هنا ، نصف تحسنا في طريقة شبه المختبر (SIV) لمراقبة توجيه أنبوب حبوب اللقاح واستقباله في Arabidopsis thaliana ، مما يزيد من تقبل البويضات. قد تقترن طريقة SIV مع الحاجز عالي الإنتاجية بخطوط علامات النبات المشيجي وأجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا لمراقبة عملية الإخصاب الديناميكية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير الحي لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح العربي والإخصاب المزدوج باستخدام طريقة الحاجز شبه المختبري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في النباتات الزهرية، يعد نمو أنبوب حبوب اللقاح وتوجيهه (النبات المشيجي الذكري) داخل المدقة واستقبال أنبوب حبوب اللقاح بواسطة النبات المشيجي الأنثوي ضروريين للتخصيب المزدوج وتطور البذور لاحقا. تبلغ التفاعلات بين النباتات المشيجية الذكرية والأنثوية أثناء استقبال أنبوب حبوب اللقاح ذروتها في تمزق أنبوب حبوب اللقاح وإطلاق حيوانين منويين لإحداث الإخصاب المزدوج. نظرا لأن نمو أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج مخفيان بعمق داخل أنسجة الزهرة ، فمن الصعب ملاحظة هذه العملية في الجسم الحي.
تم تطوير وتنفيذ طريقة شبه مخبرية (SIV) لتصوير الخلايا الحية للتخصيب في النبات النموذجي Arabidopsis thaliana في العديد من التحقيقات. ساعدت هذه الدراسات في توضيح السمات الأساسية لكيفية حدوث عملية الإخصاب في النباتات المزهرة والتغيرات الخلوية والجزيئية التي تحدث أثناء تفاعل النباتات المشيجية الذكرية والأنثوية. ومع ذلك ، نظرا لأن تجارب تصوير الخلايا الحية هذه تتضمن استئصال البويضات الفردية ، فإنها تقتصر على عدد قليل من الملاحظات لكل جلسة تصوير ، مما يجعل هذا النهج مملا ويستغرق وقتا طويلا للغاية. من بين الصعوبات التقنية الأخرى ، غالبا ما يتم الإبلاغ عن فشل أنابيب حبوب اللقاح في تخصيب البويضات في المختبر ، مما يربك بشدة مثل هذه التحليلات.
هنا ، يتم توفير بروتوكول فيديو مفصل لتصوير استقبال أنبوب حبوب اللقاح والتخصيب بطريقة آلية وعالية الإنتاجية ، مما يسمح بما يصل إلى 40 ملاحظة لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح وتمزيقه لكل جلسة تصوير. إلى جانب استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا وخطوط العلامات ، تتيح هذه الطريقة توليد أحجام عينات كبيرة مع تقليل استثمار الوقت. يتم تفصيل الفروق الدقيقة والنقاط الحرجة للتقنية ، بما في ذلك تدريج الزهور ، وتشريح ، وإعداد المتوسط ، والتصوير ، بوضوح في شكل فيديو لتسهيل البحث المستقبلي حول ديناميكيات توجيه أنبوب حبوب اللقاح والاستقبال والإخصاب المزدوج.
المقدمة
يعتمد توليد نسل فريد وراثيا في الكائنات الحية التي تتكاثر جنسيا على الاندماج الناجح للجاميتات الذكرية والأنثوية. في النباتات الزهرية، يعتمد تفاعل جاميتين ذكريتين (منوية) مع جاميتين أنثويتين (البويضة والخلية المركزية) أثناء الإخصاب المزدوج على إطلاق الحيوانات المنوية من أنبوب حبوب اللقاح (النبات المشيجي الذكري). يتم التحكم في هذه العملية ، التي تسمى استقبال أنبوب حبوب اللقاح ، إلى حد كبير بواسطة الخلايا التآزرية الموجودة داخل كيس الجنين (النبات المشيجي الأنثوي)1,2. نظرا لأن استقبال أنبوب حبوب اللقاح يحدث في عمق الزهرة ، فقد تم إنشاء طريقة تسمح بتصوير الخلايا الحية للعملية ، تسمى استقبال أنبوب حبوب اللقاح شبه المختبري (SIV)، 3. باستخدام هذه الطريقة ، يتم وضع بويضات Arabidopsis المستأصلة على وسط إنبات حبوب اللقاح شبه السائلة ويتم استهدافها بواسطة أنابيب حبوب اللقاح التي تنمو من خلال وصمة العار وأسلوب المدقة المقطوعة عند تقاطع المسالك الناقلةللنمط 3،4. منذ تطوير هذه التقنية ، أدت الملاحظات التفصيلية إلى العديد من الاكتشافات المحيطة بتوجيه أنبوب حبوب اللقاح واستقباله وإخصابه. من بين أمور أخرى ، تشمل هذه الاكتشافات اكتساب أنبوب حبوب اللقاح الذي يستهدف الكفاءة من خلال النمو من خلال وصمة العار3 ، وبداية تذبذبات الكالسيوم داخل الخلايا في التآزر عند وصول أنبوب حبوب اللقاح5،6،7،8،9 ، وديناميكيات إطلاق خلايا الحيوانات المنوية والتخصيب عند انفجار أنبوب حبوب اللقاح10 . ومع ذلك ، نظرا لأن هذه التقنية تعتمد على استئصال البويضات ، فإن ملاحظات الإخصاب محدودة العدد ، وغالبا ما يكون استقبال أنبوب اللقاح شاذا ، مما يؤدي إلى فشل تمزق أنبوب حبوب اللقاح (الفيديو 1 والملف التكميلي 1). لذلك ، هناك حاجة إلى نهج أكثر كفاءة يسمح بإجراء تحليلات عالية الإنتاجية لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح وتخصيبها.
عند تطوير هذا البروتوكول ، تم اختبار العديد من الأساليب الجديدة لتحليل استقبال أنبوب حبوب اللقاح ، والتي تمتد من أكثر الطرق "في المختبر" إلى أكثر الطرق "في الجسم الحي" ، وتم الاستقرار على تقنية فعالة تعتمد على استئصال الحاجز بأكمله ، مما يسمح بما يصل إلى 40 ملاحظة للتخصيب يوميا. هنا ، يتم تحديد الفروق الدقيقة والنقاط الحرجة لهذه التقنية ، بما في ذلك مراحل الزهور ، والتشريح ، والتحضير المتوسط ، وإعدادات التصوير. باتباع هذا البروتوكول ، يجب تسهيل الأبحاث التي تركز على توجيه أنبوب حبوب اللقاح واستقبال أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج. من المتوقع أن تعزز أحجام العينات الأعلى التي تسمح بها الطريقة السلامة العلمية للاستنتاجات المستخلصة من تجارب التصوير الحي. تشمل التطبيقات المحتملة لهذه التقنية ، على سبيل المثال لا الحصر ، إجراء ملاحظات للتغيرات الجزيئية والفسيولوجية في تركيزات الكالسيوم الخلوية ([Ca2+]cyt) ، أو درجة الحموضة ، أو H 2 O2أثناء تفاعلات المشيجات من خلال استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة التغيرات الخلوية ، مثل تنكس التآزر المستقبلي ، أو هجرة خلايا الحيوانات المنوية ، أو الزواج النووي ، بسهولة أكبر باستخدام هذه الطريقة المحسنة. أخيرا ، يمكن مراقبة توقيت المراحل المختلفة للإخصاب تحت المجهر واسع المجال ، ومن ثم يمكن إجراء تحليلات أكثر تفصيلا باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM) أو مجهر الإثارة ثنائي الفوتون (2PEM) للحصول على دقة أعلى وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على قائمة بالمواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. اعتبارات لتصميم تجربة التصوير
- حدد مسبقا مدة التصوير وتردد أخذ العينات المطلوب لالتقاط الظاهرة المطلوبة المراد ملاحظتها. على سبيل المثال ، باتباع نظرية أخذ العينات ل Nyquist ، يجب أن يكون تردد أخذ العينات أكبر من ضعف أعلى تردد لعينة الإدخال. لذلك ، لالتقاط تذبذبات الخلايا التآزرية [Ca2+] بدقة ، قم بإجراء التصوير كل 10 ثوان تقريبا ، ولكن لقياس سرعة خلايا الحيوانات المنوية عند تفريغ أنبوب حبوب اللقاح ، تأكد من دقة زمنية أقل من 1 ثانية10.
- حدد علامات الفلورسنت للخلايا ذات الأهمية التي تكون ساطعة بدرجة كافية خارج التألق الذاتي في الخلفية. لاستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية ، حدد الخطوط الأكثر سطوعا التي لا تزعج وظيفة الخلية ، لأنها أكثر حساسية بشكل عام وتتطلب وقت تعرض أقل.
- ضع في اعتبارك أي نوع من الفحص المجهري الفلوري والتكبير هو الأنسب لالتقاط الظاهرة المطلوبة. استخدم المجهر واسع المجال وأهداف التكبير المنخفض لالتقاط الضوء من عمق مجال أكبر ، والحفاظ على التركيز بمرور الوقت ، أو تصوير كائنات أكبر مثل البويضات الكاملة ، أو استخدام مستشعرات القياس النسبي الحساسة لعناصر التحول اللوني. استخدم CLSM أو 2PEM مع أهداف تكبير عالية للحصول على دقة أفضل للكائنات الخلوية ودون الخلوية ، ولكن لاحظ صعوبة الحفاظ على التركيز بمرور الوقت.
- تقدير عدد العينات المراد تصويرها لكل تجربة. على سبيل المثال ، استخدم هدف 10x مع حد أدنى لوقت أخذ العينات يبلغ ~ 30 ثانية لتصوير ثلاثة حواجز وتصوير ما يصل إلى 40 حدث إخصاب لكل تجربة بسبب الوقت اللازم لوظائف التركيز البؤري التلقائي والاستحواذ متعدد المراحل.
2. إعداد حبوب اللقاح إنبات المتوسطة
- تحضير وسط إنبات حبوب اللقاح السائلة (5mM CaCl2 ، 1mM MgSO4 ، 5mM KCl ، 0.01٪ [w / v] H 3 BO3، و 10٪ [w / v] السكروز) باستخدام مخزون 1 M من كل مغذيات دقيقة ، والتي يتم تخزينها عند -20 درجة مئوية. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5 مع 0.1 M KOH. يخزن الوسط في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
ملاحظة: قد ينخفض الرقم الهيدروجيني بمرور الوقت. - أضف 2.5 مل من الوسط السائل إلى دورق 10 مل ، وأضف ببطء 32 مجم من أغاروز نقطة الانصهار المنخفضة للغاية (~ 1.3٪) بقضيب تحريك سريع الدوران لتجنب التكتل.
- تذوب الأغاروز على لوح تسخين عند 65 درجة مئوية ، وتدحرج الدورق لتجميع أي تكاثف من الجوانب.
- ماصة 130 ميكرولتر من الوسط في بئر 14 مم من طبق سفلي زجاجي 35 مم ، وقم بتدوير الطبق حتى يغطي الوسط البئر.
- نضح ما مجموعه 40 ميكرولتر مع ماصة من وسط الطبق ، تاركا وراءه حجما إجماليا قدره 90 ميكرولتر.
ملاحظة: يمكن استنشاق المزيد من الوسائط من البئر لتحقيق حجم إجمالي أقل ؛ قد يكون هذا ضروريا لأهداف التكبير العالية مع مسافات عمل منخفضة. ومع ذلك ، كلما كانت وسادة أجار أرق ، زادت سرعة جفافها. - قم بتبريد الطبق على كتلة من الألومنيوم في غرفة الرطوبة لضمان التبريد المتساوي. قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل لاستخدامها في صباح اليوم التالي.
3. التدريج الزهري للمتبرعين بالحاجز ، والمتبرعين بالوصم ، والمتبرعين بحبوب اللقاح
الشكل 1: التدريج الزهري للمتبرعين بالحاجز ، والمتبرعين بالوصمة ، والمتبرعين بحبوب اللقاح. (أ) مراحل أزهار أرابيدوبسيس (Ler-0) داخل الإزهار. يجب إضعاف البراعم في المرحلة 12B ، التي تحتوي على بتلات على وشك الفتح وأنثرات صفراء غير مهذبة ، عن طريق إزالة جميع الكؤوس والبتلات والأسدية. يمكن بعد ذلك استخدام المدقات (التي تؤوي صانعة المشيجات الأنثوية) كمتبرعين بالحاجز بعد 24 ساعة. (ب) مراحل أزهار أرابيدوبسيس (Col-0) داخل الإزهار. يجب إضعاف البراعم في المرحلة 12B ، والتي تحتوي على أنثرات صفراء غير متجانسة ووصمات بالكاد تخرج من البتلات ، عن طريق إزالة جميع الكؤوس والبتلات والأسدية. يمكن بعد ذلك استخدام المدقات كمتبرعين بالوصمة بعد 24 ساعة ، عندما يجب تلقيحها بالزهور (التي تؤوي علامة النبات المشيجي الذكري) المفتوحة وتساقط حبوب اللقاح. يجب تشريح الوصمات الملقحة في غضون 1 ساعة من التلقيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- في صباح اليوم السابق للتصوير ، اختر نباتات Arabidopsis لاستخدامها كمتبرعين بالحاجز ومتبرعين بالوصمة ؛ تأكد من أنها صحية وبدأت مؤخرا في إنتاج السيليك.
ملاحظة: Landsberg erecta (Ler-0) هو انضمام جيد للاستخدام كمتبرع للحاجز ، نظرا لأن حاجزه قوي ، وهناك أجزاء داخلية صغيرة بين البويضات. كولومبيا (Col-0) هي انضمام جيد لاستخدامها كمتبرع بوصمة العار لأنها تبدو مواتية لنمو أنبوب حبوب اللقاح. - قم بعزل ما لا يقل عن ثلاث أزهار مانحة للحاجز الأنفي من المرحلة 12B و 12 من المرحلة 12B من الزهور المانحة للوصمة عن طريق إزالة الأسدية والكؤوس والبتلات (الشكل 1 أ ، ب). قم أيضا بإزالة الزهور القديمة على نفس الإزهار ، والتي يمكن أن تلقيح الزهرة المخصبة.
- في الصباح ، بعد 24 ساعة ، قم بتلقيح المتبرعين بالوصمة بأزهار المتبرعين بحبوب اللقاح (على سبيل المثال ، إيواء أنبوب حبوب اللقاح أو علامات خلايا الحيوانات المنوية) التي تتساقط حبوب اللقاح بسهولة. يكتمل التلقيح عندما تكون الوصمات مغطاة بالكامل تقريبا بحبوب اللقاح (الشكل 1 ب).
4. تشريح الحاجز
الشكل 2: دليل سريع لتشريح الحاجز ووصمة العار. أ: خطوات تشريح الحاجز. ثبت المدقة على شريط على الوجهين بإبرة حقنة الأنسولين ، وقم بعمل جروح عند تقاطع المبيض الأنيق وتقاطع المبيض وعنيق ، متبوعا بقطع ضحل على طول حاجز أي من الكربل (الخطوة 1). قشر جدران الكاربل مرة أخرى على الشريط (الخطوة 2). قطع البرقوق تحت الحاجز العلوي (الخطوة 3). قطع الحاجز في النمط ، وإزالة باستخدام ملقط في pedicel (الخطوة 4). ضع الحاجز الأنفي على وسائط أجار ، وقم بتضمينه برفق بالملقط. (ب) خطوات تشريح وصمة العار. ثبت المدقة (الملقحة <1 ساعة من قبل) على شريط على الوجهين ، واقطعها عند تقاطع المبيض الأنيق بشفرة حلاقة (الخطوة 6). ضع وصمة العار على وسط أجار بإبرة أنسولين بجوار الحاجز ، واضبط المسافة إلى حوالي 250 ميكرومتر (الخطوات 7-8). تأكد من أن تجمع شبه سائل يتشكل حول الميكروبايل وقاعدة الأنماط (الخطوة 9). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- بعد ثلاثين دقيقة من التلقيح ، اجمع مدقات مانحة للحاجز الصحي والناضج عند عنيق ، وضعها على شريط لاصق جديد على الوجهين مثبت على شريحة زجاجية ، مع لصق وصمة العار من حافة الشريط.
ملاحظة: حدد وقت التشريح الذي توجد فيه المدقات على الشريط اللاصق للتأكد من أنها قصيرة قدر الإمكان. يجب إجراء التشريح في رطوبة عالية ، والتي يمكن تحقيقها عن طريق وضع مرطب بجوار الشريحة. - ثبت المدقة بإحكام على الشريط عن طريق الضغط برفق على عنيق وعلى طول المبيض باستخدام الجانب الخلفي من إبرة حقنة الأنسولين الجديدة قبل إزالة حطام الكؤوس والبتلة والسداة المتبقية من الإخصاء.
- تحت المجسمة ، استخدم إبرة حقنة الأنسولين لعمل قطعتين لكل كربل عند تقاطع نمط المبيض وتقاطع المبيض وعنيق ، متبوعا بجروح ضحلة على طول حاجز كل كربل (الشكل 2 ، الخطوة 1).
ملاحظة: سيؤدي القطع بعمق شديد على طول الحاجز إلى قطع البويضات عند القطار الجبلي المائل. - قشري جدران المبيض بعناية على الشريط (الشكل 2 ، الخطوة 2) ، وحركي الإبرة برفق بين الحاجزين لقطع البرقوق بطول المدقة بالكامل دون إزعاج البويضات (الشكل 2 ، الخطوة 3).
ملاحظة: قطع replum في الاتجاه من النمط إلى عنيق لضمان أن البويضات على الحاجز العلوي يتم إزعاجها بأقل قدر ممكن. - قطع الحاجز العلوي برفق عند كل من التقاطع مع النمط ومع عنيق ، وإزالة الحاجز مع ملقط من جانب عنيق (الشكل 2 ، الخطوة 4).
ملاحظة: حافظ على هذا القطع مستقيما ولطيفا حتى يظل الحاجز مسطحا ولا ينحني. - ضع الحاجز بشكل مسطح قدر الإمكان على الوسط بحيث تكون ميكروبيلات البويضات متجهة لأعلى وفي نفس المستوى البؤري. اضغطي على الحاجز برفق في الوسط حتى تندمج البويضات قليلا في الوسط (الشكل 2 ، الخطوة 5).
ملاحظة: من الأهمية بمكان وضع الحاجز بحيث تكون ميكروبيلات البويضات في متناول أنابيب حبوب اللقاح (يمكن إعادة ترتيب أي بويضات يتعذر الوصول إليها برفق بإبرة). يجب أن تتشكل بركة صغيرة من السائل حول الحاجز بعد التضمين. - كرر الخطوات 4.1-4.6 لما يصل إلى مدقات أخرى ، مع وضع الحاجز من طرف إلى طرف.
5. تشريح وصمة العار
- ضع المدقات المانحة للوصمة الملقحة على شريط لاصق جديد على الوجهين مثبت على شريحة زجاجية ، بحيث يكون التقاطع على شكل المبيض بعيدا عن حافة الشريط (الشكل 2 ، الخطوة 6).
- استخدم شفرة حلاقة جديدة لقص النمط بشكل مستقيم ورفعه بعيدا للحفاظ على وصمة العار المرتبطة بالشفرة (الشكل 2 ، الخطوة 6).
ملاحظة: قص على حافة الشريط للحصول على أنظف قطع. - أزيلي وصمة العار من الشفرة بإبرة حقنة الأنسولين ، وضعيها بشكل مسطح حوالي 250-300 ميكرومتر من البويضات (الشكل 2 ، الخطوات 7-8).
ملاحظة: يجب توجيه النمط أفقيا على جانبه ؛ خلاف ذلك ، فإن معظم أنابيب حبوب اللقاح سوف تنمو أسفل الحاجز. يجب أن تظهر بركة صغيرة من السائل عند دخول النمط بعد أن تكون ملقاة على الوسط لمدة 1 دقيقة ؛ هذه علامة جيدة ، حيث سيكون لأنابيب حبوب اللقاح خروج سلس من النمط. - كرر الخطوات 5.1-5.3 لما يصل إلى 12 وصمة، وضع اثنتين على جانبي كل حاجز. ابحث عن مجموعة صغيرة من السوائل تتشكل حول ميكروبايل البويضات. يساعد هذا في إمكانية الوصول إلى أنابيب حبوب اللقاح واستهدافها إلى أكياس الجنين (الشكل 2 ، الخطوة 9).
ملاحظة: حدد مقدار الوقت الذي يكون فيه الطبق مفتوحا لمنع جفاف الوسط والبويضات.
6. التصوير
الشكل 3: مخطط تصوير الحاجز مع SIV. (أ) الإعداد الكامل ل SIV مع الحاجز مع 12 وصمة ملقحة و 3 حواجز ، كما يظهر من خلال مجسم. (ب) صور مدمجة لإعداد SIV مع الحاجز الكامل الذي شوهد في A 5 h بعد الحضانة باستخدام هدف 10x ، مع وضع علامة على مناطق النظرة العامة الخمسة (~ 1 مم لكل منها) للاكتساب متعدد المراحل. تظهر المربعات الخضراء البويضات التي تلقت أنابيب حبوب اللقاح وهي تخضع لانفجار متفجر في التآزر. (ج) عرض أقرب لمنطقة النظرة العامة 2 في نقاط زمنية مختلفة. بعد حوالي 3 ساعات من الحضانة في غرفة الرطوبة على المجهر ، يجب أن تصل أنابيب حبوب اللقاح بالقرب من الميكروبات ، وبحلول 6 ساعات من التصوير ، يجب أن تكون معظم البويضات قد تلقت أنابيب حبوب اللقاح بشكل صحيح (المربعات الخضراء) ؛ ثم تخضع هذه البويضات لانفجار أنبوب حبوب اللقاح المتفجر (علامة النجمة). قضبان المقياس = (A) 5 مم ، (B ، C) 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
- بمجرد الانتهاء من التشريح ويصبح الطبق جاهزا للتصوير ، اتركه يحتضن في غرفة رطوبة على المجهر يتم الحفاظ عليه عند رطوبة نسبية 92٪ و 21 درجة مئوية.
ملاحظة: في حالة عدم توفر حجرة رطوبة للمجهر ، فإن تبطين الحواف الخارجية للغطاء والطبق بكمية صغيرة من الماء سيساعد في الحفاظ على مستوى عال من الرطوبة في الطبق. - ضع العينات في التركيز تحت برايت فيلد بكثافة إضاءة منخفضة ، ثم قم بالتبديل إلى ضوء الفلورسنت ، مع تحديد مناطق العينة في نظرة عامة على المرحلة المراد تصويرها.
ملاحظة: عند التكبير 10x ، يمكن تمييز حوالي خمس مناطق لما مجموعه ثلاثة حواجز (الشكل 3). الحد من مقدار الوقت المستخدم لوضع علامات على مناطق النظرة العامة لتقليل السمية الضوئية أو ارتفاع درجة حرارة العينة بواسطة ضوء الفلورسنت. - ابدأ التصوير باستخدام مخطط اكتساب متعدد المراحل مع وظيفة التركيز البؤري التلقائي في بداية كل منطقة نظرة عامة. نظرا لأن أنابيب حبوب اللقاح ستخرج من النمط ~ 1 h بعد احتضان العينة ، قم بتأخير الاكتساب بمقدار 2 ساعة أو حتى تصل أنابيب حبوب اللقاح إلى micropyle. تأكد من ضبط التركيز البؤري التلقائي بنطاق 100 ميكرومتر (خطوات كبيرة 7 ميكرومتر وخطوات دقيقة 1 ميكرومتر) للحفاظ على تركيز البويضات حيث يتحرك الحاجز قليلا ويغرق بمرور الوقت.
- أوقف التقاط الصورة ~ 9 ساعات بعد بدء حضانة العينة ، لأنه بحلول هذا الوقت ، يجب أن تكون معظم البويضات قد جذبت وتلقت أنبوب حبوب اللقاح.
ملاحظة: إذا كان عدد قليل من البويضات يجذب أنابيب حبوب اللقاح ، فإن الملاحظة الدقيقة للطبق تحت مجسمة مفيدة لتحديد كيفية تحسين اتجاه البويضة أو النمط في المرة القادمة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتقييم توقيت التنكس النووي في التآزر المستقبلي فيما يتعلق بتمزق أنبوب حبوب اللقاح في أرابيدوبسيس ، وكذلك لمراقبة ما إذا كان التآزر الأيسر أو الأيمن مقدرا مسبقا أن يصبح التآزر المستقبلي ، تم استخدام طريقة SIV cum septum الموصوفة هنا باستخدام علامة نووية أنثوية مشيجية مكدسة بعلامة خلوية تآزرية (pFG: roGFP2-ORP1-NLS ، pMYB98: roGFP2-ORP1) كمتبرع بالحاجز وعلامة المشيمة الذكرية (pLAT52: R-GECO) كمتبرع بحبوب اللقاح. تم تشريح الحاجز والوصمات الملقحة بعد 24 ساعة من الإخصاء ، وفقا للأقسام 4-5 م...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا فعالا لتصوير استقبال أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج في أرابيدوبسيس. الطريقة المحسنة ، SIV cum septum ، تزيد بشكل كبير من النسبة المئوية والعدد الإجمالي لأحداث استقبال أنبوب اللقاح الناجحة التي يمكن ملاحظتها لكل جلسة تصوير. تظهر النتائج التمثيلية الموضحة هنا جلسة تصوير مع 41 حدثا ناجحا لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح و 10 بويضات تظهر عيوب الاستقبال (~ 80٪ كفاءة). هذا هو أكثر من ضعف عدد أحداث استقبال أنبوب اللقاح الناجحة التي تم التقاطها في ما مجموعه ثماني جلسات تصوير باستخدام ط...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر سارة سيمونيني وستيفانو بينسيفينجا على التبرع ببناء pFG: roGFP2-ORP1-NLS وكريستوف إيشينبيرجر ويوهان ألميندينجر وفنسنت سوتر وسيليا بارو على نصائحهم بشأن الفحص المجهري. نرجو أن نعترف بنصيحة رافي بالانيفيلو وفيليب دينينجر وشارون كيسلر ومارك جونسون وتوموكازو كاواشيما وكل شخص آخر في المؤتمر الدولي للتكاثر الجنسي للنباتات 2022 الذين أبدوا اهتماما ببروتوكول بشأن SIV مع الحاجز. تم دعم هذا العمل من قبل جامعة زيورخ ومنح من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية إلى U.G.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شريحة زجاجية 1 مم ؛ | Epredia | 16211551 | |
| طبق سفلي زجاجي مقاس 35 مم (بئر 14 مم) | Mattek & nbsp ؛ | P35G-1.5-14-C | |
| كلوريد الكالسيوم | روث | CN93.1 | |
| كولومبيا (Col-0) | مركز نوتنغهام نبات الأرابيدوبسيس للمخزون (NASC) | متبرع بوصمة العار | |
| نطاق تشريح | أوليمبوس | SZX2-ILLT | |
| (0.3 جم) | دينار | بحريني 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | مركز نوتنغهام نبات الأرابيدوبسيس (NASC) | الحاجز المتبرع | |
| كبريتات المغنيسيوم | ميرك | 5886 | |
| كلوريد البوتاسيوم | روث | 6781.1 | |
| شفرة الحلاقة | Beldura | 7026797 | |
| سكوتش شريط مزدوج الوجه | سكوتش | 768720 | أقل سمكا وجيدة لتشريح وصمة العار |
| كلوريد الصوديوم | Roth | 3957.1 | |
| كواشف | السكروز | A2211،1000 | |
| Tesa شريط مزدوج الوجه | Tesa | 05681-00018 | لزج جدا وجيد لتشريح الحاجز |
| درجة حرارة التبلور المنخفضة للغاية الاغاروز | FMC SeaPrep | 50302 |
المراجع
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7(2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645(2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722(2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
