مقالة منهجية

تحضير كامل قائم على الميثانول لفحص خلايا العقدة الشبكية

3.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65222

⸱

أبريل 7, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Renmin Hospital of Wuhan University

في هذه المقالة

ملخص

يمكن استخدام الميثانول كوسيط ثابت مساعد لمستحضرات الشبكية الكاملة والتخزين طويل الأجل ، وهو أمر مفيد لفحص خلايا العقدة الشبكية.

الملخص

تنشر خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، وهي الخلايا العصبية الإسقاطية للشبكية ، المعلومات البصرية الخارجية إلى الدماغ. التغيرات المرضية في RGCs لها علاقة وثيقة مع العديد من الأمراض التنكسية في شبكية العين. كثيرا ما يستخدم التلطيخ المناعي الكامل للشبكية في الدراسات التجريبية على RGCs لتقييم الظروف التنموية والمرضية للشبكية. في ظل بعض الظروف ، قد تحتاج بعض عينات شبكية العين القيمة ، مثل تلك المأخوذة من الفئران المعدلة وراثيا ، إلى الاحتفاظ بها لفترة طويلة دون التأثير على مورفولوجيا أو عدد RGCs. للحصول على نتائج تجريبية موثوقة وقابلة للتكرار ، يعد استخدام وسيط حفظ فعال أمرا ضروريا. هنا ، نصف تأثير الميثانول كوسيط ثابت مساعد لمستحضرات شبكية العين الكاملة والتخزين طويل الأجل. باختصار ، أثناء عملية العزل ، يتم سحب الميثانول البارد (-20 درجة مئوية) على سطح الشبكية للمساعدة في إصلاح الأنسجة وتسهيل نفاذيتها ، ومن ثم يمكن تخزين شبكية العين في الميثانول البارد (-20 درجة مئوية) قبل أن تكون مناعية. يصف هذا البروتوكول سير عمل عزل الشبكية وبروتوكول تخزين عينات الأنسجة ، وهو أمر مفيد وعملي للتحقيق في RGCs.

المقدمة

خلايا العقدة الشبكية (RGCs) هي الخلايا العصبية الإسقاطية الوحيدة في شبكية العين ، وهي تدمج وتنقل المعلومات المرئية الخارجية إلى الدماغ1. تتميز العديد من الأمراض التنكسية العصبية مثل الجلوكوما والاعتلال العصبي البصري الرضحي بأضرار لا رجعة فيها وفقدان RGCs 2,3. يعد تحليل التغيرات المورفولوجية والكمية ل RGCs خطوة حاسمة في تحديد كيفية تطور الأمراض التنكسية العصبية وتقدمها 4,5.

مقايسة التألق المناعي غير المباشر هي طريقة مقبولة على نطاق واسع لمراقبة توزيع البروتينات وعدد الخلايا. في المختبر ، يشيع استخدام التلطيخ المناعي الكامل للشبكية في الدراسات التجريبية على RGCs لتقييم الظروف الفسيولوجية والمرضية لشبكية العين6. تشمل العلامات الأكثر شيوعا المستخدمة في القياس الكمي ل RGC في شبكية العين بأكملها Brn3a ، بروتين ربط الحمض النووي الريبي مع الربط المتعدد (RBPMS) ، وما إلى ذلك 7,8. يتطلب توصيف كمية وتوزيع RGCs تلطيخا مناعيا عالي الجودة للشبكية بالكامل. بشكل عام ، في بروتوكولات التلوين المناعي ، يتم غمر شبكية العين في المثبتات الكيميائية قبل تحضينها في الأجسام المضادة. يجب ألا تغير المثبتات المثالية شكل الخلايا ، أو إمكانية الوصول أو تقارب الحواتم للأجسام المضادة ، أو الأبعاد الخطية للأنسجة 9,10.

نظرا للبنية المعقدة للشبكية ، فإن مشاكل مثل هشاشة الشبكية وطيها ، بالإضافة إلى بعض الصعوبات الشائعة بما في ذلك انكماش الخلايا والنوى غير الواضحة ، عرضة للحدوث عند صنع رقعة شبكية كاملة ، والتي لها تأثير سلبي على البحث التجريبي. بالإضافة إلى ذلك ، ليست كل شبكية العين ملطخة بالمناعة على الفور ، خاصة عندما يتعلق الأمر بشبكية الفئران المعدلة وراثيا بأسعار باهظة الثمن ذات أصل ثمين ، مما يستلزم الحفاظ على عينات الشبكية الإضافية لاستخدامها مرة أخرى.

يمكن للحل المثبت المناسب إصلاح الأنسجة بسرعة ، وتجنب التحلل الذاتي للأنسجة ، والحفاظ على التشكل الطبيعي وهيكل خلايا الأنسجة ، والحفاظ على مستضدية البروتينات والمواد الأخرى10. في الوقت الحاضر ، تم استخدام التثبيت القائم على الفورمالديهايد على نطاق واسع في الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك شبكية العين المنفصلة ، وأكواب العين الدموية ، ومقل العيون الكاملة10. انكماش الأنسجة والتغيير المورفولوجي للخلايا هما التحديان الحاسمان اللذان تمت مواجهتهما بعد الغمر في الفورمالديهايد11. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر تركيبات التثبيت المعدلة بشكل متزايد لزيادة الاحتفاظ بالخصائص الأصلية لشبكية العين والخلايا المستهدفة 9,10. قد تؤثر علاجات تثبيت الشبكية المختلفة على بنية الشبكية ، ومناعة البروتين ، والإثارة الفلورية ، ودورة تبريد التوهين بشكل مختلف12,13. شبكية العين المثبتة بمحلول ديفيدسون أكثر سلامة من الناحية الشكلية مقارنة بتلك المثبتة بالفورمالين ، لكن محلول ديفيدسون أقل توافقا مع بعض الأجسام المضادة ، مثل جزيء محول ربط الكالسيوم المتأين بعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة 112. بالنظر إلى الطبيعة الهشة لشبكية العين ، سيتساءل الباحثون بطبيعة الحال عما إذا كانت سلامة الشبكية ، وكذلك خصائص وشكل الخلايا المستهدفة ، ستتغير بعد التخزين على المدى الطويل. ومع ذلك ، نادرا ما تم الإبلاغ عن الآثار المحتملة لمحلول التثبيت على مورفولوجيا خلايا الشبكية و RGC بعد التخزين لعدة أشهر. يعد تحسين تثبيت الشبكية أمرا بالغ الأهمية لتقييم وحفظ RGCs.

نحن نقدم وصفا مفصلا لطريقة موثوقة ومباشرة من الناحية الفنية نستخدمها لتلطيخ شبكية الفئران بالكامل. تؤكد طريقتنا على التحضير والتخزين المناسبين لشبكية العين لفحص RGC ، مع الأخذ في الاعتبار الحاجة إلى التخزين طويل الأجل لأنسجة الشبكية بالإضافة إلى جوانب محددة من تكوين الفلوروفور أو تدهوره.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. تم الحصول على جميع الفئران C57BL / 6J المستخدمة من مركز المختبر بجامعة ووهان ، وتمت الموافقة على جميع التجارب ذات الصلة من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات بجامعة ووهان. بذلت كل الجهود لتقليل معاناة الفئران.

1. استئصال وتثبيت العينين

  1. القتل الرحيم للفئران بالاختناق بثاني أكسيد الكربون ، واستئصال مقلة العين بلطف باستخدام ملاقط بلا أسنان.
  2. شطف مقلة العين مرة واحدة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  3. ثقب مقلة العين بإبرة حقنة في القرنية تحت المجهر (العدسة WF: 10x / 22 ؛ هدف التكبير المستمر: 0.67x-4.5x) لتسريع التثبيت في مقلة العين وتحسين كفاءة التثبيت.
  4. نقل إلى لوحة 24 بئر تحتوي على 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA).
  5. ثبت مقلة العين في 4٪ PFA لمدة 45 دقيقة ، ثم انقلها إلى 1x PBS لإزالة PFA الزائد (اغسل ثلاث مرات ، 5 دقائق / وقت) على الفور.

2. عزل الشبكية وتسطيحها

  1. انقل مقلة العين إلى شريحة زجاجية ، وضعها تحت مجهر تشريح (العدسة WF: 10x / 22 ؛ هدف التكبير المستمر: 0.67x-4.5x).
  2. امسك الملقط بيد واحدة ، واستخدمه لتثبيت هامش القرنية لمنع حركة مقلة العين. استخدم اليد الأخرى لإمساك مقص التشريح وقطع القرنية على عمق 1 مم تقريبا من خلال ليمبوس القرنية الصلبة. قم بإزالة العدسة والجسم الزجاجي.
  3. امسك القرص البصري في المركز ، وباستخدام مقص التشريح ، قم بقطع الشبكية شعاعيا على طول الأرباع الأربعة ، لتصل إلى حوالي 2/3 من نصف قطر الشبكية.
  4. المشبك واحدة من حواف الصلبة باستخدام ملقط مسنن. من ناحية أخرى ، أمسك حافة الصلبة بالملقط غير المسنن ، وانتقل من حيث يتم تثبيت الصلبة بواسطة الملقط المسنن نحو قاعدة الصلبة. قشر بعناية شبكية العين.
  5. اسحب برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة (200 ميكرولتر) لغسل شبكية العين وتبليلها ، ثم قم بإزالة أي PBS زائد بقطعة صغيرة من الورق الماص. إذا لزم الأمر ، قم بتسطيح شبكية العين برفق باستخدام فرشاة شعيرات صغيرة.
  6. يسقط الميثانول البارد الماص ببطء (المبرد مسبقا في الفريزر -20 درجة مئوية) قطرة قطرة على السطح الداخلي للشبكية (حجم الميثانول غير ثابت ، طالما يمكن تغطية الشبكية بالكامل بواسطة الميثانول). تتحول شبكية العين إلى اللون الأبيض وتطور مثابرة متزايدة.
  7. قم بتسطيح شبكية العين برفق ، وإزالة الشوائب مثل الأغشية الصبغية المتبقية والجسم الزجاجي باستخدام فرش ذات شعيرات صغيرة. اقلب شبكية العين باستخدام فرش ذات شعيرات صغيرة ، وكرر العملية المذكورة أعلاه.
  8. انقل شبكية العين المعالجة بالميثانول إلى بئر من صفيحة 24 بئرا ، واحتفظ بها غارقة في الميثانول.
  9. قم بتخزينه في -20 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة للتلطيخ المناعي الفوري ، أو اترك شبكية العين في الميثانول ، وقم بتخزينه في -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
  10. قم بإزالة الميثانول من لوحة 24 بئرا ، وشطف شبكية العين باستخدام 1x PBS.

3. تلطيخ مناعي من RGCs

  1. انقل شبكية العين بعناية إلى صفيحة تراص دموي مكونة من 24 بئرا باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، وقم بحظرها بنسبة 5٪ PBS-TX-BSA (5 جم من مسحوق ألبومين مصل الدم البقري المذاب في 100 مل من محلول 1x PBST ؛ يتم تشكيل PBST بإضافة 10 مل من Triton X-100 إلى 2000 مل من 1 × PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. حافظ على جانب العقدة لأعلى.
  2. قم بإزالة PBS-TX-BSA ، واحتضان شبكية العين عند 4 درجات مئوية لمدة 48-96 ساعة ، مع إضافة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المختار (الجسم المضاد ل RBPMS لخنزير غينيا) باستخدام تخفيف 1: 400.
  3. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي ، واشطف الشبكية ثلاث مرات (20 دقيقة لكل منهما) باستخدام 1x PBS ، مع الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة.
  4. احتضان شبكية العين مع الهز اللطيف طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المقابل (انظر جدول المواد) ، السيانين Cy3 affiniPure donkey anti-Guinea pig IgG (H + L) ، باستخدام تخفيف 1: 400.
  5. شطف شبكية العين مع 1x PBS ثلاث مرات (20 دقيقة لكل منهما).
  6. ضع شبكية العين بشكل مسطح على الشريحة بحيث تكون طبقة الخلايا العقدية متجهة لأعلى ، وقم بإسقاط كمية مناسبة من عامل التبريد المضاد للتألق حول الشبكية باستخدام ماصة ، وقم بتغطية الشريحة بغطاء (احرص على عدم وجود فقاعات).
    ملاحظة: لتحديد الكمية المناسبة من المروي المضاد للتألق ، تأكد من أنه يغطي شبكية العين بأكملها. بعد ذلك ، قم بتغطية الشريحة دون السماح لشبكية العين بالطفو والتحرك بسهولة.
  7. أغلق الشريحة في كل مكان بعامل مانع للتسرب لمنعها من الحركة. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -20 درجة مئوية وحمايتها من الضوء.
  8. تخيل شبكية العين باستخدام مجهر مضان / متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد التشريح ، يجب أن تبدو شبكية العين مثل البرسيم المسطح المكون من أربع أوراق. في هذه الدراسة ، باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه ، تحولت شبكية العين إلى اللون الأبيض بعد إضافة الميثانول (الشكل 1). وفي الوقت نفسه ، تغيرت شبكية العين من لينة إلى مرنة ومسطحة. بعد ذلك ، تم تصنيف RGCs بمكافحة RBPMS8. تم التقاط أربعة حقول صور في شبكية العين الكاملة (ن = 3) باستخدام مجهر متحد البؤر (العدسة: 10x ؛ الهدف: 40x). يتم توضيح وجهات النظر التمثيلية ل RGCs المرئية لشبكية العين قبل مع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التثبيت هو خطوة أساسية للحفاظ على شبكية العين ، والتي يمكن أن تؤثر على أي تحقيقات RGC لاحقة بناء على التشكل. يلتقط التثبيت الناجح بسرعة بنية وحالة شبكية العين في لحظة تعريضها لوسط التثبيت ، وهو أمر بالغ الأهمية لمزيد من التحليل. على الرغم من أن الفورمالديهايد يعتبر أحد أكثر عوامل التثبيت شيوعا لتثبيت الأنسجة والخلايا وحفظها ، إلا أن الفورمالديهايد وحده لا يعمل دائما بشكل جيد كمثبت كيميائي مثالي لبعض التحقيقات10,14. أنواع مختلفة من المثبتات لها قدرات متفاوتة لترسي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يعلم المؤلفون بأي انتماءات أو عضويات أو تمويل أو حيازات مالية قد تؤثر على موضوعية هذه الدراسة.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل مشروع افتتاح مختبرات هوبي الرئيسية (المنحة رقم 2021KFY055) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هوبي (منحة رقم 2020CFB240) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (منحة رقم 2042020KF0065).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
24 بئر مجموعة ثقافة الخلاياCostarEyeball تثبيت
24 بئر لوحة التخثرالدموي Labedit Companyحضانة الأجسام المضادة
شرائح مجهر التصاقCitotestأو ما شابه
ذلك من التبريد المضاد للفلورسنتServicebioG1401إبطاء تبريد التألق
BSA (زلال مصل الأبقار)ServicebioGC305010كاشف حجب
مجهر متحد البؤرأوليمبوستطبيق عدسة موضوعية 40x
مقص منحنيJiangsu Kanghua Medical Equipment Co.، Ltd.أدوات تشريح
المجهرRWD علوم الحياة المحدودة & nbsp ؛77001Sأدوات تشريح
الملقطجيانغسو Kanghua المعدات الطبية المحدودةأدوات تشريح
الميثانولSinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة20210624GC>; 99.5٪
طلاء الأظافرSecheViteعامل الختم
الإبر شنغهاي تفضل بمجموعة تنمية الشركات المحدودةتسريع التثبيت
محلول بارافورمالدهايدServicebioG1101تثبيت مقلة
العين PBS (الفوسفات المحلول الملحي المخزن درجة الحموضة 7.4)ServicebioG0002شطف مقلة العين  
الجسم المضاد الأساسي: بروتين خنزير غينيا المضاد للربط بالحمض النووي الريبي مع التضفير المتعدد (RBPMS)PhosphoSolutionsCat. # 1832-RBPMSللتألق المناعي. يستخدم في 1: 400
الجسم المضاد الثانوي: Cy3 affiniPure donkey المضاد لخنزير غينيا IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch706-165-148للتألق المناعي. تستخدم في 1: 400
مقص مستقيمJiangsu Kanghua Medical Equipment Co.، Ltd.أدوات التشريح

المراجع

  1. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  2. Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
  3. Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).
  4. Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
  5. Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
  6. Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).
  7. Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  8. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  9. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  10. Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
  11. Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
  12. Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
  13. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  14. Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
  15. Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59(2012).
  16. Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).
  17. Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
  18. Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
  19. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
  20. Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
  21. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  22. Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة