملاحظة: لعمل 1 ملغم/مل و0.1 ملغم/مل أمبير لكل 5 ملغ من DMPC، ماصة 50 ميكرولتر و5 ميكرولتر، على التوالي، من 20 ملغم/مل أمبير في مخزون DMSO في كل قنينة عينة.
  2. تحضير ثقافة الخميرة المشبعة
    1. انقل 25 مل من وسط مستخلص الخميرة المعقم - البتون - سكر العنب (YPD) إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
    2. استخدم حلقة تلقيح معقمة لنقل مستعمرة واحدة من Saccharomyces cerevisiae (BY4741) إلى 25 مل من وسط YPD.
    3. استزرع الخميرة في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية ، مع ضبط التذبذب على 200 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة.
  3. تحضير عينات مقايسة تثبيط النمو الفردي
    1. نقل 5 مل من وسط YPD المعقم إلى 30 أنبوب استزراع معقم سعة 13 مل.
    2. عالج ثلاث مجموعات من أنابيب الاستزراع بإضافة 20 و 10 و 5 ميكرولتر من عينة 1 مجم / مل ampB-nanodisk ، والتي تمثل 20 و 10 و 5 ميكروغرام من ampB ، على التوالي.
    3. عالج ثلاث مجموعات من أنابيب الاستزراع بإضافة 20 و 10 و 5 ميكرولتر من عينة القرص النانوي 0.1 مجم / مل أمبير ، والتي تمثل 2 و 1 و 0.5 ميكروغرام من أمبيرب ، على التوالي.
    4. عالج أربع مجموعات من أنابيب الاستزراع بإضافة 20 ميكرولتر من PBS أو DMSO أو التحكم في rHDL (بدون أمبيرب) أو 20 ميكروغرام من الأمبيرب في DMSO.
      ملاحظة: تمثل كل مجموعة من أنابيب الاستزراع نسخة متماثلة مستقلة. لذلك ، يؤدي اتباع هذه الطرق إلى قيمة n إجمالية تبلغ n = 3.
  4. تهيئة فحص جدوى الخميرة
    1. ابدأ التجربة عن طريق تلقيح كل عينة ب 100 ميكرولتر (2٪ حجم / حجم) من مزرعة الخميرة المشبعة
    2. استزرع الخميرة باستخدام حاضنة اهتزاز مضبوطة على 30 درجة مئوية ، مع ضبط التذبذب على 200 دورة في الدقيقة لمدة أقصاها 18 ساعة.
  5. قياسات صلاحية الخميرة
    1. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي عن طريق قلب مفتاح الطاقة ، ثم انقر فوق الزر المسمى Go To WL واضبط القيمة على 600 نانومتر.
    2. انقل 1 مل من وسط YPD المعقم إلى كوفيتين بلاستيكيين ، وقم بتحميله في منافذ العينة المعنية على مقياس الطيف الضوئي ، وانقر فوق Autoblank.
    3. انقل 1 مل من كل عينة إلى كوفيت بلاستيكي ، مع التأكد من تغيير الكوفيت في كل مرة وتحميل الكوفيت في منفذ العينة الأمامي لمقياس الطيف الضوئي.
    4. قم بقياس وتسجيل الكثافة البصرية لكل عينة عند 600 نانومتر وتخلص من كل كفيت مستهلك في حاوية نفايات بيولوجية خطرة بشكل صحيح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عملية صياغة القرص النانوي للعامل النشط بيولوجيا
في إجراء صياغة ampB-nanodisk الموصوف ، يعتبر التفاعل كاملا عندما ينتقل مظهر العينة من العكر إلى الصافي (الشكل 1). يشير هذا التغيير إلى أن الأقراص النانوية قد تشكلت وأن العامل النشط بيولوجيا قد تم إذابته. في كثير من الأحيان ، تمتص العوامل النشطة بيولوجيا الضوء في منطقة الطول الموجي المرئي (على سبيل المثال ، ampB ، الكركمين ، اللوتين ، الإنزيم المساعد Q10) ، وفي هذه الحالات ، تعتمد العينة لون العامل النشط بيولوجيا. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توفر صياغة عامل نشط بيولوجيا يحتوي على أقراص نانوية طريقة ملائمة لإذابة المركبات الكارهة للماء غير القابلة للذوبان. نظرا لأن الأقراص النانوية للعامل النشط بيولوجيا للمنتج قابلة للذوبان بالكامل في الوسائط المائية ، فإنها توفر طريقة توصيل مفيدة لمجموعة واسعة من الجزيئات الكارهة للماء (الجدول 1). وتشمل هذه الجزيئات الصغيرة ، والأدوية الطبيعية والاصطناعية ، والمغذيات النباتية ، والهرمونات ، إلخ. عادة ما تتبع استراتيجية الصياغة بروتوكولا قياسيا يجب أن يأخذ في الاعتبار خصائص الذوبان للعامل النشط بيولوجيا في ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (R37 HL-64159).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أمفوتريسين بشركة كايمان للكيماويات11636ND التركيبة & التحضير القياسي
أمبيسلينفيشر BP17925 العلميةللتحول & التوسع
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN / Aالتحول
محير قارورةنيو برونزويك العلميةN / Aالتوسع & التعبير
BL21 المختص E coliنيو إنجلاند BiolabsC2527Iزجاجات
الطرد المركزيNalgene3140-0250التعبير
عن الكلوروفورمفيشر ScientificG607-4ND الصيغة
DMSOSigma Aldrich472301قياسي Prepartation
DymyristoylphosphatidylcholineAvanti Lipids850345PND الصيغة
قارورة ErlenmeyerBellco BiotechnologyN / Aالتوسع & أنابيب الصقر للتعبير
Sarstedt Ag & CoD51588فحص الجدوى الخميرة
البورسليكات الزجاجيةVWR47729-570ND Formulation
GraphPad (البرنامج)DotmaticsN / Aفحص الجدوى الخميرة
حمام صوتنةساخن VWRN / AND Formulaton
التدفئة ووحدة النيتروجينالحرارية العلميةTS-18822ND تركيبة
HiTrap Heparin HP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03تنقية
الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside فيشر العلميBP1755التعبير
J-25 جهاز الطرد المركزيبيكمان كولترJ325-IM-2التعبير
JA-14 الدواربيكمان كولتر339247 التعبير
LyophilizerLabconco7755030ND الصيغة
الميثانولفيشر ScientificA452-4ND صياغة
غاز النيتروجينPraxairUN1066ND Formula
NZCYM mediaRPI Research ProductsN7200-1000.0التوسع & التعبير
Pet-22B ناقلاتGenScriptN / Aالتحول
طبق بتريفيشر FB0875718 العلميالتحول & توسيع
كوفيتز الكوارتزفيشر العلامة التجارية14385 928Aالتحليل الطيفي
حاضنة اهتزازنيو برونزويك العلميM1344-0004التحول والتوسع و Expression
Slide-A-Lyzer BuoysThermo Scientific66430تنقية
SnakeSkin أنابيب غسيل الكلىThermo Scientific68100تنقية
SnakeSkin غسيل الكلىThermo Scientific88243تنقية
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS271تنقية
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةفيشر ScientificS374-500تنقية
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةفيشر ScientificBP329-500تنقية
/ POR مرجحةإغلاق الطيف الصناعات الطبية132736تنقية
مقياس الطيفShimadzu UV-1800220-92961-01التحليل الطيفي
الطرد المركزي المنضديةبيكمان كولتر366816ND Formula
UVProbe 2.61 (البرنامج)ShimadzuN / Aالتحليل الطيفي
مرشح فراغMillipore9004-70-0التعبير & مضخة تفريغ تنقية
GAST Manufacturing IncDOA-P704-AAالتعبير & تنقية
دوامةفيشر العلمية12-812ND التركيبة
الخميرةN / ABY4741الخميرة
مستخلص الخميرة - البيبتون - سكر العنبBD242820صلاحية الخميرة
التحول أنابيب أنابيب أطياف الضوئي فحص والجدوى فحص

المراجع

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119(2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704(2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195(2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454(2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022(2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777(2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065(2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28(2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66(2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722(2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617(2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تركيبة الأقراص النانويةالأقراص النانوية النشطة بيولوجياًأقراص أمفوتيريسين ب النانويةبروتين السقالةجسيمات الطبقة الليبيدية المزدوجة النانويةأقراص إيصال الأدوية النانويةمطيافية الأشعة فوق البنفسجية والمرئيةأنابيب الديلزةتثبيط نمو الخميرةالعوامل النشطة بيولوجياً الكارهة للماء
صياغة وتوصيف العوامل النشطة بيولوجيا المحتوية على أقراص نانوية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.