سقالات مشتقة من التفاح منزوعة الخلايا لهندسة أنسجة العظام في المختبر وفي الجسم الحي

Maxime Leblanc Latour; Maryam Tarar; Ryan J. Hickey; Charles M. Cuerrier; Isabelle Catelas; Andrew E. Pelling

doi:10.3791/65226

Method Article

سقالات مشتقة من التفاح منزوعة الخلايا لهندسة أنسجة العظام في المختبر وفي الجسم الحي

DOI:

10.3791/65226

⸱

February 23rd, 2024

Maxime Leblanc Latour¹ , Maryam Tarar² , Ryan J. Hickey¹ , Charles M. Cuerrier¹ , Isabelle Catelas³^,⁴^,⁵ , Andrew E. Pelling¹^,²^,⁶^,⁷

¹Department of Physics, University of Ottawa, ²Department of Biology, University of Ottawa, ³Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa, ⁴Department of Surgery, University of Ottawa, ⁵Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, ⁶Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa, ⁷SymbioticA, School of Human Sciences, University of Western Australia

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، نقوم بتفصيل طرق إزالة الخلايا ، والتوصيف الفيزيائي ، والتصوير ، وزرع المواد الحيوية النباتية في الجسم الحي ، بالإضافة إلى طرق بذر الخلايا والتمايز في السقالات. تسمح الطرق الموصوفة بتقييم المواد الحيوية النباتية لتطبيقات هندسة أنسجة العظام.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام المواد الحيوية السليلوز المشتقة من النباتات في تطبيقات هندسة الأنسجة المختلفة. أظهرت الدراسات في الجسم الحي التوافق الحيوي الرائع للسقالات المصنوعة من السليلوز المشتق من المصادر الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك هذه السقالات خصائص هيكلية ذات صلة بأنسجة متعددة ، وتعزز غزو وتكاثر خلايا الثدييات. أظهرت الأبحاث الحديثة التي تستخدم أنسجة Hypanthium التفاح منزوعة الخلايا تشابه حجم المسام مع حجم العظم التربيقي بالإضافة إلى قدرته على دعم التمايز العظمي بشكل فعال. فحصت الدراسة الحالية كذلك إمكانات سقالات السليلوز المشتقة من التفاح لتطبيقات هندسة أنسجة العظام (BTE) وقيمت خصائصها الميكانيكية في المختبر وفي الجسم الحي . تم زرع بانيات MC3T3-E1 preosteoblasts في سقالات السليلوز المشتقة من التفاح والتي تم تقييمها بعد ذلك لإمكاناتها العظمية وخصائصها الميكانيكية. أكد تلطيخ الفوسفاتيز القلوي و S الأحمر الأليزارين التمايز العظمي في السقالات المستزرعة في وسط التمايز. أظهر الفحص النسيجي غزو الخلايا والتمعدن على نطاق واسع عبر السقالات. كشف المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) عن مجاميع معدنية على سطح السقالات ، وأكد التحليل الطيفي المشتت للطاقة (EDS) وجود عناصر الفوسفات والكالسيوم. ومع ذلك ، على الرغم من الزيادة الكبيرة في معامل يونغ بعد تمايز الخلايا ، إلا أنه ظل أقل من الأنسجة العظمية السليمة. أظهرت الدراسات في الجسم الحي تسلل الخلايا وترسب المصفوفة خارج الخلية داخل السقالات المشتقة من التفاح بعد 8 أسابيع من الزرع في كالفاريا الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، كانت القوة المطلوبة لإزالة السقالات من عيب العظام مماثلة لحمل الكسر المبلغ عنه سابقا لعظم الجلفاري الأصلي. بشكل عام ، تؤكد هذه الدراسة أن السليلوز المشتق من التفاح هو مرشح واعد لتطبيقات BTE. ومع ذلك ، فإن الاختلاف بين خواصه الميكانيكية وخصائص الأنسجة العظمية السليمة قد يحد من تطبيقه على سيناريوهات منخفضة الحمل. قد يكون من الضروري إعادة هندسة هيكلية إضافية وتحسينها لتعزيز الخواص الميكانيكية لسقالات السليلوز المشتقة من التفاح للتطبيقات الحاملة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما تتطلب عيوب العظام الكبيرة الناتجة عن إصابة أو مرض ترقيع المواد الحيوية للتجديد الكامل¹. تستخدم التقنيات الحالية المصممة لتحسين تجديد أنسجة العظام بانتظام الطعوم الذاتية أو الخيفية أو الغريبة أو الاصطناعية². بالنسبة لتطعيم العظام الذاتي ، الذي يعتبر ممارسة التطعيم "المعيار الذهبي" لإصلاح عيوب العظام الكبيرة ، يتم استخراج العظام من المريض. ومع ذلك ، فإن إجراء التطعيم هذا له العديد من العيوب ، بما في ذلك قيود الحجم والشكل ، وتوافر الأنسجة ، ومراضة موقع أخذ العينات³. علاوة على ذلك ، فإن إجراءات التطعيم الذاتي عرضة لالتهابات موقع الجراحة ، والكسور اللاحقة ، وتشكيل ورم دموي في موقع أخذ العينات أو إعادة بنائه ، وآلام ما بعد الجراحة⁴. تقدم هندسة أنسجة العظام (BTE) بديلا محتملا لطرق تطعيم العظام التقليدية⁵. فهو يجمع بين المواد الحيوية الهيكلية والخلايا لبناء أنسجة عظمية وظيفية جديدة. عند تصميم المواد الحيوية ل BTE ، من الأهمية بمكان الجمع بين بنية كبيرة يسهل اختراقها ، وكيمياء السطح التي تعزز ارتباط الخلية ، والخصائص الميكانيكية التي تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في العظام الأصلية⁶. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن حجم المسام المثالي ومعامل المرونة للمواد الحيوية المستخدمة في BTE هما حوالي 100-200 ميكرومتر⁷ و 0.1-20 جيجا باسكال ، على التوالي ، اعتمادا على موقع التطعيم⁸. إلى جانب ذلك ، فإن المسامية والترابط المسامي للسقالات هي عوامل حاسمة تؤثر على هجرة الخلايا ، وانتشار المغذيات ، وتكوين الأوعية⁸.

أظهر بنك تونس و التعليم نتائج واعدة مع العديد من المواد الحيوية التي تم تطويرها وتقييمها كخيارات بديلة لترقيع العظام. بعض هذه المواد الحيوية هي مواد حثية عظمية ومواد هجينة وهلاميات مائية متقدمة⁸. تحفز المواد الاستقرائية العظمية تطوير الهياكل العظمية المشكلة حديثا. تتكون المواد الهجينة من بوليمرات اصطناعية و / أو طبيعية⁸. تحاكي الهلاميات المائية المتقدمة المصفوفة خارج الخلية (ECM) وهي قادرة على تقديم العوامل النشطة بيولوجيا اللازمة لتعزيز تكامل أنسجة العظام⁸. هيدروكسيباتيت هو مادة تقليدية وخيار شائع ل BTE بسبب تكوينه وتوافقه الحيوي⁹. الزجاج النشط بيولوجيا هو نوع آخر من المواد الحيوية ل BTE ، والذي ثبت أنه يحفز استجابات خلايا معينة لتنشيط الجينات اللازمة لتكوين العظم^10,11. كما تم استخدام البوليمرات القابلة للتحلل ، بما في ذلك بولي (حمض الجليكوليك) وبولي (حمض اللاكتيك) ، على نطاق واسع في تطبيقات BTE¹². أخيرا ، أظهرت البوليمرات الطبيعية أو المشتقة بشكل طبيعي مثل الشيتوزان والكيتين والسليلوز البكتيري نتائج مشجعة ل BTE¹³. ومع ذلك ، في حين أن كل من البوليمرات الاصطناعية والطبيعية تظهر إمكانات ل BTE ، فإن تطوير سقالة وظيفية مع البنية الكلية المطلوبة يتطلب عادة بروتوكولات واسعة النطاق.

على العكس من ذلك ، يمكن اشتقاق هياكل السليلوز العيانية الأصلية بسهولة من النباتات المتنوعة ، وقد أثبتت مجموعتنا البحثية سابقا قابلية تطبيق السقالات القائمة على السليلوز المشتقة من النباتات على عمليات إعادة بناء الأنسجة المختلفة. في الواقع ، بعد معالجة بسيطة للفاعل بالسطح ، قمنا بتسخير البنية المتأصلة للمادة النباتية ، وتسليط الضوء على إمكاناتها كمادة حيوية متعددة الاستخدامات¹⁴. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه السقالات القائمة على السليلوز لتطبيقات زراعة خلايا الثدييات في المختبر ¹⁴ ، وهي متوافقة حيويا ، وتدعم الأوعية الدموية العفوية تحت الجلد¹⁴^،¹⁵^،¹⁶^،¹⁷. أثبتت كل من مجموعتنا البحثية وغيرها أنه يمكن الحصول على هذه السقالات من نباتات محددة بناء على التطبيق المقصود¹⁴^،¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸^،¹⁹^،²⁰. على سبيل المثال ، تظهر البنية الوعائية التي لوحظت في سيقان وأوراق النبات تشابها مذهلا مع التركيب الموجود في الأنسجة الحيوانية¹⁹. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تشكيل سقالات السليلوز المشتقة من النباتات بسهولة وتعريضها لتعديلات كيميائية حيوية سطحية لتحقيق الخصائص المطلوبة¹⁶. في دراسة حديثة ، قمنا بدمج مخزن مؤقت للملح أثناء عملية إزالة الخلايا ، مما أدى إلى تعزيز ارتباط الخلية الذي لوحظ في كل من الإعدادات في المختبر وفي الجسم الحي ¹⁶. في نفس الدراسة ، أظهرنا قابلية تطبيق سقالات السليلوز المشتقة من النباتات في المواد الحيوية المركبة عن طريق صب الهلاميات المائية على سطح السقالات. في الدراسات الحديثة ، ثبت أن تشغيل السقالات المشتقة من النباتات يعزز فعاليتها¹⁸. على سبيل المثال ، كشفت دراسة أجراها Fontana et al. (2017) أن التصاق الخلايا الليفية الجلدية البشرية كان مدعوما بسيقان منزوعة الخلايا مغلفة ب RGD ، في حين أن السيقان غير المطلية لم تظهر نفس القدرة¹⁸. علاوة على ذلك ، أظهر المؤلفون أيضا أنه يمكن استخدام سائل الجسم المحاكي المعدل لتمعدن سيقان النباتات منزوعة الخلايا بشكل مصطنع. في دراسات أحدث ، استكشفنا مفهوم تكوين العظم الحساس ميكانيكيا في سقالات السليلوز المشتقة من النباتات وقيمنا إمكاناتها ل BTE¹⁷^،²⁰. علاوة على ذلك ، استخدم Lee et al. (2019) سقالات مشتقة من النباتات لزراعة الأنسجة الشبيهة بالعظام في بيئة في المختبر ²¹. من خلال التقييمات الشاملة للمصادر النباتية المختلفة ، حدد المؤلفون السقالات المشتقة من التفاح باعتبارها الأكثر مثالية لثقافة وتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). علاوة على ذلك ، اقترح المؤلفون أن السمات الهيكلية والميكانيكية للسقالات المشتقة من التفاح تلعب دورا محوريا في ملاءمتها للغرض المقصود. نظرا لكونها السقالات الأولية المشتقة من النباتات التي تم تنفيذها في تطبيقات هندسة الأنسجة ، فقد ثبت على نطاق واسع أن السقالات المشتقة من التفاح تمتلك بنية مشابهة بشكل لافت للنظر لتلك الموجودة في العظام البشرية ، لا سيما من حيث مسامها المترابطة التي يتراوح قطرها من 100 إلى 200 ميكرومتر^14,21.

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق بشكل أكبر في إمكانات سقالات السليلوز المشتقة من التفاح ل BTE وأجرينا تحليلا لخصائصها الميكانيكية في كل من المختبر والجسم الحي. على الرغم من وجود دراسات حول إمكانات السقالات المشتقة من التفاح ل BTE¹⁷^،²⁰^،²¹ ، إلا أن خصائصها الميكانيكية لم يتم التحقيق فيها بشكل كاف. أظهرت النتائج غزو الانتشار البري والتمايز العظمي لبانيات MC3T3-E1 preosteoblasts المصنفة في سقالات تم استزراعها في وسط التمايز لمدة 4 أسابيع. كان معامل يونغ لهذه السقالات 192.0 ± 16.6 كيلو باسكال ، وهو أعلى بكثير من تلك الموجودة في السقالات الفارغة (سقالات بدون خلايا مصنفة) (31.6 ± 4.8 كيلو باسكال) والسقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط غير متمايز (24.1 ± 8.8 كيلو باسكال). ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن معامل يونغ للأنسجة العظمية البشرية السليمة يقع عادة في نطاق 0.1-2 GPa للعظام التربيقية وحوالي 15-20 GPa للعظام القشرية⁸. ومع ذلك ، بعد زرع لمدة 8 أسابيع في عيب كالفاري القوارض ، بدا أن السقالات المصنفة بالخلايا مدمجة جيدا في العظام المحيطة ، كما يتضح من متوسط قوة الذروة البالغة 113.6 نيوتن ± 18.2 نيوتن في اختبارات الدفع ، وهو مشابه لحمل الكسر المبلغ عنه سابقا لعظم الجلفاري الأصلي²². بشكل عام ، تظهر النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الدراسة وعدا كبيرا ، خاصة بالنسبة للتطبيقات غير الحاملة. ومع ذلك ، لا تمتلك سقالات السليلوز المشتقة من التفاح حاليا الخصائص الميكانيكية اللازمة لمطابقة الأنسجة العظمية المحيطة بدقة في موقع الزرع. وبالتالي ، هناك حاجة إلى مزيد من التطوير لإطلاق العنان للإمكانات الكاملة لهذه السقالات.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة البروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية بجامعة أوتاوا.

1. إعداد سقالة

استخدم قطاعة المندولين لتقطيع تفاح ماكنتوش (كندا فانسي) إلى شرائح بسمك 8 مم. قطع أنسجة hypanthium من شرائح التفاح إلى مربعات 5 مم × 5 مم.
ضع العينات المربعة في 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) لمدة يومين.
اغسل العينات منزوعة الخلايا بالماء منزوع الأيونات واحتضانها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT) في 100 mM CaCl₂ لإزالة الفاعل بالسطح المتبقي.
تعقيم العينات (أي السقالات) في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة ، وغسلها بالماء منزوع الأيونات ، ووضعها في طبق استزراع 24 بئرا قبل بذر الخلايا.

2. زراعة الخلايا وبذر السقالة

الحفاظ على MC3T3-E1 Subclone 4 خلايا في أطباق معالجة بزراعة الخلايا بقطر 10 سم في ظروف زراعة الخلايا (37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 95٪ هواء و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂).
تحضير وسط زراعة الخلايا المصنوع من الحد الأدنى من الوسط الأساسي للنسر - تعديل ألفا (α-MEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
فصل الخلايا عن أطباق الاستزراع عن طريق التربسين (0.05٪ تربسين-EDTA) بمجرد وصولها إلى التقاء 80٪.
جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند c.a. 200 × g لمدة 3 دقائق. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في α-MEM عند 2.5 × 10⁷ خلايا لكل مل.
ماصة 40 ميكرولتر من تعليق الخلية على سطح السقالات ، والسماح للخلايا الالتصاق لمدة 1 ساعة في ظروف زراعة الخلايا. بعد ذلك ، أضف 2 مل من وسط الاستزراع إلى كل بئر استزراع في لوحة الاستزراع.
قم بتجديد وسط الثقافة كل 2-3 أيام لمدة 14 يوما.
قم بإعداد وسط تمايز بإضافة 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك و 4 مللي مول من فوسفات الصوديوم إلى وسط زراعة الخلايا الموصوف سابقا.
تحفيز تمايز خلايا MC3T3-E1 عن طريق احتضان السقالات في وسط التمايز لمدة 4 أسابيع. تجديد الوسيط كل 3-4 أيام. في موازاة ذلك ، احتضان السقالات في وسط ثقافة غير متمايز (أي وسط بدون مكملات للحث على التمايز) لنفس المدة ، مع نفس جدول التغيير المتوسط ليكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.

3. قياسات حجم المسام باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر

اغسل السقالات المشتقة من التفاح منزوع الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
احتضان السقالات في 1 مل من 10٪ (v / v) صبغة بيضاء من الكالكوفلور لمدة 25 دقيقة في الظلام في RT.
اغسل السقالات (ن = 3) باستخدام PBS وقم بتصوير ثلاث مناطق تم اختيارها عشوائيا لكل سقالة باستخدام مجهر مسح ليزر رنين عالي السرعة (CLSM) بتكبير 10x ، باستخدام قناة DAPI ، على النحو التالي:
1. تكوين مرشح انبعاث الليزر: 405 نانومتر (ليزر) ؛ 425-475 نانومتر (انبعاثات)
2. اضبط طاقة الليزر والكاشف يدويا لضمان الحصول على الصورة الأمثل. احصل على مجموعة z من 20 صورة بحجم خطوة 5 ميكرومتر.
باستخدام برنامج ImageJ ، قم بمعالجة وتحليل الصور متحدة البؤر على النحو التالي:
1. استخدم وظيفة Z-Project إلى أقصى كثافة لإنشاء صورة ، وقم بتطبيق وظيفة البحث عن الحواف لإبراز حافة المسام.
2. تتبع المسام يدويا باستخدام أداة التحديد الحر .
3. تناسب كل مسام كقطع ناقص ، وقم بقياس طول المحور الرئيسي ، وقم بتجميع جميع القياسات (ما مجموعه 54 في الدراسة الحالية - 6 في 3 مناطق مختارة عشوائيا لكل سقالة) ، واحسب متوسط الطول.

4. تحليل توزيع الخلايا باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر

اغسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. ثبت السقالات بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق.
اغسل كل سقالة جيدا بالماء منزوع الأيونات ، وتخلل الخلايا بمحلول Triton-X 100 لمدة 5 دقائق ، واغسلها مرة أخرى باستخدام برنامج تلفزيوني.
احتضان السقالات في 1 مل من حمض دوري 1٪ لمدة 40 دقيقة واشطفها بالماء منزوع الأيونات^14,16.
احتضان السقالات في 1 مل من محلول يحتوي على 100 mM ميتابيسلفيت الصوديوم و 0.15 M حمض الهيدروكلوريك ، مع استكمال 100 ميكروغرام / مل يوديد البروبيديوم. اغمر السقالات تماما في المحلول.
اغسل السقالات باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بتلطيخ نوى الخلية عن طريق احتضان السقالات في محلول DAPI سعة 5 مجم / مل لمدة 10 دقائق في الظلام. اغسل جيدا مرة أخرى وقم بتخزين السقالات في برنامج تلفزيوني قبل التصوير.
تخيل ثلاثة أسطح مختارة عشوائيا لثلاث سقالات مختلفة مصنفة بالخلايا مع CLSM رنين عالي السرعة عند تكبير 10x ، باستخدام قنوات DAPI و TRITC ، على النحو التالي:
1. تكوين مرشح انبعاث الليزر:
  DAPI: الليزر: 405 نانومتر. الانبعاثات: 425-475 نانومتر
  TRITC: الليزر: 561 نانومتر. الانبعاثات: 570-620 نانومتر
2. اضبط طاقة الليزر والكاشف يدويا لضمان الحصول على الصورة الأمثل. احصل على مجموعة z من 20 صورة بحجم خطوة 5 ميكرومتر.
استخدم برنامج ImageJ لمعالجة الصور متحدة البؤر وإنشاء أقصى إسقاط في المحور z لتحليل الصور باستخدام وظيفة Z-Project to Maximum Intensity .

5. تحليل الفوسفاتيز القلوي

اغسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. ثبت السقالات بالفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة. إصلاح السقالات الفارغة (السقالات بدون خلايا مصنفة) لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.
تحضير محلول تلطيخ 5-برومو-4-كلورو-3'-إندوليفوسفات ونيترو-بلو تيترازوليوم (BCIP/NBT) عن طريق إذابة قرص واحد من BCIP/NBT في 10 مل من الماء منزوع الأيونات.
اغسل السقالات الثابتة بمحلول توين 0.05٪ وصمة عار بمحلول BCIP / NBT لمدة 20 دقيقة في RT. اغسل السقالات الملطخة بمحلول توين 0.05٪ وقم بتخزينها في برنامج تلفزيوني قبل التصوير.
تخيل السقالات الملطخة بكاميرا رقمية بدقة 12 ميجابكسل.

6. تحليل ترسب الكالسيوم

اغسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. ثبت السقالات بالفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة. إصلاح السقالات الفارغة (السقالات بدون خلايا مصنفة) لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.
قم بإعداد محلول تلطيخ 2٪ (وزن / حجم) أحمر أليزارين (ARS).
اغسل السقالات الثابتة بالماء منزوع الأيونات وقم بتلطيخها بمحلول ARS لمدة 1 ساعة في RT. اغسل السقالات الملطخة بالماء منزوع الأيونات وقم بتخزينها في برنامج تلفزيوني قبل التصوير.
تخيل السقالات الملطخة بكاميرا رقمية بدقة 12 ميجابكسل.

7. تحليل التمعدن

اغسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. إصلاح السقالات مع 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة. إصلاح السقالات الفارغة (السقالات بدون خلايا مصنفة) لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.
تجفيف العينات في المحاليل التي تحتوي على تركيزات من الإيثانول تزيد من 50٪ إلى 100٪ ، كما هو موضح سابقا²³.
إجراء المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والتحليل الطيفي المشتت للطاقة (EDS) لتحليل المجاميع المعدنية على النحو التالي:
1. جفف العينات باستخدام مجفف النقطة الحرجة ، باتباع بروتوكول^{الشركة المصنعة 24}.
2. ضع طبقة ذهبية 5 نانومتر على السقالات باستخدام طلاء رش الذهب ، وفقا لبروتوكول^{الشركة المصنعة 25}.
3. تخيل سطح السقالات باستخدام مجهر إلكتروني ماسح مضبوط على 3 كيلو فولت ، عند تكبير 85x.
4. قم بإجراء EDS عن طريق ضبط المجهر الإلكتروني الماسح على 15 كيلو فولت. في ثلاث مناطق تم اختيارها عشوائيا لكل سقالة ، احصل على أطياف EDS لتحليل تكوين الركام المعدني.

8. قياسات معامل يونغ

قم بإزالة السقالات المصنفة بالخلايا من وسط الحضانة الخاص بها واختبر العينات على الفور.
باستخدام جهاز ضغط أحادي المحور مصمم خصيصا ومجهز بخلية تحميل 1.5 نيوتن ، قم بضغط السقالات (n = 3 لكل حالة) بمعدل ثابت يبلغ 3 مم · ^min-1 إلى أقصى إجهاد ضاغط بنسبة 10٪ من ارتفاع السقالة.
أوجد معامل يونغ من ميل الجزء الخطي من منحنيات إجهاد الانفعال. في الدراسة الحالية ، تم تحديد المعامل بين سلالة 9٪ و 10٪.

9. تسلل الخلايا وتحليل التمعدن عن طريق الأنسجة: سقالات في المختبر

اغسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
ثبت السقالات المصنفة بالخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة قبل إعادة التعليق في 70٪ من الإيثانول للتخزين.
علم الأنسجة:
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إجراء التحضير النسيجي بأكمله (التضمين والتقسيم والتلطيخ) الموصوف في الخطوات التالية بواسطة مرفق لويز بيليتييه الأساسي للأنسجة (جامعة أوتاوا).
1. بعد الجفاف والتضمين في البارافين ، قم بتقطيع العينات إلى أقسام تسلسلية بسمك 5 ميكرومتر ، بدءا من 1 مم داخل السقالات ، وقم بتركيب الأقسام على شرائح المجهر.
2. تلطيخ المقاطع ببقع الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) أو فون كوسا (VK).
3. تخيل المقاطع باستخدام مجهر ماسح الشرائح عند تكبير 40x (n = 1 سقالة في وسط عدم التمايز و n = 2 سقالات في وسط التمايز في الدراسة الحالية).
4. باستخدام برنامج ImageJ ، قم بتقييم تسلل الخلايا بصريا (تلطيخ H&E) والتمعدن (تلطيخ VK).

10. نموذج عيب الفئران calvarial

احصل على مراجعة البروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية المحلية.
قم بإعداد سقالات دائرية (قطرها 5 مم وسمك 1 مم) باتباع القسم 1 الموضح أعلاه واستخدام لكمة خزعة 5 مم.
إجراء حج القحف الثنائي باتباع البروتوكول^{المعمول به 26} ، على النحو التالي:
1. تخدير ذكور الفئران Sprague-Dawley باستخدام isoflurane ، أولا بنسبة 3٪ حتى تصبح فاقدة للوعي ، ثم بنسبة 2-3٪ طوال العملية.
2. كشف السمحاق والجمجمة عن طريق قطع الجلد المغطي باستخدام شفرة مشرط. إزالة السمحاق.
3. قم بإنشاء عيوب ثنائية في كل من العظام الجدارية على كل جانب من الخيط السهمي باستخدام مثقاب أسنان مجهز بتريفين بقطر 5 مم تحت ري مستمر بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
4. نظف العظام المحيطة باستخدام 0.9٪ كلوريد الصوديوم لإزالة أي شظايا عظمية.
5. ضع السقالات الدائرية منزوعة الخلايا في العيوب.
6. أغلق الجلد المغطي بخيوط 4-0.
امنح الفئران وصولا غير محدود إلى الطعام والماء وراقبها يوميا.
بعد 8 أسابيع بعد الزرع ، القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق CO₂ وانثقاب الصدر كإجراء ثانوي للقتل الرحيم.
لكشف الجمجمة واستعادة الغرسات ، قم بإزالة الجلد الذي يغطي الجمجمة باستخدام شفرة مشرط.
قطع الجمجمة في العظام الأمامية والقذالية وعلى جانب كل من العظام الجدارية باستخدام مثقاب الأسنان لإزالة الجزء العلوي من الجمجمة تماما.

11. اختبار الدفع للخارج

قم بتوصيل جهاز ضغط أحادي المحور (مع خلية تحميل 445 نيوتن) بوحدة الحصول على بيانات USB.
قم بتوصيل وحدة الحصول على البيانات بجهاز كمبيوتر مزود بتطبيق برنامج الحصول على البيانات.
مباشرة بعد استخراج الجمجمة ، ضع كل عينة (ن = 7 غرسات من 4 في الدراسة الحالية) على حامل العينة لجهاز الضغط أحادي المحور بحيث يكون الجانب الظهري من العظم متجها لأعلى.
اخفض المكبس بمعدل 0.5 مم / دقيقة حتى تلمس الغرسة المستخرجة قليلا.
ابدأ الاختبار عن طريق خفض المكبس من خلال الغرسة حتى الدفع الكامل للخارج أثناء تطبيق الضغط بسرعة ثابتة تبلغ 0.5 مم / دقيقة باستخدام برنامج الحصول على البيانات.
سجل قوة الذروة على منحنى القوة مقابل الإزاحة باستخدام برنامج الحصول على البيانات.

12. تسلل الخلايا وتحليل التمعدن بواسطة الأنسجة: سقالات في الجسم الحي

ثبت الكالفاريا المستخرجة والغرسات في 10٪ فورمالين محايد مخزن لمدة 72 ساعة قبل إعادة التعليق في 70٪ إيثانول للتخزين.
علم الأنسجة:
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إجراء جميع الاستعدادات النسيجية (التضمين والتقسيم والتلطيخ) الموصوفة في الخطوات التالية بواسطة Accel Labs (مونتريال ، كيو سي ، كندا).
1. قطع العينات (المضمنة في ميثيل ميثاكريلات) إلى أقسام بسمك 6 ميكرومتر على ثلاثة مستويات مختلفة (أعلى وأسفل ونحو المركز) وقم بتركيبها على شرائح مجهرية.
2. قم بتلطيخ الأقسام إما باستخدام H&E أو ثلاثية الألوان من Masson-Goldner (MGT).
تخيل الأقسام باستخدام مجهر ماسح الشرائح عند تكبير 40x (4 نباتات من 2 في الدراسة الحالية).
باستخدام برنامج ImageJ ، قم بتقييم تسلل الخلايا بصريا (تلطيخ H&E) وترسب الكولاجين (تلطيخ MGT).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس حجم المسام وتوزيع الخلايا والتمعدن في المختبر (الشكل 1 والشكل 2)
تم تحقيق الإزالة الكاملة للمكونات الخلوية الأصلية لسقالات أنسجة التفاح بعد معالجة السقالات باستخدام SDS و CaCl₂ (الشكل 1 أ). أظهرت السقالات بنية مسامية للغاية ، والتي تم تأكيدها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. أظهر القياس الكمي للصور متوسط حجم المسام 154 ميكرومتر ± 40 ميكرومتر. تراوح توزيع حجم المسام بين 73 ميكرومتر و 288 ميكرومتر. ومع ذلك ، تراوحت غالبية المسام بين 100 ميكرومتر و 200 ميكرومتر (الشكل 1C).

بعد فترة استزراع لمدة 4 أسابيع في وسط التمايز ، أظهرت السقالات المصنفة بالخلايا رواسب معدنية بيضاء واسعة الانتشار (الشكل 1 أ). أظهرت السقالات التي تحتوي على خلايا لونا أبيض معتما ، مما يشير إلى التمعدن ، والذي لم يلاحظ في السقالات الفارغة (سقالات بدون خلايا مصنفة). علاوة على ذلك ، كشف التحليل باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر عن توزيع متجانس للخلايا داخل السقالات (الشكل 1 ب).

تم تلطيخ السقالات المصنفة أم لا بالخلايا باستخدام BCIP / NBT و ARS لتحليل نشاط ALP والتمعدن ، على التوالي (الشكل 1 د). كشف تلطيخ BCIP / NBT عن زيادة كبيرة في نشاط ALP (يصور باللون الأرجواني القوي) داخل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط التمايز ، على عكس السقالات الفارغة أو السقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط غير تمايز. وبالمثل ، أظهرت السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط التمايز لونا أحمر أكثر كثافة عند تلطيخها باستخدام ARS ، مما يشير إلى تمعدن أكبر مقارنة بالسقالات الفارغة أو السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط غير تمايز. لوحظ تلطيخ الخلفية في السقالات الفارغة ، ربما بسبب وجود CaCl₂ في بروتوكول إزالة الخلايا.

تم إجراء التلوين (H&E و VK) على السقالات لتحليل تسلل الخلايا والتمعدن ، وتم استخدام SEM و EDS لمزيد من تقييم التمعدن (الشكل 2). أظهر تلطيخ H&E (الشكل 2A) تسلل جيد للخلايا في السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز. كانت نوى متعددة مرئية في المحيط وفي جميع أنحاء السقالات. كما لوحظ وجود الكولاجين في السقالات باللون الوردي الباهت. بالإضافة إلى ذلك ، كشف تلطيخ VK الذي تم إجراؤه على السقالات بعد 4 أسابيع من الاستزراع في وسط التمايز أن جدران المسام كانت ملطخة بينما تم اكتشاف رواسب الكالسيوم فقط على طول الحواف الخارجية لجدران المسام في السقالات المزروعة في وسط غير تمايز وربما نتجت عن امتصاص الكالسيوم أثناء معالجة إزالة الخلايا. لوحظ التمعدن الموضعي على سطح السقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط التمايز لمدة 4 أسابيع بواسطة تحليل SEM (الشكل 2 ب). وبشكل أكثر تحديدا ، لوحظت رواسب معدنية تشبه المجاميع الكروية على محيط المسام. في المقابل ، لم يلاحظ أي مجاميع معدنية على السقالات الفارغة أو السقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة لمدة 4 أسابيع في وسط غير متمايز. لوحظت قمم مميزة مميزة تتوافق مع الفوسفور (P) والكالسيوم (Ca) في أطياف EDS للمناطق المختارة ذات الأهمية ، وتحديدا على الرواسب المعدنية التي لوحظت على السقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة لمدة 4 أسابيع في وسط التمايز (الشكل 2B).

التحليل الميكانيكي الحيوي في المختبر (الشكل 3)
تم قياس معامل يونغ للسقالات المصنفة بالخلايا بعد 4 أسابيع من الاستزراع إما في وسط عدم التمايز أو التمايز (ن = 3 لكل حالة تجريبية). تمت مقارنته بمعامل يونغ للسقالات الفارغة (سقالات بدون خلايا مصنفة) (الشكل 3). ولم يلاحظ فرق يعتد به في المعامل بين السقالات الفارغة (31.6 كيلو باسكال ± 4.8 كيلو باسكال) والسقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط غير متمايز (24.1 كيلو باسكال ± 8.8 كيلو باسكال؛ ع = 0.88). وعلى النقيض من ذلك، لوحظ اختلاف كبير بين معامل السقالات الفارغة (31.6 كيلو باسكال ± 4.8 كيلو باسكال) ومعامل السقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط التمايز (192.0 كيلو باسكال ± 16.6 كيلو باسكال؛ ص < 0.001). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ وجود فرق كبير (p < 0.001) بين معامل يونغ للسقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسائط عدم التمايز والتمايز. يوضح الشكل التكميلي 1 منحنى إجهاد نموذجي لحساب معامل يونغ.

الأداء الميكانيكي الحيوي في الجسم الحي وتجديد العظام (الشكل 4 والشكل 5)
أجريت حج القحف الجراحي على ما مجموعه 6 فئران سبراغ داولي. تم إنشاء عيوب ثنائية قطرها 5 مم في كل من العظام الجدارية للجمجمة باستخدام بر trephine ، وتم زرع سقالات السليلوز المشتقة من التفاح بدون خلايا مصنفة في العيوب القلوية (الشكل 4 أ). بعد 8 أسابيع من الزرع ، تم القتل الرحيم للحيوانات ، وتم جمع الجزء العلوي من جماجمها ومعالجتها إما للاختبار الميكانيكي أو التحليل النسيجي.

بناء على التقييم البصري ، بدت السقالات مدمجة جيدا في الأنسجة المحيطة بالجمجمة. تم إجراء اختبارات الدفع الميكانيكية للخارج لتقييم تكامل السقالات كميا (n = 7) في كالفاريا المضيفة. أجريت القياسات باستخدام جهاز ضغط أحادي المحور (الشكل 4 ب) مباشرة بعد القتل الرحيم للحيوانات. كشفت النتائج أن القوة القصوى كانت 113.6 N ± 18.2 N (الجدول 1).

تم إجراء التحليل النسيجي لتقييم تسلل الخلايا وترسب المصفوفة خارج الخلية داخل السقالات المزروعة (الشكل 5). كشف تلطيخ H&E عن تسلل خلوي داخل مسام السقالة ودليل على الأوعية الدموية ، كما يتضح من وجود الأوعية الدموية داخل السقالات. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تلطيخ MGT وجود الكولاجين داخل السقالات.

figure-results-1
الشكل 1: صور السقالة وتوزيع حجم المسام والتمعدن في المختبر . (أ) صور تمثيلية لسقالة السليلوز المشتقة من التفاح بعد إزالة الخلايا الأصلية والفاعل بالسطح (يسار) وسقالة مصنفة بخلايا MC3T3-E1 بعد 4 أسابيع من المزرعة في وسط تمايز عظمي المنشأ (يمين). يمثل شريط المقياس 2 مم. (B) صور مجهر المسح الضوئي بالليزر التمثيلي متحد البؤر تظهر الخلايا المصنفة في سقالات السليلوز المشتقة من التفاح بعد 4 أسابيع من المزرعة في وسط غير تمايز ("ND") أو وسط تمايز عظمي المنشأ ("D"). يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. تم إجراء تلطيخ على السقالات للسليلوز (الأحمر) باستخدام يوديد البروبيديوم ولنوى الخلية (الأزرق) باستخدام DAPI. (C) توزيع حجم المسام لسقالات السليلوز المشتقة من التفاح ، قبل أن يتم زرعها بخلايا MC3T3-E1 ، من أقصى إسقاطات في المحور z للصور متحدة البؤر. تم إجراء التحليل على ما مجموعه 54 مسام في 3 سقالات مختلفة (6 مسام في 3 مناطق مختارة عشوائيا ذات أهمية لكل سقالة). (د) صور تمثيلية للسقالات الملطخة ب 5-برومو-4-كلورو-3'-إندوليفوسفات ورباعي نيترو أزرق (BCIP/NBT) لتقييم نشاط الفوسفاتيز القلوي (ALP) ومع أليزارين الأحمر S (ARS) لتصور ترسب الكالسيوم، مما يشير إلى التمعدن (شريط المقياس = 2 مم - ينطبق على الجميع). لم تظهر السقالات المصنفة على أنها "فارغة" (سقالات بدون خلايا مصنفة) أي تلطيخ ب BCIP / NBT ، مما يشير إلى عدم وجود نشاط ALP. من ناحية أخرى ، أظهرت السقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط التمايز ("D") نشاطا أعلى ل ALP ، يشار إليه بلون أزرق أكثر كثافة ، مقارنة بالسقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط غير تمايزي ("ND"). بالنسبة لتلطيخ ARS ، أظهرت كل من السقالات الفارغة والسقالات المزروعة في وسط غير تمايزي ("ND") ظلا أفتح من اللون الأحمر مقارنة بالسقالات المستزرعة في وسط التمايز ("D"). تم توضيح وجود ترسب الكالسيوم في السقالات المزروعة في وسط التمايز ("D") من خلال اللون الأحمر الغامق المكثف. تم إجراء كل تحليل على ثلاث سقالات مختلفة (ن = 3). تم تكييف هذا الرقم بإذن من Leblanc Latour (2023)²⁷. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل الأنسجة والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والتحليل الطيفي المشتت للطاقة (EDS) للسقالات في المختبر . (أ) صور تمثيلية للمقاطع العرضية النسيجية العليا للسقالات. تم تقطيع السقالات المدمجة بالبارافين إلى أقسام بسمك 5 ميكرومتر ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) لتصور تسلل الخلايا ، أو باستخدام فون كوسا (VK) لتصور التمعدن داخل السقالات. تم اختراق السقالات بخلايا MC3T3-E1 ، كما يتضح من اللون الأزرق (النوى) والوردي (السيتوبلازم) المرئي في المحيط وفي جميع أنحاء السقالات. كان الكولاجين (وردي شاحب) مرئيا أيضا (أقحم مكبر ل "H &E - D"). لوحظ التمعدن فقط في محيط جدران المسام في السقالات المستزرعة في وسط غير متمايز ("ND"). كانت جدران المسام في السقالات المزروعة في وسط التمايز ("D") ملطخة بالكامل باللون الأسود. تم إجراء التحليل على سقالة واحدة مستزرعة في وسط غير تمايزي ("ND") وعلى سقالتين مستزرعتين في وسط التمايز ("D") (شريط المقياس لصور التكبير السفلي = 1 مم ، شريط المقياس لصور التكبير الأعلى = 50 ميكرومتر). (ب) الصور المجهرية التمثيلية التي تم الحصول عليها بواسطة SEM وكذلك أطياف EDS. خضعت السقالات لطلاء الرش بالذهب وتم تصويرها باستخدام مجهر إلكتروني ماسح للانبعاث الميداني بجهد 3.0 كيلو فولت (شريط المقياس = 100 ميكرومتر - ينطبق على الجميع). تم الحصول على أطياف EDS على كل سقالة. يشار إلى قمم الفوسفور (2.013 كيلو فولت) والكالسيوم (3.69 كيلو فولت) في كل طيف EDS. تم إجراء كل من SEM و EDS على ثلاث سقالات مختلفة. فارغة: سقالات بدون خلايا مصنفة. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Leblanc Latour (2023)²⁷. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: وحدات يونغ للسقالات في المختبر بعد 4 أسابيع من الاستزراع إما في وسط عدم التمايز ("ND") أو وسط التمايز ("D"). يتم تقديم البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM) لثلاث عينات مكررة لكل حالة. تم تحديد الدلالة الإحصائية (* تشير إلى p<0.05) باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) واختبار Tukey البعدي. فارغة: سقالات بدون خلايا مصنفة. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Leblanc Latour (2023)²⁷. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: صورة سقالة قبل الزرع واختبار الدفع بعد 8 أسابيع من الزرع: (أ) صورة تمثيلية لسقالة قبل الزرع. (ب) جهاز ضغط أحادي المحور يستخدم في اختبارات الدفع للخارج، مع الإشارة إلى خلية الحمل بعلامة النجمة (*) والعينة المشار إليها بسهم. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Leblanc Latour (2023)²⁷. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تحليل الأنسجة للسقالات في المختبر . صور تمثيلية للمقاطع العرضية النسيجية من السقالات غير المصنفة بعد 8 أسابيع من الزرع. تم تلوين المقاطع إما بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) لتصور الخلايا أو ثلاثي الألوان لماسون جولدنر (MGT) لتصور الكولاجين. يشير السهم إلى خلايا الدم الحمراء. وجود الكولاجين مرئي (شريط المقياس = 1 مم و 200 ميكرومتر للحشوات اليسرى واليمنى ، على التوالي). تم تكييف هذا الرقم بإذن من Leblanc Latour (2023)²⁷. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

رقم العينة	قوة الذروة (N)
1	92.8
2	162.7
3	140.3
4	135.7
5	37.7
6	157.8
7	67.9
دني	113.6
سيم	18.2

الجدول 1: قوة الذروة المقاسة من اختبارات الدفع.

الشكل التكميلي 1: منحنى الإجهاد والانفعال النموذجي لحساب معامل يونغ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت العديد من الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي التوافق الحيوي للسليلوز المشتق من النبات واستخدامه المحتمل في هندسة الأنسجة¹⁴^،¹⁵^،¹⁶^،¹⁸^،¹⁹^،²⁰ ، وبشكل أكثر تحديدا لاستضافة التمايز العظمي^20,21. كانت أهداف الدراسة الحالية هي إجراء مزيد من التحقيق في إمكانات سقالات السليلوز المشتقة من التفاح ل BTE وتقييم الخواص الميكانيكية لهذه السقالات في كل من المختبر والجسم الحي.

بالنسبة للدراسات المختبرية ، تم زرع خلايا ما قبل بانيات العظم (MC3T3-E1) في السقالات بعد القضاء على الخلايا الأصلية من أنسجة التفاح. تستخدم خلايا MC3T3-E1 بشكل شائع للتحقيق في التمعدن الحيوي للمصفوفة خارج الخلية²⁸^،²⁹^،³⁰. ثم تم استزراع السقالات لمدة 4 أسابيع في التمايز العظمي أو وسط عدم التمايز. أشارت النتائج إلى أن الخلايا تكاثرت وخضعت للتمايز داخل السقالات ، خاصة عند زراعتها في وسط التمايز ، مما يسلط الضوء على إمكانات سقالات السليلوز المشتقة من التفاح لدعم تطور أنسجة العظام. لوحظت نوى الخلايا بأعداد كبيرة في مسام السقالة ، مما يؤكد الملاحظات الواردة في الدراسات السابقة¹⁴^،¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،²⁰^،²¹. علاوة على ذلك ، على غرار النتائج السابقة التي توصلنا إليها¹⁴ وتلك الخاصة بالمجموعة²¹ الأخرى ، كان متوسط قطر مسام السقالة ~ 154 ميكرومتر ، مع معظم المسام بأقطار تتراوح بين 100 ميكرومتر و 200 ميكرومتر (الشكل 1C). تتفق هذه الأبعاد مع نطاق حجم المسام المثالي (100-200 ميكرومتر) المعروف بتسهيل نمو العظام⁷.

أظهر تحليل التلوين نشاطا أعلى ل ALP بعد فترة استزراع مدتها 4 أسابيع في وسط التمايز. لوحظ المزيد من رواسب الكالسيوم على سطح السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط التمايز مقارنة بكل من السقالات الفارغة والسقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط غير تمايز. وقد لوحظت نتائج مماثلة مع hiPSCs متباينة في السقالات المشتقة من التفاح²¹. في حين تم تقييم وجود ALP نوعيا في هذه الدراسة ، يمكن إجراء فحوصات إضافية للتحليل الكمي. أكد التقييم النسيجي للسقالات كذلك أن بانيات العظم المتسللة قامت بتمعدن السقالات بعد التمايز. والجدير بالذكر أن محيط التركيبات المستزرعة في وسط غير متمايز كان ملطخا أيضا ب VK. قد يكون CaCl₂ المتبقي في السقالات قد تسبب في هذا التلوين غير المحدد الذي لوحظ في المحيط بعد إزالة الخلايا. تم إجراء تحليل نوعي لصور SEM لمواصلة تقييم التمعدن. بعد الاستزراع في وسط التمايز ، أظهرت السقالات المصنفة بالخلايا علامات تمعدن ECM. كانت الركام المعدنية مرئية على سطح السقالة ، وتحديدا عند حواف المسام. تتوافق هذه الملاحظات مع الدراسات السابقة باستخدام ECM³⁰ والسقالات المشتقة من النباتات²¹. كانت هذه المجاميع غائبة على سطح السقالات بدون خلايا مصنفة. كشف تحليل EDS للمجاميع عن وجود مستويات عالية من P و Ca ، مما يشير إلى وجود الأباتيت. وتجدر الإشارة إلى أنه في حين أن البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة يسمح بتصور التسلل الخلوي ووجود التمعدن ، فإنه لا يسمح بتقييم تطورها بمرور الوقت. سيكون التحليل النسيجي في نقاط زمنية متعددة ضروريا لتقييم هذا التقدم بشكل كامل. بالإضافة إلى ذلك ، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التحليل لتحديد كمية التسلل الخلوي والتمعدن على السطح وكذلك في جميع أنحاء السقالة بأكملها. وأخيرا، في حين أن التركيب الأولي للرواسب المعدنية قد حدده نظام EDS، فقد تكون هناك حاجة إلى تقنيات توصيف أخرى، مثل حيود الأشعة السينية (XRD)، لتوفير معلومات عن البنية البلورية للرواسب المرصودة.

كان معامل يونغ للسقالات أعلى بكثير بعد الاستزراع في وسط التمايز (بحوالي 8 أضعاف). في المقابل ، كان معامل السقالات المستزرعة في وسط غير متمايز يشبه معامل السقالات الفارغة (سقالات بدون خلايا مصنفة) ، على غرار النتائج التي تم الإبلاغ عنها في دراسة سابقة مع السقالات المشتقة من التفاح²⁰. على الرغم من ارتفاع معامل يونغ للسقالات المستزرعة في وسط التمايز ، إلا أنه ظل أقل بكثير من معامل العظام الطبيعية (0.1 إلى 2 جيجا باسكال للعظم التربيقي و 15 إلى 20 جيجا باسكال للعظام القشرية) ⁸ ، والطعم الخيفي الملغي (3.78 جيجا باسكال) ³¹ ، والطعوم البلاستيكية المصنوعة من بولي إيثر إيثر كيتون (3.84 جيجا باسكال) ³¹ ، والتيتانيوم (50.20 جيجا باسكال) ³¹ ، وسبائك الكوبالت والكروم (53.15 جيجا باسكال) ³¹ يزرع. لذلك ، قد لا تكون السقالات في تركيبتها الحالية مناسبة للتطبيقات الحاملة. وتجدر الإشارة إلى أن معامل يونغ يوفر معلومات عن صلابة المادة. ومع ذلك ، يمكن أيضا اعتبار قوة الخضوع لتوفير فهم أوسع للخصائص الميكانيكية للسقالة.

ثم تم زرع سقالات التفاح منزوعة الخلايا في عيوب كلفارية ثنائية ذات حجم حرج 5 مم في الفئران (ن = 6). أشارت اختبارات الدفع (على 7 نباتات) ، التي أجريت لتقييم تكامل السقالات داخل كالفاريا المضيفة ، إلى أن متوسط قوة الذروة كان 113.6 نيوتن ± 18.2 نيوتن ، وهو مشابه لحمل الكسر الذي تم الإبلاغ عنه سابقا للعظم الكالفاري (127.1 ± 9.6 نيوتن)²² ، مما يشير إلى أن السقالات مدمجة جيدا في الأنسجة العظمية المحيطة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن اختبار الدفع للخارج يوفر فقط معلومات عن الواجهة بين السقالة والأنسجة المحيطة. جمعت الدراسات السابقة بين اختبارات الدفع واختبارات المسافة البادئة لتوفير فهم أوسع للخصائص الميكانيكية لواجهة زرع العظام والسقالة نفسها²². بالإضافة إلى ذلك ، تكون العيوب الثنائية أكثر عرضة للاختلال مع المكبس³². يمكن أن يؤدي الوضع المناسب لزرع الجمجمة أو نموذج عيب واحد أو نظام تثبيت إضافي على جهاز الاختبار العالمي إلى تجنب اختلال^{المحاذاة 32}.

باختصار ، أكدت هذه الدراسة أن سقالات السليلوز المشتقة من التفاح يمكن أن تعزز التصاق وانتشار الأرومة العظمية. بالإضافة إلى ذلك ، حدث التمعدن داخل السقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط التمايز ، مما أدى إلى زيادة معامل سقالة يونغ. ومع ذلك ، ظل المعامل أقل بكثير من العظم الطبيعي. ومن المثير للاهتمام ، أن القوة اللازمة لإزاحة سقالات السليلوز المزروعة المشتقة من التفاح كانت مماثلة لحمل الكسر لعظم الجلفاري وأنواع أخرى من السقالات المستخدمة سابقا في BTE²². أخيرا ، على غرار النتائج الموضحة في التقارير السابقة ، تسللت الخلايا إلى السقالات المزروعة وترسبت الكولاجين. بشكل عام ، توضح هذه الدراسة إمكانات سقالات السليلوز المشتقة من النباتات لتطبيقات BTE. تتفق هذه النتائج مع دراسة سابقة أجرتها مجموعة بحثية مختلفة ، مما يثبت بشكل أكبر ملاءمة سقالات السليلوز المشتقة من النباتات لأغراض^{BTE 21}. ومع ذلك ، فإن التباين في صلابة السقالات مقارنة بالعظام التربيقية أو القشرية يسلط الضوء على أهمية تطوير المواد الحيوية المركبة التي يمكن أن تتطابق بشكل أوثق مع الخصائص الميكانيكية للعظام الطبيعية. لذلك، على الرغم من الاهتمام المتزايد باستخدام السقالات المشتقة من النباتات لأغراض التعليم والتدريب المهني، قد يظل استخدامها مقصورا على التطبيقات غير الحاملة. كما أوضحنا سابقا¹⁶ ، قد تكون إعادة هندسة سقالات السليلوز المشتقة من النباتات عن طريق التعديل الكيميائي أو تطوير المركبات مع البوليمرات البيولوجية / الاصطناعية الأخرى ضرورية للتطبيقات الحاملة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان تضارب المصالح: M.L.L، M.T. R.J.H.، C.M.C.، I.C. و A.P. هم مخترعون في طلبات براءات الاختراع المقدمة من جامعة أوتاوا وشركة Spiderwort Inc. فيما يتعلق باستخدام السليلوز المشتق من النباتات لتطبيقات BTE. M.L.L. ، R.J.H. ، C.M.C. ، و AP لديهم مصالح مالية في Spiderwort Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) (منحة الاكتشاف) ومؤسسة لي كا شينغ. تلقى MLL الدعم من برنامج TalentEdge لمراكز التميز في أونتاريو ، وتم دعم RJH من خلال منحة NSERC للدراسات العليا ومنحة أونتاريو للدراسات العليا (OGS).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
4 & prime ؛ 6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
حمض الأسكوربيك	Sigma-Aldrich	A4403	ثقافة الخلية
كلوريد الكالسيوم	ThermoFisher	AA12316	CaCl_{2< / sub>}
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
أداة جراحة	لحفر
الإيثانول	ثيرموفيشر	615095000
مصل الأبقار الجنيني	مختبرات هيكلون	SH30396	FBS
الفورمالين	سيجما ألدريتش	HT501128	10٪ فورمالين
جولدنر ثلاثي	صبغة سيجما ألدريتش	1.00485	جي تي سي
هيماتوكسيلين وصمة عار اليوزين	فيشر NC1470670 العلمية		H& E
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر عالي السرعة	نيكون	نيكون Ti-E A1-R
حمض الهيدروكلوريك	Sigma-Aldrich	258148
برنامج ImageJ	المعاهد الوطنية للصحة
الري الملحي	باكستر	JF7123	0.9٪ كلوريد الصوديوم
MC3T3-E1 استنساخ فرعي 4 خلايا	ATCC	CRL-2593	خلايا ما قبل بانيات العظم
تفاح			ماكنتوش كندا يتوهم الصف
ميثيل ميثاكريليت	سيجما ألدريتش	M55909	التضمين النسيجي
الحد الأدنى من المتوسط الأساسي	ThermoFisher	M0894	& alpha ؛ -MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4٪ ؛ مختبرات PFA
Penicillin / Streptomycin	Hyclone	SV30010	زراعة الخلايا
الحمض الدوري	Sigma-Aldrich	375810
مختبرات هيكلون	المالحة المخزنة بالفوسفات	2810305	PBS ؛ بدون Ca^{2 + < / sup> و Mg^{2 + < / sup>}}
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
المسح الضوئي المجهر الإلكتروني	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM و EDS
الماسح الضوئي للشرائح	مجهر Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
كبريتات دوديسيل الصوديوم	فيشر Scientific	BP166	SDS
ميتابيسلفيت الصوديوم	سيجما ألدريتش	31448
فوسفات الصوديوم	ThermoFisher	BP329
فئران Sprague-Dawley	مختبرات تشارلز ريفر	400
خيوط	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5 مم
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
مختبرات التربسين	Hyclone	SH30236.02	ثقافة الخلايا
Tween	Fisher Scientific	BP337
جهاز ضغط عالمي	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	علم الأنسجة

الأسنان الألوان ذكر قطر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835(2014).
Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894(2016).
Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415(2023).
Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225(2017).
Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030(2022).
Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194(2019).
Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
tousimis Critical Point Dryers - Samdri®-PVT-3D. , https://tousimis.com/critical_point_dryers/detail.html?Pid=8755B (2022).
Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-ace200/ (2023).
Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
Leblanc Latour, M. Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , Department of Physics, Faculty of Science, University of Ottawa, Ottawa, Canada. (2023).
Kodama, H. -A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

سقالات مشتقة من التفاح منزوعة الخلايا لهندسة أنسجة العظام في المختبر وفي الجسم الحي

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles