Method Article

صياغة وتوصيف العوامل النشطة بيولوجيا المحتوية على أقراص نانوية

DOI:

10.3791/65145

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف إنتاج وتوصيف العوامل النشطة بيولوجيا التي تحتوي على أقراص نانوية. تؤخذ أقراص الأمفوتريسين B النانوية كمثال لوصف البروتوكول بطريقة تدريجية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشير مصطلح القرص النانوي إلى نوع منفصل من الجسيمات النانوية يتكون من طبقة ثنائية تشكل الدهون ، وبروتين سقالة ، وعامل نشط بيولوجيا متكامل. يتم تنظيم الأقراص النانوية كطبقة ثنائية دهنية على شكل قرص يحيط محيطها ببروتين السقالة ، وعادة ما يكون عضوا في عائلة البروتين الشحمي القابل للتبادل. تم إذابة العديد من العوامل النشطة بيولوجيا الكارهة للماء بكفاءة في الأقراص النانوية من خلال دمجها في الوسط الكارهة للماء للطبقة المزدوجة الدهنية للجسيمات ، مما ينتج عنه مجموعة متجانسة إلى حد كبير من الجسيمات في نطاق 10-20 نانومتر في القطر. تتطلب صياغة الأقراص النانوية نسبة دقيقة من المكونات الفردية ، وإضافة متسلسلة مناسبة لكل مكون ، تليها صوتنة الحمام لخليط الصياغة. يتصل بروتين السقالة البرمائية تلقائيا ويعيد تنظيم الطبقة المزدوجة المشتتة التي تشكل خليط من الدهون / العامل النشط بيولوجيا لتشكيل مجموعة منفصلة ومتجانسة من جزيئات الأقراص النانوية. خلال هذه العملية ، ينتقل خليط التفاعل من مظهر عكر معتم إلى عينة موضحة ، عند تحسينها بالكامل ، لا تنتج أي ترسب عند الطرد المركزي. تتضمن دراسات التوصيف تحديد كفاءة ذوبان العوامل النشطة بيولوجيا ، والمجهر الإلكتروني ، وكروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، والتحليل الطيفي للامتصاص المرئي فوق البنفسجي (UV / Vis) ، و / أو التحليل الطيفي الفلوري. يتبع ذلك عادة تحقيق النشاط البيولوجي باستخدام الخلايا المستزرعة أو الفئران. في حالة الأقراص النانوية التي تحتوي على مضاد حيوي (أي مضاد حيوي ماكرولايد بوليين أمفوتريسين ب) ، يمكن قياس قدرتها على تثبيط نمو الخميرة أو الفطريات كدالة للتركيز أو الوقت. إن السهولة النسبية للصياغة ، والتنوع فيما يتعلق بالأجزاء المكونة ، وحجم الجسيمات النانوية ، والاستقرار المتأصل ، والذوبان المائي تسمح بعدد لا يحصى من التطبيقات في المختبر وفي الجسم الحي لتكنولوجيا الأقراص النانوية. في هذه المقالة ، نصف منهجية عامة لصياغة وتوصيف الأقراص النانوية التي تحتوي على الأمفوتريسين B كعامل نشط بيولوجيا كاره للماء.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات الدهنية عالية الكثافة القرصية الوليدة (HDLs) هي أسلاف تحدث بشكل طبيعي ل HDL الكروي الأكثر وفرة الموجود في الدورة الدموية البشرية. هذه الجسيمات الوليدة ، التي يشار إليها أيضا باسم HDL pre-ß ، تمتلك خصائص هيكلية فريدة ومميزة1. في الواقع ، بدلا من الوجود كجسيم كروي ، فإن HDLs الوليدة على شكل قرص. كشفت دراسات التوصيف الهيكلي المكثفة على HDLs القرصية الطبيعية والمعاد تشكيلها أنها تتكون من طبقة ثنائية فوسفوليبيد محيطها محاط ببروتين شحمي برمائي قابل للتبادل (apo) ، مثل apoA-I. في استقلاب البروتين الدهني البشري ، تتراكم HDLs الوليدة المنتشرة الدهون من الخلايا المحيطية وتنضج إلى HDLs كروية في عملية تعتمد على وسطاء البروتين الرئيسيين ، بما في ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحويل وتعبير وتنقية مكون بروتين السقالة

  1. التحول البكتيري BL21 مع البلازميد المحتوي على apoE4-NT
    1. قم بإذابة أنبوب من الخلايا المختصة BL21 (DE3) على الجليد لمدة 10 دقائق.
    2. بمجرد ذوبان كل الجليد ، امزج بلطف وبعناية ماصة 50 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب تحويل على الجليد.
    3. أضف 5 ميكرولتر تحتوي على 50 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد (للتسلسل ، انظر الجدول التكميلي 1) إلى خليط الخلية. حرك الأنبوب بعناية أربع أو خمس مرات للخلط. لا دوامة.
    4. ضع الخليط على الثلج لمدة 30 دقيقة.
    5. صدم الخليط بالحرارة عند 42 درجة مئوية بالضبط لمدة 10 ثوان.
    6. ضعه على الثلج لمدة 5 دقائق.
    7. ما....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عملية صياغة القرص النانوي للعامل النشط بيولوجيا
في إجراء صياغة ampB-nanodisk الموصوف ، يعتبر التفاعل كاملا عندما ينتقل مظهر العينة من العكر إلى الصافي (الشكل 1). يشير هذا التغيير إلى أن الأقراص النانوية قد تشكلت وأن العامل النشط بيولوجيا قد تم إذابته. في كثير من الأحيان ، تمتص العوامل النشطة بيولوجيا الضوء في منطقة الطول الموجي المرئي (على سبيل المثال ، ampB ، الكركمين ، اللوتين ، الإنزيم المساعد Q10) ، وفي هذه الحالات ، تعتمد العينة لون العامل النشط بيولوجيا. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر صياغة عامل نشط بيولوجيا يحتوي على أقراص نانوية طريقة ملائمة لإذابة المركبات الكارهة للماء غير القابلة للذوبان. نظرا لأن الأقراص النانوية للعامل النشط بيولوجيا للمنتج قابلة للذوبان بالكامل في الوسائط المائية ، فإنها توفر طريقة توصيل مفيدة لمجموعة واسعة من الجزيئات الكارهة للماء (الجدول 1). وتشمل هذه الجزيئات الصغيرة ، والأدوية الطبيعية والاصطناعية ، والمغذيات النباتية ، والهرمونات ، إلخ. عادة ما تتبع استراتيجية الصياغة بروتوكولا قياسيا يجب أن يأخذ في الاعتبار خصائص الذوبان للعامل النشط بيولوجيا في ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (R37 HL-64159).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أمفوتريسين بشركة كايمان للكيماويات11636ND التركيبة & التحضير القياسي
أمبيسلينفيشر BP17925 العلميةللتحول & التوسع
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN / Aالتحول
محير قارورةنيو برونزويك العلميةN / Aالتوسع & التعبير
BL21 المختص E coliنيو إنجلاند BiolabsC2527Iزجاجات
الطرد المركزيNalgene3140-0250التعبير
عن الكلوروفورمفيشر ScientificG607-4ND الصيغة
DMSOSigma Aldrich472301قياسي Prepartation
DymyristoylphosphatidylcholineAvanti Lipids850345PND الصيغة
قارورة ErlenmeyerBellco BiotechnologyN / Aالتوسع & أنابيب الصقر للتعبير
Sarstedt Ag & CoD51588فحص الجدوى الخميرة
البورسليكات الزجاجيةVWR47729-570ND Formulation
GraphPad (البرنامج)DotmaticsN / Aفحص الجدوى الخميرة
حمام صوتنةساخن VWRN / AND Formulaton
التدفئة ووحدة النيتروجينالحرارية العلميةTS-18822ND تركيبة
HiTrap Heparin HP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03تنقية
الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside فيشر العلميBP1755التعبير
J-25 جهاز الطرد المركزيبيكمان كولترJ325-IM-2التعبير
JA-14 الدواربيكمان كولتر339247 التعبير
LyophilizerLabconco7755030ND الصيغة
الميثانولفيشر ScientificA452-4ND صياغة
غاز النيتروجينPraxairUN1066ND Formula
NZCYM mediaRPI Research ProductsN7200-1000.0التوسع & التعبير
Pet-22B ناقلاتGenScriptN / Aالتحول
طبق بتريفيشر FB0875718 العلميالتحول & توسيع
كوفيتز الكوارتزفيشر العلامة التجارية14385 928Aالتحليل الطيفي
حاضنة اهتزازنيو برونزويك العلميM1344-0004التحول والتوسع و Expression
Slide-A-Lyzer BuoysThermo Scientific66430تنقية
SnakeSkin أنابيب غسيل الكلىThermo Scientific68100تنقية
SnakeSkin غسيل الكلىThermo Scientific88243تنقية
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS271تنقية
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةفيشر ScientificS374-500تنقية
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةفيشر ScientificBP329-500تنقية
/ POR مرجحةإغلاق الطيف الصناعات الطبية132736تنقية
مقياس الطيفShimadzu UV-1800220-92961-01التحليل الطيفي
الطرد المركزي المنضديةبيكمان كولتر366816ND Formula
UVProbe 2.61 (البرنامج)ShimadzuN / Aالتحليل الطيفي
مرشح فراغMillipore9004-70-0التعبير & مضخة تفريغ تنقية
GAST Manufacturing IncDOA-P704-AAالتعبير & تنقية
دوامةفيشر العلمية12-812ND التركيبة
الخميرةN / ABY4741الخميرة
مستخلص الخميرة - البيبتون - سكر العنبBD242820صلاحية الخميرة
التحول أنابيب أنابيب أطياف الضوئي فحص والجدوى فحص

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nanodisk FormulationBioactive NanodisksAmphotericin B NanodisksScaffold ProteinLipid Bilayer NanoparticlesDrug Delivery NanodisksUV Visible SpectroscopyDialysis TubingYeast Growth InhibitionHydrophobic Bioactive Agents

Related Articles