التصوير الحي لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح العربي والإخصاب المزدوج باستخدام طريقة الحاجز شبه المختبري

ملخص

هنا ، نصف تحسنا في طريقة شبه المختبر (SIV) لمراقبة توجيه أنبوب حبوب اللقاح واستقباله في Arabidopsis thaliana ، مما يزيد من تقبل البويضات. قد تقترن طريقة SIV مع الحاجز عالي الإنتاجية بخطوط علامات النبات المشيجي وأجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا لمراقبة عملية الإخصاب الديناميكية.

الملخص

في النباتات الزهرية، يعد نمو أنبوب حبوب اللقاح وتوجيهه (النبات المشيجي الذكري) داخل المدقة واستقبال أنبوب حبوب اللقاح بواسطة النبات المشيجي الأنثوي ضروريين للتخصيب المزدوج وتطور البذور لاحقا. تبلغ التفاعلات بين النباتات المشيجية الذكرية والأنثوية أثناء استقبال أنبوب حبوب اللقاح ذروتها في تمزق أنبوب حبوب اللقاح وإطلاق حيوانين منويين لإحداث الإخصاب المزدوج. نظرا لأن نمو أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج مخفيان بعمق داخل أنسجة الزهرة ، فمن الصعب ملاحظة هذه العملية في الجسم الحي.

تم تطوير وتنفيذ طريقة شبه مخبرية (SIV) لتصوير الخلايا الحية للتخصيب في النبات النموذجي Arabidopsis thaliana في العديد من التحقيقات. ساعدت هذه الدراسات في توضيح السمات الأساسية لكيفية حدوث عملية الإخصاب في النباتات المزهرة والتغيرات الخلوية والجزيئية التي تحدث أثناء تفاعل النباتات المشيجية الذكرية والأنثوية. ومع ذلك ، نظرا لأن تجارب تصوير الخلايا الحية هذه تتضمن استئصال البويضات الفردية ، فإنها تقتصر على عدد قليل من الملاحظات لكل جلسة تصوير ، مما يجعل هذا النهج مملا ويستغرق وقتا طويلا للغاية. من بين الصعوبات التقنية الأخرى ، غالبا ما يتم الإبلاغ عن فشل أنابيب حبوب اللقاح في تخصيب البويضات في المختبر ، مما يربك بشدة مثل هذه التحليلات.

هنا ، يتم توفير بروتوكول فيديو مفصل لتصوير استقبال أنبوب حبوب اللقاح والتخصيب بطريقة آلية وعالية الإنتاجية ، مما يسمح بما يصل إلى 40 ملاحظة لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح وتمزيقه لكل جلسة تصوير. إلى جانب استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا وخطوط العلامات ، تتيح هذه الطريقة توليد أحجام عينات كبيرة مع تقليل استثمار الوقت. يتم تفصيل الفروق الدقيقة والنقاط الحرجة للتقنية ، بما في ذلك تدريج الزهور ، وتشريح ، وإعداد المتوسط ، والتصوير ، بوضوح في شكل فيديو لتسهيل البحث المستقبلي حول ديناميكيات توجيه أنبوب حبوب اللقاح والاستقبال والإخصاب المزدوج.

المقدمة

يعتمد توليد نسل فريد وراثيا في الكائنات الحية التي تتكاثر جنسيا على الاندماج الناجح للجاميتات الذكرية والأنثوية. في النباتات الزهرية، يعتمد تفاعل جاميتين ذكريتين (منوية) مع جاميتين أنثويتين (البويضة والخلية المركزية) أثناء الإخصاب المزدوج على إطلاق الحيوانات المنوية من أنبوب حبوب اللقاح (النبات المشيجي الذكري). يتم التحكم في هذه العملية ، التي تسمى استقبال أنبوب حبوب اللقاح ، إلى حد كبير بواسطة الخلايا التآزرية الموجودة داخل كيس الجنين (النبات المشيجي الأنثوي)^1,2. نظرا لأن استقبال أنبوب حبوب اللقاح يحدث في عمق الزهرة ، فقد تم إنشاء طريقة تسمح بتصوير الخلايا الحية للعملية ، تسمى استقبال أنبوب حبوب اللقاح شبه

البروتوكول

ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على قائمة بالمواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. اعتبارات لتصميم تجربة التصوير

1. حدد مسبقا مدة التصوير وتردد أخذ العينات المطلوب لالتقاط الظاهرة المطلوبة المراد ملاحظتها. على سبيل المثال ، باتباع نظرية أخذ العينات ل Nyquist ، يجب أن يكون تردد أخذ العينات أكبر من ضعف أعلى تردد لعينة الإدخال. لذلك ، لالتقاط تذبذبات _{الخلايا} التآزرية [Ca²⁺] بدقة ، قم بإجراء التصوير كل 10 ثوان تقريبا ، ولكن لقياس سرعة خلايا الحيوانات المنوية عند تفريغ أنبوب حبوب اللقاح ، تأكد من دقة زمنية أقل من 1 ثانية¹⁰.
2. حدد علامات الفلورس....

النتائج

لتقييم توقيت التنكس النووي في التآزر المستقبلي فيما يتعلق بتمزق أنبوب حبوب اللقاح في أرابيدوبسيس ، وكذلك لمراقبة ما إذا كان التآزر الأيسر أو الأيمن مقدرا مسبقا أن يصبح التآزر المستقبلي ، تم استخدام طريقة SIV cum septum الموصوفة هنا باستخدام علامة نووية أنثوية مشيجية مكدسة بعلامة خلوية تآزرية (pFG: roGFP2-ORP1-NLS ، pMYB98: roGFP2-ORP1) كمتبرع بالحاجز وعلامة المشيمة الذكرية (pLAT52: R-GECO) كمتبرع بحبوب اللقاح. تم تشريح الحاجز والوصمات الملقحة بعد 24 ساعة من الإخصاء ، وفقا للأقسام 4-5 م.......

المناقشة

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا فعالا لتصوير استقبال أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج في أرابيدوبسيس. الطريقة المحسنة ، SIV cum septum ، تزيد بشكل كبير من النسبة المئوية والعدد الإجمالي لأحداث استقبال أنبوب اللقاح الناجحة التي يمكن ملاحظتها لكل جلسة تصوير. تظهر النتائج التمثيلية الموضحة هنا جلسة تصوير مع 41 حدثا ناجحا لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح و 10 بويضات تظهر عيوب الاستقبال (~ 80٪ كفاءة). هذا هو أكثر من ضعف عدد أحداث استقبال أنبوب اللقاح الناجحة التي تم التقاطها في ما مجموعه ثماني جلسات تصوير باستخدام ط.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
شريحة زجاجية 1 مم   ؛	Epredia	16211551
طبق سفلي زجاجي مقاس 35 مم (بئر 14 مم)	Mattek & nbsp ؛	P35G-1.5-14-C
كلوريد الكالسيوم	روث	CN93.1
كولومبيا (Col-0)	مركز نوتنغهام نبات الأرابيدوبسيس للمخزون (NASC)		متبرع بوصمة العار
نطاق تشريح	أوليمبوس	SZX2-ILLT
(0.3 جم)	دينار	بحريني 304000
Landsberg erecta (Ler-0)	مركز نوتنغهام نبات الأرابيدوبسيس (NASC)		الحاجز المتبرع
كبريتات المغنيسيوم	ميرك	5886
كلوريد البوتاسيوم	روث	6781.1
شفرة الحلاقة	Beldura	7026797
سكوتش شريط مزدوج الوجه	سكوتش	768720	أقل سمكا وجيدة لتشريح وصمة العار
كلوريد الصوديوم	Roth	3957.1
كواشف	السكروز	A2211،1000
Tesa شريط مزدوج الوجه	Tesa	05681-00018	لزج جدا وجيد لتشريح الحاجز
درجة حرارة التبلور المنخفضة للغاية الاغاروز	FMC SeaPrep	50302

إبرة الأنسولين ITW