مقالة منهجية

تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي

DOI:

10.3791/65206

⸱

يونيو 2, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics & Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 3Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 4Polytechnic Institute of Coimbra, Coimbra Health School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نعرض بروتوكولا محسنا قائما على مضان BODIPY 493/503 لتوصيف قطرات الدهون في أنسجة الكبد. من خلال استخدام الإسقاطات المتعامدة وإعادة البناء 3D ، يسمح الفلوروفور بالتمييز الناجح بين التنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية لتقييم التنكس الدهني الكبدي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قطرات الدهون (LDs) هي عضيات متخصصة تتوسط في تخزين الدهون وتلعب دورا مهما للغاية في قمع السمية الدهنية ومنع الخلل الوظيفي الناجم عن الأحماض الدهنية الحرة (FAs). الكبد ، نظرا لدوره الحاسم في استقلاب الدهون في الجسم ، مهدد باستمرار من خلال تراكم LDs داخل الخلايا في شكل تنكس دهني كبدي حويصلي وكبير. يعتمد التوصيف النسيجي ل LDs عادة على أصباغ ديازو القابلة للذوبان في الدهون ، مثل تلطيخ Oil Red O (ORO) ، ولكن هناك عددا من العيوب التي تعيق باستمرار استخدام هذا التحليل مع عينات الكبد. في الآونة الأخيرة ، أصبحت الفلوروفورات المحبة للدهون 493/503 شائعة لتصور وتحديد موقع LDs بسبب امتصاصها السريع وتراكمها في قلب قطرات الدهون المحايدة. على الرغم من أن معظم التطبيقات موصوفة جيدا في مزارع الخلايا ، إلا أن هناك أدلة أقل تثبت الاستخدام الموثوق لتحقيقات الفلوروفور المحبة للدهون كأداة تصوير LD في عينات الأنسجة. هنا ، نقترح بروتوكولا محسنا قائما على ثنائي بيروميثين البورون (BODIPY) 493/503 لتقييم LDs في عينات الكبد من نموذج حيواني لنظام غذائي عالي الدهون (HFD) الناجم عن تنكس دهني كبدي. يغطي هذا البروتوكول تحضير عينات الكبد ، وتقسيم الأنسجة ، وتلطيخ BODIPY 493/503 ، والحصول على الصور ، وتحليل البيانات. لقد أظهرنا زيادة في عدد وشدة ونسبة المساحة وقطر LDs الكبدية عند تغذية HFD. باستخدام الإسقاطات المتعامدة وإعادة البناء 3D ، كان من الممكن مراقبة المحتوى الكامل للدهون المحايدة في قلب LD ، والتي ظهرت على شكل قطرات كروية تقريبا. علاوة على ذلك ، مع الفلوروفور BODIPY 493/503 ، تمكنا من التمييز بين الحويصلات الدقيقة (1 ميكرومتر < د ≤ 3 ميكرومتر) ، والحويصلات الوسيطة (3 ميكرومتر < د ≤ 9 ميكرومتر) ، والحويصلات الكبيرة (د > 9 ميكرومتر) ، مما يسمح بالتمييز الناجح للتنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير . بشكل عام ، يعد هذا البروتوكول القائم على مضان BODIPY 493/503 أداة موثوقة وبسيطة لتوصيف LD الكبدي وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قطرات الدهون (LDs) ، التي ينظر إليها تقليديا على أنها مستودعات للطاقة ، هي عضيات خلوية متخصصة تتوسط في تخزين الدهون ، وهي تتألف من نواة دهنية محايدة كارهة للماء ، والتي تحتوي بشكل أساسي على استرات الكوليسترول والدهون الثلاثية (TGs) ، مغلفة بطبقة أحادية فوسفوليبيد1،2،3.

يحدث التكوين الحيوي LD في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، بدءا من تخليق ثلاثي الجلسرين (TAG) واسترات الستيرول. تنتشر الدهون المحايدة بين وريقات الطبقة المزدوجة ER بتركيزات منخفضة ولكنها تتجمع في عدسات زيتية تنمو وتنبت في قطرات كروية تقريبا من غشاء ER عندما يزيد تركيزها داخل الخلايا4. بعد ذلك ، تنتقل البروتينات من طبقة ER المزدوجة والعصارة الخلوية ، وخاصة عائلة بروتين perilipin (PLIN) ، إلى أسطح LDs لتسهيل التبرعم5،6،7،8،9.

من خلال تخليق الأحماض الدهنية الجديدة واندماج LD أو الاندماج ، تنمو LDs إلى أحجام مختلفة. وفقا لذلك ، يختلف حجم وعدد LDs اختلافا كبيرا عبر أنواع الخلايا المختلفة. يمكن تشكيل قطرات صغيرة (قطرها 300-800 نانومتر) ، والتي تعرف باسم LDs الأولية (iLDs) ، بواسطة جميع الخلايا4 تقريبا. في وقت لاحق من تكوين LD ، تكون معظم الخلايا قادرة على تحويل بعض iLDs إلى LDs أكبر حجما (قطرها > 1 ميكرومتر). ومع ذلك ، فإن أنواعا معينة فقط من الخلايا ، مثل الخلايا الشحمية وخلايا الكبد ، لديها القدرة على تكوين LDs عملاقة أو كبيرة الحجم (يصل قطرها إلى عشرات الميكرونات)4,10.

تلعب LDs دورا مهما جدا في تنظيم استقلاب الدهون الخلوية ، وقمع السمية الدهنية ، ومنع إجهاد ER ، واختلال وظائف الميتوكوندريا ، وفي النهاية موت الخلايا الناجم عن الأحماض الدهنية الحرة (FAs) 11،12،13،14. علاوة على ذلك ، تورطت LDs أيضا في تنظيم التعبير الجيني ، وعزل بروتين التكاثر الفيروسي ، والاتجار بالأغشية والإشارة15،16،17. لذلك ، فإن سوء تنظيم التكوين الحيوي LD هو السمة المميزة للأمراض المزمنة المرتبطة بمتلازمة التمثيل الغذائي ، والسمنة ، وداء السكري من النوع 2 (T2DM) ، و / أو تصلب الشرايين ، على سبيل المثال لا الحصر18،19،20.

الكبد ، كمركز استقلابي ، مسؤول في الغالب عن استقلاب الدهون عن طريق تخزين ومعالجة الدهون ، وبالتالي ، فهو مهدد باستمرار بالسمية الدهنية21. التنكس الدهني الكبدي (HS) هو سمة شائعة لسلسلة من أمراض الكبد التقدمية ويتميز بتراكم الدهون المفرط داخل الخلايا في شكل LDs الخلوية التي قد تؤدي في النهاية إلى خلل وظيفي في التمثيل الغذائي في الكبد ، والتهاب ، وأشكال متقدمة من مرض الكبد الدهني غير الكحولي22،23،24،25. يحدث HS عندما يكون معدل أكسدة الأحماض الدهنية وتصديرها كدهون ثلاثية داخل البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (VLDLs) أقل من معدل امتصاص الأحماض الدهنية الكبدية من البلازما وتخليق الأحماض الدهنية الجديدة 26. غالبا ما يحدث التراكم الكبدي للدهون في شكلين - التنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير - وهذه تظهر خصائص معمارية خلوية مميزة27. عادة ، يتميز التنكس الدهني الحويصلي الدقيق بوجود LDs صغيرة منتشرة في جميع أنحاء خلية الكبد مع وضع النواة مركزيا ، في حين يتميز التنكس الدهني الحويصلي الكبير بوجود LD كبير واحد يحتل الجزء الأكبر من خلية الكبد ، مما يدفع النواة إلى المحيط28,29. والجدير بالذكر أن هذين النوعين من التنكس الدهني غالبا ما يتم العثور عليهما معا ، ولا يزال من غير الواضح كيف يؤثر هذان النمطان من LD على التسبب في المرض ، حيث لا تزال الأدلة غير متسقة31،32،33،34. ومع ذلك ، غالبا ما يستخدم هذا النوع من التحليل ك "معيار مرجعي" في الدراسات قبل السريرية والسريرية لفهم السلوك الديناميكي ل LDs وتوصيف التنكس الدهني الكبدي29،34،35،36.

يتم تقييم خزعات الكبد ، المعيار الذهبي لتشخيص وتصنيف HS ، بشكل روتيني عن طريق تحليل الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) النسيجي ، حيث يتم تقييم قطرات الدهون على أنها فجوات غير ملوثة في أقسام الكبد الملطخة H&E37. في حين أنه مقبول لتقييم التنكس الدهني الحويصلي الكبير ، فإن هذا النوع من التلوين يضيق عموما تقييم التنكس الدهني الحويصليالدقيق 38. يتم دمج أصباغ ديازو القابلة للذوبان في الدهون ، مثل Oil Red O (ORO) ، بشكل كلاسيكي مع الفحص المجهري برايتفيلد لتحليل مخازن الدهون داخل الخلايا ، ولكن لا يزال لها عدد من العيوب: (i) استخدام الإيثانول أو الأيزوبروبانول في عملية التلوين ، والتي غالبا ما تسبب تعطيل LDs الأصلية والانصهار العرضي على الرغم من إصلاح الخلايا39; (ii) الطبيعة المستهلكة للوقت ، حيث يتطلب محلول ORO إذابة مسحوق طازج وترشيحه بسبب مدة الصلاحية المحدودة ، مما يساهم في نتائج أقل اتساقا ؛ (iii) وحقيقة أن ORO يلطخ أكثر من مجرد قطرات دهنية وغالبا ما يبالغ في تقدير التنكس الدهني الكبدي38.

وبالتالي ، تم استخدام الفلوروفورات المحبة للدهون المنفذة للخلايا ، مثل النيل الأحمر ، إما في عينات حية أو ثابتة للتغلب على بعض القيود المذكورة أعلاه. ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير المحددة لوضع العلامات على عضيات الدهون الخلوية تضيق مرارا وتكرارا تقييمات LD40. علاوة على ذلك ، تختلف الخصائص الطيفية لأحمر النيل وفقا لقطبية البيئة ، والتي يمكن أن تؤدي في كثير من الأحيان إلى تحولات طيفية41.

مسبار الفلورسنت المحب للدهون 1،3،5،7،8-خماسي ميثيل-4-بورا-3a، 4adiaza-s-indacene (الطول الموجي للإثارة: 480 نانومتر ؛ الحد الأقصى للانبعاث: 515 نانومتر ؛ BODIPY 493/503) خصائص الكارهة للماء التي تسمح بامتصاصه السريع بواسطة LDs داخل الخلايا ، ويتراكم في قلب قطرات الدهون ، وبالتالي ينبعث منه مضان أخضر فاتح12. على عكس النيل الأحمر ، فإن BODIPY 493/503 غير حساس لقطبية البيئة وقد ثبت أنه أكثر انتقائية ، لأنه يعرض سطوعا عاليا لتصوير LD. من أجل تلطيخ LDs المحايدة ، يمكن استخدام هذه الصبغة في الخلايا الحية أو الثابتة وتقترن بنجاح بطرق تلطيخ و / أو وضع العلامات الأخرى42. ميزة أخرى للصبغة هي أنها تتطلب القليل من الجهد لوضعها في محلول ومستقرة ، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى إعدادها حديثا لكل تجربة42. على الرغم من أن مسبار BODIPY 493/503 قد تم استخدامه بنجاح لتصور توطين وديناميكيات LDs في مزارع الخلايا ، فقد أظهرت بعض التقارير أيضا الاستخدام الموثوق لهذه الصبغة كأداة تصوير LD في الأنسجة بما في ذلك عضلة الأوعية الدموية البشرية43 ، وعضلة الفئران الوحيدة 42 ، وأمعاء الفأر44.

هنا ، نقترح بروتوكولا محسنا قائما على BODIPY 493/503 كنهج تحليلي بديل لتقييم رقم LD ومساحته وقطره في عينات الكبد من نموذج حيواني للتنكس الدهني الكبدي. يغطي هذا الإجراء تحضير عينة الكبد ، وتقسيم الأنسجة ، وظروف التلوين ، والحصول على الصور ، وتحليل البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت في هذه الدراسة من قبل هيئة رعاية الحيوان التابعة لمعهد كويمبرا للبحوث السريرية والطبية الحيوية (iCBR) (ORBEA ، # 9/2018) وامتثلت للتوجيهات الوطنية والأوروبية لرعاية الحيوان ومع إرشادات ARRIVE.

1. التصميم التجريبي

  1. ذكور فئران Wistar البالغة من العمر 13 أسبوعا في أقفاص جيدة التهوية في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة لدرجة الحرارة (22 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية) والرطوبة (50٪ -60٪) والضوء (12 ساعة دورة الضوء والظلام ) ومع الوصول إلى مياه الصنبور وتشاو القوارض القياسية.
  2. بعد فترة 2 أسبوع من التأقلم ، تعيين الفئران بشكل تعسفي إلى مجموعتين.
  3. قم بتغذية المجموعة الضابطة (CTRL ، n = 6) ومجموعات النظام الغذائي عالية الدهون (HFD ، n = 6) مع تشاو قياسي ونظام غذائي عالي الدهون (45٪ كيلو كالوري / دهون) ، على التوالي ، لمدة 24 أسبوعا.
  4. مراقبة وزن الجسم (BW) أسبوعيا. سجل استهلاك الأطعمة والمشروبات يوميا لكل قفص.

2. تحضير عينة الكبد

  1. تشريح الكبد
    1. تحضير المضخة التمعجية: قم بتشغيل 70٪ من الإيثانول عبر الأنبوب ، وقم بتوصيل إبرة 27 جم بنهاية مخرج الأنبوب ، وقم بتجهيز الأنبوب بمحلول ملحي بارد (4 درجات مئوية) 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة ~ 7.4) (على سبيل المثال ، 200 دورة في الدقيقة على مضخة تمعجية مع أنبوب سيليكون 1.6 مم معرف ، مجموعة تنقيط صغيرة IV). اضبط وزن الجسم (على سبيل المثال ، بالنسبة للفأر 100-150 جم ، استخدم معدل تدفق يبلغ حوالي 10-12 مل / دقيقة).
    2. تخدير الجرذ عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام بروتوكول التخدير (التركيز النهائي للكيتامين = 75 ملغم / كغم ، والتركيز النهائي للميديتوميدين = 1 ملغم / كغم).
      ملاحظة: تأكد من تخدير الجرذ تماما باستخدام طريقة استجابة قرصة إصبع القدم.
    3. ضع الجرذ على صينية التشريح.
    4. قم بتطهير الفراء جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول ، وجففه بمنشفة ورقية.
    5. باستخدام المقص ، قم بعمل شق على شكل حرف "U" عبر الجلد ، واقطعه أسفل الحجاب الحاجز. ثم ، قم بقص القفص الصدري بشكل دائري على الحواف لفضح القلب.
    6. أثناء تشغيل 1x PBS ، مرر الإبرة عبر البطين الأيسر إلى الشريان الأورطي الصاعد ، والمشبك. بعد ذلك ، يتم قطع الأذين الأيمن للسماح بالتصريف بمجرد بدء التروية.
      ملاحظة: يجب أن يبدأ الكبد في التبييض حيث يتم استبدال الدم ب PBS.
    7. باستخدام المقص وملقط Dumont ، قم بإزالة الكبد بعناية ، واشطفه باستخدام 1x PBS.
    8. نقل الكبد إلى طبق بتري ، ووزنه.
    9. باستخدام مشرط ، اجمع عينات الأنسجة الكبدية بسمك 5 مم من الجانب الجانبي (1 سم من الحافة) من الفص الأيسر للكبد لعملية التضمين.
      ملاحظة يمكن تخزين الأنسجة المتبقية في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  2. تضمين أنسجة الكبد
    1. قم بإعداد وعاء ثلج جاف ، وقم بتسمية قوالب التبريد بشكل صحيح بمعرف العينة والاتجاه.
    2. ضع بضع قطرات من مصفوفة التضمين بالتبريد على وسط cryomold لعمل درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
    3. تأكد من توجيه عينة الأنسجة بشكل صحيح لقسم عرضي.
      ملاحظة: تأكد من أن الجانب الذي يلامس الجزء السفلي من cryomold هو الجانب الذي سيتم تقسيمه أولا.
    4. قم بإسقاط المزيد من OCT بعناية على cryomold حتى يتم تغطيته بالكامل. حاول تجنب تكوين فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر ، باستخدام ملقط عادي ، قم بإزالة أي فقاعات داخل OCT.
    5. ضع cryomold بسرعة مع العينة المغطاة OCT في وعاء ثلج جاف.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة في -80 درجة مئوية لمدة 3 سنوات.

3. تقسيم الأنسجة المجمدة

  1. اضبط درجة حرارة cryostat (الغرفة: -21 درجة مئوية ؛ العينة: -18 درجة مئوية) ، وأدخل شفرة معقمة جديدة.
  2. ضع العينات في جهاز التبريد لمدة 30 دقيقة قبل السماح لتوازن درجة الحرارة.
  3. اصنع طبقة واحدة من OCT على قرص العينة للسماح بالتصاق العينة. اسمح ل OCT بالتجميد ، وقم بتركيب عينة الأنسجة في الاتجاه المطلوب.
    ملاحظة: يجب أن يكون سطح القطع موازيا للشفرة. للحفاظ على التصاق جيد ، ضع مستخرج الحرارة أعلى العينة. يمكن أيضا تنفيذ الخطوات السابقة في وعاء ثلج جاف به ثلج جاف.
  4. ضع العينة في رأس العينة ، وقم بقص سطح الأنسجة (بضعة أقسام عينة من الأنسجة 30 ميكرومتر).
  5. بمجرد الوصول إلى منطقة الاهتمام للتقسيم ، قم بقطع أقسام بسمك 12 ميكرومتر ، وضعها على شرائح مجهرية مصنفة محفوظة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: لجمع القسم، حرك الشريحة ببطء نحو قسم الأنسجة. يمكن لكل شريحة جمع قسمين من الكبد.
  6. اترك الشرائح تجف لمدة 10 دقائق في RT.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لمدة 6-12 شهرا أو عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 سنوات.

4. تلطيخ بوديبي

  1. قم بإذابة الشرائح في نظام تلطيخ الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة.
  2. يغسل مع 1x PBS (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما).
  3. ضع دائرة حول القسم بطبقة كارهة للماء باستخدام قلم حاجز.
  4. تحضير محلول مخزون BODIPY 493/503 500 ميكروغرام / مل: قم بإذابة 1 مجم من BODIPY 493/503in 2 مل من المذيب (90٪ DMSO ؛ 10٪ 1x PBS). يحفظ بعيدا عن الضوء. Sonicate في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 ساعة (9.5-10 W) عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 يوما على الأقل.
  5. قم بإعداد محلول تلطيخ BODIPY (1 ميكروغرام / مل) بإضافة 2 ميكرولتر من محلول مخزون BODIPY 493/503 و 0.1 ميكرولتر من محلول مخزون DAPI (5 مجم / مل) إلى 997.9 ميكرولتر من 1x PBS.
  6. احتضان الشرائح (75 ميكرولتر / شريحة) باستخدام BODIPY 493/503 (1 ميكروغرام / مل) و DAPI (0.1 ميكروغرام / مل) في RT لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: احتفظ بالشرائح في الظلام من هذه الخطوة فصاعدا.
  7. اغسل الشرائح باستخدام 1x PBS (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما).
  8. قم بتركيب الشرائح باستخدام أغطية باستخدام وسيط تثبيت مضان ، واتركها تجف لمدة 30 دقيقة ، وأغلقها بطلاء الأظافر.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.

5. تحديد كمية الدهون

  1. قم بقياس مستويات الكوليسترول الكلي في الدم و TG باستخدام طريقة ومعدات تلقائية تم التحقق من صحتها.
  2. قم بقياس مستويات TG الكبدية باستخدام مجموعة الفحص اللوني للدهون الثلاثية (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

6. الحصول على الصور

  1. ضع الشريحة على حامل شرائح المجهر متحد البؤر للمسح بالليزر.
  2. لتصور الصورة والحصول عليها ، استخدم مجهرا متحد البؤر بعدسة موضوعية 20x (plan-apochromat: 20x / 0.8).
  3. لتجنب الحديث المتبادل بين BODIPY 493/503 و DAPI ، استخدم وضع المسح المتسلسل (أفضل إشارة) على البرنامج البؤري.
  4. قم بإثارة BODIPY 593/503 باستخدام خط ليزر الأرجون 488 نانومتر و DAPI باستخدام خط الليزر 405 نانومتر. اضبط نطاقات الانبعاثات عند 493-589 نانومتر ل BODIPY 493/503 وعند 410-464 نانومتر ل DAPI.
  5. استخدم الإعدادات التالية: الثقب: 1 وحدة فلكية، الدقة: 1024 بكسل × 1024 بكسل، عمق البت: 12، حجم البكسل: 0.415 ميكرومتر، الوضع ثنائي الاتجاه، سرعة المسح الضوئي: 7 (~ 1.58 ميكرو ثانية/بكسل لهدف 20x)، متوسط الخط: 2x، والتكبير الرقمي: 1.
    ملاحظة: يجب تحسين معلمات المسح المذكورة أعلاه لكل مجهر متحد البؤر والهدف المستخدم.
  6. اضبط الكسب والكسب الرقمي بشكل مناسب بحيث لا يتم اكتشاف أي وحدات بكسل مشبعة على مؤشر النطاق.
    ملاحظة: قم بتصحيح إشارة الخلفية عن طريق ضبط الإزاحة.
  7. بمجرد تحديد LDs بشكل صحيح ، احصل على الصورة باستخدام قنوات BODIPY و DAPI.
    ملاحظة: يجب التقاط جميع الصور في نفس الظروف (التعرض والإعدادات العامة) لكل قناة لون.
  8. لإنشاء صور واسعة المساحة (الشكل 2) ، قم بتغيير الهدف إلى عدسة موضوعية a10x (مخطط نيوفلور: 10x / 0.3).
  9. حدد وضع مسح التجانب ، وقم بعمل فسيفساء من 5 لكل 5 صور.
    ملاحظة: في هذا العمل ، كان لكل بلاطة تداخل بنسبة 10٪ من أجل دمج المربعات بشكل مناسب للتحليل.
  10. لإنشاء طرق عرض ثلاثية الأبعاد ومتعامدة (الشكل 3 أ) ، ضع قطرة من زيت الغمر أعلى زجاج الغطاء ، وقم بتغيير الهدف إلى عدسة موضوعية 40x (مخطط نيوفلور: زيت 40x / 1.30).
  11. حدد وضع Z-Stack ، وبضبط مستوى Z ، حدد المواضع الأولى والأخيرة للاكتساب باستخدام شريحة بصرية بسمك مثالي (~ 0.5 ميكرومتر) لضمان التقاط جميع القطرات.
    ملاحظة: لتسريع الحصول على الصورة وتجنب التبييض ، يمكن ضبط الشريحة الضوئية على حجم دون المستوى الأمثل ، مما يضمن أخذ عينات زائدة بنسبة 30٪ على الأقل لإعادة بناء ثلاثية الأبعاد جيدة.
  12. حدد وحدة Ortho ، وقم بإنشاء طرق عرض متعامدة.
  13. احصل على صور ثلاثية الأبعاد عن طريق تحديد الوحدة ثلاثية الأبعاد بعد وضع تقديم الشفافية باستخدام برنامج المجهر متحد البؤر.

7. تحليل الصور

  1. معالجة وتحليل الصور أحادية المستوى (تكبير 20x) باستخدام CellProfiler (الإصدار 4.2.5).
    ملاحظة: تم تكييف خط الأنابيب المستخدم في هذا العمل من Adomshick et al.45.
  2. انقر فوق وحدة الصور في الزاوية العلوية اليسرى من نافذة CellProfiler ، وقم بتحميل الصور كملفات .tiff.
  3. استخدم الوحدة النمطية NamesAndTypes للفرز بين الصور الملطخة BODIPY- (قطرة) و DAPI- (النوى) بناء على أسماء الملفات. قم بإجراء تحليل LD فقط مع الصور الملطخة ب BODIPY.
  4. لبدء إنشاء خط الأنابيب ، انقر فوق ضبط الوحدات النمطية ، وحدد الوحدة النمطية ColorToGray لتحويل الصور إلى صور ذات تدرج رمادي.
    ملاحظة: لتحديد الكائنات، يلزم وجود صور بتدرج الرمادي.
  5. حدد القطرات باستخدام وحدة IdentifyPrimaryObjects باستخدام صورة التدرج الرمادي.
    ملاحظة: يجب ضبط المعلمات في هذه الوحدة لتحقيق تحديد جيد ل LD. في هذا العمل ، أدى تحديد LDs بحجم يتراوح بين 6 بكسل و 300 بكسل وعامل تصحيح عتبة 1.0 إلى تحديد الهوية الأكثر دقة.
  6. لقياس كثافة البكسل لقطرات الدهون المحددة ، أضف وحدة MeasureObjectIntensity .
  7. أضف وحدة FilterObjects إضافية لضمان تحديد الإشارات الأقوى فقط بينما يتم استبعاد الإشارات الأقل كثافة من تحليل قطرات الدهون النهائي (الحد الأدنى للشدة: 0.15 ؛ الحد الأقصى للشدة: 1 وحدة تعسفية).
  8. لقياس LDs المتعلقة ببيانات الإخراج ، أضف الوحدة النمطية MeasureObjectSizeShape .
  9. أضف وحدة OverlayOutlines في هذه المرحلة لتراكب المعالجة التجميعية المحددة على الصورة الأصلية ، وبالتالي ، تأكد من أن التجزئة تبدو دقيقة على الصورة غير المعالجة أيضا.
    ملاحظة: هذه خطوة اختيارية (مراقبة الجودة).
  10. أضف وحدة ExportToSpreadsheet في النهاية ، وانقر فوق الزر "تحليل الصور " في الزاوية اليسرى السفلية.

8. التحليل الإحصائي

  1. عبر عن النتائج كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (S.E.M.) باستخدام أي تطبيق برنامج تحليل إحصائي.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام برنامج GraphPad للتحليل الإحصائي.
  2. تحليل توزيع القيم باستخدام اختبار Kolmogorov-Smirnov لتقييم الانحرافات الكبيرة عن الحالة الطبيعية. تحليل البيانات البارامترية باستخدام اختبار t غير المزاوج للطالب.
    ملاحظة: اعتبرت قيم p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن يؤدي التنفيذ الناجح لهذه التقنية إلى تلطيخ واضح لقطرات الدهون للتوصيف المتزامن لمورفولوجيا LD (الشكل وكثافة لب الدهون بناء على إعادة البناء ثلاثية الأبعاد) جنبا إلى جنب مع توزيعها المكاني ، والعدد لكل مساحة إجمالية ، ومتوسط الحجم (تم تقييمه باستخدام خط الأنابيب الموصوف أعلاه ، الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا البروتوكول القائم على مضان BODIPY 493/503 لتقييم LD إلى تطوير نهج تصوير جديد لتقييم التنكس الدهني الكبدي. نظرا للعلاقة القوية بين السمنة وأمراض الكبد الدهنية ، تم استخدام النظام الغذائي عالي الدهون على النمط الغربي لإنشاء نموذج حيواني للتنكس الدهني الكبدي26. تم تأكيد زيادة قوية في محتويات TG الكبدية من خلال مجموعة الفحص اللوني للدهون الثلاثية الكمية ، والتي اقترحت سيناريو دهني كبدي مرتفع في الحيوانات التي تتغذى على HFD. بعد ذلك ، تم تصور درجة تراكم LD بواسطة مسبار الفلورسنت BODIPY 493/503...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل الصناديق الوطنية والأوروبية عبر مؤسسة العلوم والتكنولوجيا البرتغالية (FCT) ، والصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (FEDER) ، وبرنامج العوامل التشغيلية للمنافسة (COMPETE): 2020.09481.BD ، UIDP / 04539/2020 (CIBB) ، و POCI-01-0145-FEDER-007440. يود المؤلفون أن يشكروا دعم iLAB - مختبر الفحص المجهري والتصوير الحيوي ، وهو مرفق تابع لكلية الطب بجامعة كويمبرا وعضو في البنية التحتية الوطنية PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122) ، بالإضافة إلى الدعم من FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.6 مم أنابيب سيليكون معرفية ، مجموعة تنقيط صغيرة IVفيشر Scientific
4،4-ثنائي فلورو-1،3،5،7،8-pentametil-4-bora-3a ، 4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)Sigma-Aldrich ، ليون ، فرنساD3922
4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) MolecularProbes Inc ، Invitrogen ، Eugene ، ORD1306
70٪ إيثانولهانيويل10191455
أدوبي المصور CCأدوبي إنكتستخدم لتصميم الأشكال
المحلل الأوتوماتيكي هيتاشي 717Roche Diagnostics Inc. ، مانهايم ، ألمانيا8177-30-0010
قلم حاجز (قلم عنق الفائق مانع السائل)Daido Sangyo Co.، Ltd ، Japon_
BladeLeica221052145المستخدمة في ملف
تعريف خلية التبريد الإصدار 4.2.5https://cellprofiler.org/releases/تستخدم للتحليل الصور
CoverslipsMenzel-Glaser ، ألمانيا_
CryomoldsTissue-Tek_
Cryostat (بما في ذلك قرص العينة ومستخرج الحرارة) CM3050 SLeica Biosystems_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich ، ليون ، فرنساD-8418يستخدم لإذابة Bodipy لمحلول مخزون 5 مجم / مل. تنبيه: سامة
وقابلة للاشتعال. قد تسبب الأبخرة تهيج
. التلاعب في غطاء الدخان
. تجنب ملامسة الجلد مباشرة.
ارتد قفازات مطاطية ونظارات واقية للعين
.
حاوية الثلج الجاف (مبرد الستايروفوم)NovolabA26742
ملقط Dumontأدوات العلوم الدقيقة ، ألمانيا11295-10
طبق بتري زجاجي (H 25 مم ، & oslash;
150 مم)		Thermo Scientific150318يستخدم لوزن الكبد بعد تشريح
GlycergelDAKO OmnisS303023
برنامج GraphPad Prism ، الإصدار 9.3.1GraphPad Software، Inc. ، La Jolla ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية
النظام الغذائي عالي الدهونEnvigo ، برشلونة ، إسبانياMD.08811
الكيتامين (Nimatek & nbsp ؛ 100 مجم / مل)Dechra791/01/14DFVPTيستخدم بتركيز نهائي يبلغ 75 مجم / كجم
مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر   ؛ (وحدة الكشف عن الكوازار)كارل زايس ، ألمانياLSM 710 Axio Observer Z1 مجهر
Medetomidine (مهدئ 1 مجم / مل)Dechra1838 ESP / 020/01/07RFVPTيستخدم بتركيز نهائي يبلغ 1 مجم / كجم
إبرةBD microlance300635
رقم 15 مشرط فولاذي كربوني معقم
بليد		سوان مورتون205
الأهداف 10x (Plan-Neofluar 10x / 0.3) و 20x (Plan-Apochromat 20x / 0.8) و 40x (Plan-Neofluar 40x / 1.30 Oil)  Carl Zeiss, Germany
Paint brushesVan Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X  تستخدم للتعامل مع القطع
المضخة التمعجية (Minipuls 3)جيلسون1004170
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة ~ 7.4)مقبض مشرط Sigma-Aldrich ، ليون ، فرنساP3813
، 125 مم (5 بوصة) ، رقم 3Swann-Morton0208
نظام تلطيخ الشرائح StainTraySimport ScientificM920
النظام الغذائي القياسي  Mucedola4RF21
Superfrost Plus مجهر الشرائحMenzel-Glaser ، ألمانياJ1800AMNZ
Tissue-Tek OCT تصاعد وسائل الإعلامVWR CHEMICALS361603E
Triglycerides مجموعة الفحص اللونيكايمان الكيميائية10010303
حمام بالموجات فوق الصوتيةBandelin Sonorex TK 52
Vannas الربيع مقص - 3 مم
أحدث		أدوات العلوم الدقيقة ، ألمانيا15000-00
ZEN Black SoftwareZeiss
المكتسبةبالتبريد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
  2. Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
  3. Thiele, C., Penno, A. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. , Academic Press. Cambridge, MA. 273-278 (2016).
  4. Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
  5. Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
  6. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
  7. Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).
  8. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  9. Jackson, C. L. Lipid droplet biogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 59, 88-96 (2019).
  10. Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128(2017).
  11. Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. Yang, H., Li, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 107-127 (2013).
  12. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24, Unit 24.2 (2007).
  13. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
  14. Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
  15. Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
  16. Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
  17. Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224(2022).
  18. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
  21. Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
  22. Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
  23. Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
  24. Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
  25. Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
  26. Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
  27. Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
  28. Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. Muriel, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 23-44 (2017).
  29. Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
  30. Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
  31. Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
  32. Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
  33. Hübscher, S. G. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). Saxena, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 371-390 (2018).
  34. Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242(2018).
  35. Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
  36. de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
  37. Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P. What's new in hepatic steatosis. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 42 (4), 405-415 (2021).
  38. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092(2012).
  39. Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768(2018).
  40. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42(2015).
  41. Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
  42. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358(2011).
  43. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774(2013).
  44. Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808(2020).
  45. Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
  46. Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
  47. Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
  48. Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
  49. Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718(2022).
  50. Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
  51. Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BODIPY Cell Profiler

مقالات ذات صلة